相关申请的交叉引用根据35u.s.c.§119(e)，本申请要求2017年8月8日提交的美国临时专利申请no.62/542,600的优先权和权益。该申请的全部教导通过引用并入此处。政府资助支持该申请的研究由美国进行，由美国卫生和公共服务部部长代表。本说明书提供了抑制由hiv-1逆转录酶(rt)进行的核酸扩增的组合物和方法。
背景技术：
：：dna聚合酶在基因组复制和修复过程中合成dna。因此，它们是用于不受控制的细胞生长(例如，癌症和病毒感染)的化学疗法中有吸引力的靶标。至少有17种人类dna聚合酶，它们利用常见的核苷酸转移酶反应，其中脱氧核苷三磷酸(dntp)以模板依赖性方式添加到生长中的dna引物3'末端。该反应需要至少两个二价金属离子，以促进引物3'-氧阴离子内联亲核攻击引入的dntp的pα，导致引物链延伸一个核苷酸(即dnmp)和焦磷酸盐(pyrophosphate,ppi)。该反应是可逆的，因此在称为焦磷酸解的过程中，ppi和dna可以生成dntp和短一个核苷酸的dna引物链。尽管有意地偏好进行正向dna合成反应，但焦磷酸解在生物学上可能很重要。链终止性核苷药物经常用于试图阻止dna合成。但是，对链终止剂的抗药性可能与停滞的dna聚合酶通过焦磷酸解去除这些核苷酸的能力有关。另外，焦磷酸解可以去除与某些dna损伤相对的错误插入的核苷酸，作为一种校正活性，从而提高了损伤旁路的保真度。dna聚合酶β(polβ)是一种用于计算机、结构、动力学和生物学研究的模型dna聚合酶。polβ的焦磷酸解活性高度依赖于dna底物的性质。为了在焦磷酸解中产生有效的底物结合，引物3'末端必须结合在核苷酸结合袋中。相反，dna合成则要求引物的末端不要封闭该位点，而位于其边界。这些位点称为n位点(核苷酸；即插入之后和易位之前)和p(引物)位点。结构研究表明，引物末端优先在p位点结合一个核苷酸缺口(gapped)的dna，而优先在n位点结合切口(nicked)dna。在带有带切口的dna的polβ二元复合物晶体中添加ppi–mg2+，会生成稳定的三元产物复合物(pol–dna切口–ppi)。由于逆向反应不利的平衡，pol-dna缺口-dntp复合物的水平将超出结构检测的限度。在这里，我们已经对焦磷酸解进行了动力学表征，并鉴定了一种ppi类似物亚氨二磷酸盐(imidodiphosphate，pnp)，它可以改变内部平衡，从而允许通过延时x射线晶体学进行结构表征。尽管焦磷酸解受非化学步骤的限制，但用亚氨基取代ppi的桥氧会导致限速步骤发生变化，因此pnp依赖性逆向反应受化学作用的限制。这些结果影响了我们对dna聚合酶核苷酸转移酶化学机理的理解，并且关键的酶结构转变会影响功能。有人指出，焦磷酸解在dna聚合酶保真度、和hiv-1逆转录酶以及线粒体dna聚合酶γ对链终止核苷药物的敏感性中发挥作用。一直需要有效的疗法来治疗与不希望的dna复制相关的疾病，例如癌症和病毒感染，例如hiv-1。因此，对逆向反应的更好理解，对于定义影响或调节这些所述活性的总体反应是必不可少的，并且是合理药物设计的前提。技术实现要素：本说明书涉及焦磷酸解的动力学表征和ppi类似物亚氨二磷酸盐(pnp)的鉴定，pnp改变内部平衡，从而允许通过延时x射线晶体学进行结构表征。尽管焦磷酸解受非化学步骤的限制，但用亚氨基取代ppi的桥氧会导致限速步骤发生变化，因此pnp依赖性逆向反应受化学作用的限制。这些结果影响了我们对dna聚合酶核苷酸转移酶化学机理的理解，并且关键的酶结构转变会影响功能。因此，本说明书提供了一种抑制hiv-1逆转录酶(rt)dna合成反应的新方法。通过rt进行的dna合成反应利用脱氧核苷5'-三磷酸(dntp)作为底物，并且像许多其它酶一样，该反应是可逆的。在正向方向上，延长的dna和焦磷酸盐(ppi)是产物；在反向方向上，dntp和缩短的dna是产物。因此，在某些方面，说明书提供了包含焦磷酸盐类似物(例如反应产物ppi的类似物)的组合物和方法。在某些实施方案中，类似物是例如亚氨二磷酸盐(pnp)。发现pnp强烈促进逆向反应，形成含有pnp基团(而非天然ppi基团)的dntp产物。发现该含pnp的dntp是rt正向反应的有效抑制剂。另一个优点是，具有增强的逆向反应的rt抗药性变体将被本文所述的类似物更有效地抑制。在某些方面和实施方案中，说明书提供了包含焦磷酸盐(ppi)类似物(例如pnp)的治疗组合物。在某些实施方案中，组合物包含有效量的焦磷酸盐(ppi)类似物(例如pnp)和药学上可接受的载体。在某些其它方面和实施方案中，本说明书提供了一种治疗或改善疾病或病症的症状的方法，该方法包括向有此需求的患者施用有效量的包含焦磷酸盐(ppi)类似物(例如，pnp)的组合物，其中所述组合物有效治疗或改善疾病或病症的至少一种症状。在某些实施方案中，所述疾病或病症是过度增殖性病症、微生物相关疾病或病症(如细菌或病毒感染)。在某些实施方案中，疾病或病症是癌症或hiv-1感染。前述的通用应用领域仅通过示例的方式给出，并且不意图限于本公开和所附权利要求的范围。根据目前的权利要求、说明书和实施例，本领域的普通技术人员将认识到与本发明的组合物、方法和过程有关的其它目的和优点。例如，可以以多种组合来实施本发明的各个方面和实施方案，本说明书明确涵盖了所有的这些组合。这些额外的优点、目的和实施方案明确地包括在本发明的范围内。用于阐明本发明背景的以及在特定情况下用于提供实践相关附加细节的出版物和其它材料通过引用并入本文。附图说明被并入说明书中并形成说明书一部分的附图，阐述了本发明的几个实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。附图仅出于说明本发明实施方案的目的，并且不应被解释为限制本发明。通过展示本发明示例性实施方案的如下详细描述并结合附图，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见，其中：图1.焦磷酸解的单转化(single-turnover)分析。图(a)显示了用于追踪焦磷酸解的测定的图。带切口的dna底物利用焦磷酸盐(ppi)去除3'-[32p]dcmp(c*)，生成[α-32p]dctp(dctp*)。反应中加入了冷的dctp阱，以防止插入放射性产物，并再生带有未标记的3'末端的带切口的dna。通过薄层色谱法(tlc)监测产物形成(dctp*)。图(b)选择数据点、时间和配体浓度以提供完全覆盖；即分别在低于和高于反应半衰期(≥6个时间点)以及低于和高于配体结合亲和力(≥5个浓度)处，收集多个点。时程拟合至单个指数(灰色线)。图(c)一级速率常数观察值(kobs)依赖性的ppi浓度的二级图。这些数据与双曲线拟合(在线方法(onlinemethods)中的方程(1)，黑色线)以得出krev和kd(补充表1)。图(d)dna聚合酶单核苷酸插入反应的简化动力学方案。化学步骤(k4)的两侧是酶构象变化(k3和k5)。配体结合(k1、k2、k6和k7)存在于一种形式的酶(圈)，该酶经历了非化学构象变化，变成了另一种形式(方形)。这些构象(conf.)状态通常分别描述为聚合酶的开放形式或封闭形式。图2.使用各种ppi类似物进行polβ逆向反应的定性测定。polβ与5'-32p标记的带切口的dna底物在37℃下预孵育5分钟，并与mgcl2和ppi或类似物混合。mgcl2和ppi(类似物)的最终浓度分别为10mm和1mm。完整的凝胶如图13a所示。逆向反应产生的产物比16-mer引物短。凝胶图像上显示了所研究的ppi亚氨二磷酸盐(pnp)和三种双膦酸盐(氯膦酸盐、依替膦酸盐和帕米膦酸盐)的结构。图3.pnp依赖性逆向反应的单转化分析。图(a)显示用于追踪逆向反应的测定图。带切口的dna底物利用pnp去除3'-[32p]dcmp(c*)，生成[α-32p]dcmppnp(dcmppnp*)。反应中加入冷的dctp阱，以防止插入放射性产物，并再生带有未标记的3'末端的带切口的dna。通过tlc监测产物形成(dcmppnp*)。图(b)选择数据点、时间和配体浓度以提供完全覆盖；即分别在低于和高于反应半衰期(≥6个时间点)以及低于和高于配体结合亲和力(≥5个浓度)处，收集多个点。时程拟合至单个指数(灰色线)。图(c)一级速率常数观察值(kobs)依赖性的pnp浓度的二级图。将这些数据拟合至双曲线(方程(1))，以得出krev和kd(补充表1)。图4.通过polβ依赖性逆向反应去除异常引物末端。图(a)如在线方法中所述，将polβ和一个核苷酸缺口的dna与mgcl2和各种链终止核苷酸的三磷酸(ddctp、azttp、aractp或dfdctp)混合。缺口填补反应产生了一个带切口的dna底物。通过添加mgcl2和ppi或pnp引发逆向反应。3分钟后，取出等分试样、淬灭，并在变性凝胶上分析。显示15-mer引物(p)、16-mer末端的带切口的dna底物(ddcmp、aztmp、aracmp或dfdcmp)和逆向反应产物(<16-mer)。完整的凝胶如图13b所示。图(b)将polβ与5'-32p标记的带切口的dna底物以及匹配的(g-c)或错配的(g-a或g-t)引物末端碱基对预孵育，并与mmmgcl2和ppi或pnp混合。显示16-mer底物和逆向反应产物(<16-mer)。完整的凝胶如图13c所示。t–p，模板-引物；o和n是指p-x-p中磷酸桥原子的标记(identity)。图5.通过延时晶体学观察逆向反应。图(a–d)显示polβ活性位点，并标明了关键残基；所有fo–fc省略图(omitmap)的轮廓均为3σ(绿色)。金属配位和关键距离用虚线表示。带切口的dna末端碱基对的碳为黄色。上游dna的碳是灰色。标出了引物末端(p10)上游的引物核苷酸以及pnp。pnp的桥氮为蓝色。图(a)显示与pnp和ca2+复合的基态带切口的dna底物复合物的活性位点(橙色；c，催化；n，核苷酸)。还显示了α-螺旋n(螺旋-n)的氨基末端。图(b)显示底物带切口的dna-pnp-ca2+复合物(黄色碳)和带切口的dna-ppi-mn2+产物复合物(pdb码4klh；浅蓝色碳)的覆盖图。ppi复合物中的锰原子为紫色。图(c)来自b的ppi和pnp磷酸基团的特写。箭头表示pnp相对于ppi的磷酸氧位移。针对pnp和ppi，磷酸和攻击氧之间的距离用虚线表示。图(d)显示短时间的mgcl2浸泡后，逆向反应的反应物复合物。mg2+和水离子分别显示为红色和蓝色球形。标出了桥水、arg183和pnp氮之间的距离。催化性金属和核苷酸结合金属分别标记为mgc和mgn。图(e)显示了逆向反应后最终的一个核苷酸缺口的dna–dcmppnp三元复合物。图6.焦磷酸盐类似物亚氨二磷酸盐(pnp)改变了人dna聚合酶β的反应平衡，并且导致的焦磷酸解速率增加使得能够进行该酶逆向反应的动力学和结构分解。图7.硫元素对焦磷酸解的影响。(a)图显示用于追踪焦磷酸解的测定。在带切口的dna底物上，polβ利用ppi去除3′-[32p]damp或3′-[35s]damp(a*)，分别生成[α-32p]datp或[α-35s]datp(datp*)。反应中加入了冷的datp或datp(αs)阱，以防止插入放射性产物，并再生带有未标记的3′-末端的带切口的dna。通过tlc监测产物的形成(datp*)。(b)用于形成[α-32p]datp的暴露tlc板的图像。泳道m是仅[α-32p]datp。整个板的图像如图14a所示。(c)在1mmppi存在下，polβ依赖性datp*的形成，具有3′-[32p]damp(■)或3′-[35s]damp(□)的引物末端。将单转化时程拟合至单指数模型(对于32p和35s标记的datp，分别为灰实线和灰虚线)(对于去除32p和35s标记的damp而言，kobs分别＝0.030/s和0.039/s)。图8.焦磷酸交换。(a)在[32p]ppi中的放射性标记向dntp移动之后进行交换反应，以区分ppi结合是发生在限速构象变化(红色箭头)的之前(上方)还是之后(下方)50。在该实验中，在单转化条件下(pol>>dna)，原位生成三元产物复合物(存在未标记的dntp以生成带切口的dna和冷ppi，灰色标记)，并且测量了放射性从标记的ppi向dntp(蓝色)移动的速率。这些方案说明，如果ppi结合发生在缓慢构象变化之前，那么测得的焦磷酸解速率将类似于交换速率。相反，如果ppi结合发生在缓慢构象变化之后，则交换速率(快速的ppi结合和化学反应)将比测得的焦磷酸解速率快。(b)将polβ与未标记的带切口的dna预先孵育，并与含有[32p]ppi和冷dctp的溶液混合。放射性dctp之后是tlc。实线表示对线性方程的最佳拟合。观察到的交换反应速率(斜率/酶-dna复合物)为0.028/s。由于通过底物循环(即，核苷酸的交替插入和去除)所确定的ppi交换速率与通过单转化分析所测量的速率相似，因此ppi结合发生在构象变化之前。由于通过底物循环(即，核苷酸的交替插入和去除)所确定的ppi交换速率与通过单转化分析所测量的速率相似，因此ppi结合发生在构象变化之前。图9.pnp诱导的缺口填补反应。(a)图说明用于追踪pnp诱导的缺口填补dna合成的测定。如在线方法中所述，在3'-引物末端带有两个脱氧胞苷残基的未标记的带切口的dna底物与低浓度的pnp孵育。然后，将带有5′-6-fam(*)15-mer标记引物(p)的单个核苷酸缺口的dna底物(缺口中是g)与该溶液混合，以确定在最初的反应中是否产生了互补的脱氧核苷三磷酸(即dcmppnp)可用于填补缺口。(b)在变性凝胶上分辨底物/产物，并通过磷光成像观察。填补缺口的dna合成产生16-mer的产物，而焦磷酸解则生成14-mer的产物。完整凝胶的图像如图14b所示。图10.硫元素对pnp依赖性逆向反应的影响。(a)图显示用于追踪pnp依赖性逆向反应的测定。带切口的dna底物利用pnp去除3′-[32p]damp或3′-[35s]damp(a*)，分别生成[α-32p]damppnp或[α-35s]damppnp(datp*)。反应中加入了冷的datp阱，以防止插入放射性产物，并再生带有未标记的3′-末端的带切口的dna。通过tlc监测产物的形成(datp*)。(b)对于去除带切口的dna中3′-[32p]damp的单转化时程，一级速率常数观察值(kobs)依赖性的pnp浓度的二级图。将这些数据拟合至双曲线(方程1，灰线)，以得出krev和kd(补充表1)。对于去除带切口的dna中3′-[35s]damp的单转化时程，一级速率常数观察值(kobs)依赖性的pnp浓度的二级图。在1000μmpnp处的重复点代表独立实验的数据。将这些数据拟合至双曲线(方程1，灰线)，以得出krev和kd(补充表1)。图11.通过dgmppnp插入进行缺口填补的单转化分析。(a)用0.1μm(▲)、0.2μm(◇)、0.5μm(◆)、1μm(□)、2μm(■)、4μm(○)和5μm(●)dgmppnp，进行polβ依赖性单核苷酸缺口填补dna合成。将时程拟合至单指数模型(灰色线)。(b)一级速率常数观察值(kobs)依赖性的dgmppnp浓度的二级图。将这些数据拟合至双曲线(方程1，灰线)，以得出kpol和kd(补充表1)。图12.polβ与一个核苷酸缺口的dna和带切口的dna结合的平衡分析。(a)代表测序凝胶的图像，其显示在20、50或100μmpnp存在下单核苷酸缺口填补的时间依赖性。完整凝胶的图像如图14c所示。在该测定中，5'标记的引物(15-mer)可以延伸一个核苷酸(16-mer)。第一泳道仅包括引物。(b)图a中显示的凝胶定量，表明已经建立平衡(即，dna产物的浓度在30-80s内不会随时间变化)，并且产物的量对pnp的浓度敏感(■，20μm；●，50μm；◆，100μm)。对于20、50和100μmpnp，计算得出的平衡常数分别为1.5、1.9和2.2。(c)用ppi的定量分析表明已经建立平衡，并且产物的量对ppi的浓度的敏感性较弱(■，1000μm；◆，2000μm)。对于1000和2000μmppi，计算得出的平衡常数分别为62700和82300。图13.完整的凝胶图像。在各个图中指示了裁剪的图像。(a)图2。(b)图4a。(c)图4b。图14.完整的tlc板或凝胶图像。在各个图中指示了裁剪的图像。(a)图7b。(b)图9b。(c)图12a。图15.补充表1：动力学参数的总结。图16.补充表2：数据收集和细化统计。具体实施方式提供以下详细描述以帮助本领域技术人员实施本发明。在不脱离本公开的精神或范围的情况下，本领域普通技术人员可以对本文描述的实施方案进行修改和变化。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、附图和其它参考文献均明确地通过引用全文并入。dna聚合酶催化有效和高保真的dna合成。虽然此反应有利于核苷酸掺入，但聚合酶也催化逆向反应(即焦磷酸解)，从而去除dna引物末端并生成脱氧核苷三磷酸。由于焦磷酸解会影响聚合酶的保真度和对链终止核苷的敏感性，因此我们用人dna聚合酶β分析焦磷酸解，发现该反应效率不高。缺乏硫元素效应表明该反应受到非化学步骤的限制。采用焦磷酸盐类似物，其中桥氧被亚氨基取代(pnp)，增加了逆向反应的速率，并显示出较大的硫元素效应，表明化学反应现在是速率决定性的(ratedetermining)。用pnp捕获结构的延时晶体学与有利于逆向反应的化学平衡相符。在反应化学、酶构象变化和总体反应平衡中，这些结果突出了在引入的核苷酸中β-磷酸和γ-磷酸之间桥原子的重要性。本说明书涉及焦磷酸解的动力学表征和ppi类似物亚氨二磷酸盐(pnp)的鉴定，pnp改变了内部平衡，从而允许通过延时x射线晶体学进行结构表征。尽管焦磷酸解受非化学步骤的限制，但用亚氨基取代ppi的桥氧会导致限速步骤发生变化，因此pnp依赖性逆向反应受化学作用的限制。这些结果影响了我们对dna聚合酶核苷酸转移酶化学机理的理解，并且关键的酶结构转变会影响功能。因此，本说明书提供了一种抑制hiv-1逆转录酶(rt)dna合成反应的新方法。rt进行的dna合成反应利用脱氧核苷5'-三磷酸(dntp)作为底物，像许多其它酶一样，该反应是可逆的。在正向方向上，延长的dna和焦磷酸盐(ppi)是产物，在反向方向上，dntp和缩短的dna是产物。因此，在某些方面，本说明书提供了包含焦磷酸盐类似物(例如反应产物ppi的类似物)的组合物和方法。在某些实施方案中，类似物是例如亚氨二磷酸盐(pnp)。发现pnp强烈促进逆向反应，形成含有pnp基团而不是天然ppi基团的dntp产物。发现这种含pnp的dntp是rt正向反应的有效抑制剂。另一个优点是，本文所述的类似物将更有效地抑制具有增强的逆向反应的rt耐药变体。在某些方面和实施方案中，说明书提供了包含焦磷酸盐(ppi)类似物(如pnp)的治疗组合物。在某些实施方案中，组合物包含有效量的焦磷酸盐(ppi)类似物(如pnp)和药学上可接受的载体。在某些其它方面和实施方案中，说明书提供了治疗或改善疾病或病症的症状的方法，包括向有此需求的患者施用有效量的包含焦磷酸盐(ppi)类似物(如pnp)的组合物，其中所述组合物有效治疗或改善疾病或病症的至少一种症状。在某些实施方案中，所述疾病或病症是过度增殖性病症、微生物相关的疾病或病症(如细菌或病毒感染)。在某些实施方案中，该疾病或病症是癌症或hiv-1感染。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案，而无意于限制本发明。在提供数值范围的情况下，除非上下文另有明确规定，否则应理解为在所述范围上限和下限之间的每个居间值直至其下限单位的十分之一(例如，在基团含有碳原子数的情况下，提供了落在范围内的每个碳原子数)、所述范围内的任何其它所述值或居间值也包括在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以独立地包括在更小范围内，也包括在本发明内，但以所述范围内的任何明确排除的限制为准。在所述范围包括一个或两个端值的情况下，将两个端值排除在外的范围也包括在本发明中。下列术语用于描述本发明。在本文中没有具体定义术语的情况下，本领域普通技术人员将该术语赋予该领域公认的含义，将其在上下文中应用于描述本发明。本文和所附权利要求书中使用的冠词“一”和“一个”在本文中用于指代一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法对象，除非上下文另有明确说明。举例来说，“一个元件”是指一个元件或一个以上元件。在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为是指这样结合的元素中的“一个或两个”，即在某些情况下共同存在、而在其它情况下不连续存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即如此连接的元素中的“一个或多个”。除了由“和/或”从句明确标识的元素之外，可任选地存在其它元素，而无论与那些具体标识的元素相关还是无关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，当与例如“包括”之类的开放式语言结合使用时，提及“a和/或b”可以仅指代a(可选地包括除b之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指代b(可选地包括除a之外的元素)；在又一个实施方案中，指代a和b(可选地包括其它元素)；等等。如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为与如上所定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当用来分隔列表中各项目时，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即包含至少一个，但也包括不止一个数量或列表的元素，以及任选其它未列出的项目。只有明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好其中之一”，或当在权利要求书中使用时，“由……组成”将表示仅包含一个元素或多个元素的列表。一般而言，当前面是排他性术语(例如“其一”、“之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”)时，本文所用的术语“或”仅应解释为排他性的替代(即“一个或另一个而非两者”)。在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡性短语，例如“包括”、“包含”、“带有”、“具有”、“含”、“涉及”、“持有”、“构成”等等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，仅过渡短语“由……组成”和“基本上由……构成”应分别是封闭的或半封闭的过渡短语。如在本说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应理解为是指元素列表中任何一个或多个元素中选择的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许任选存在短语“至少一个”所指代元素列表中具体指明的元素之外的元素，而无论与那些具体指明的元素有关还是无关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，“a和b中的至少一个”(或等效地“a或b中的至少一个”，或等效地“a和/或b中的至少一个”)可以指至少一个，任选地包括一个以上的a，不存在b(并且任选地包括b以外的元素)；在另一实施方案中，是指至少一个，任选地包括一个以上的b，不存在a(并且任选地包括a以外的元素)；在又一个实施方案中，指至少一个任选地包括一个以上的a以及至少一个任选地包括一个以上的b(并且任选地包括其它元素)；等。还应理解，在本文描述的包括不止一个步骤或动作的某些方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于表述的方法步骤或动作的顺序，除非上下文另有说明。除非另有说明，否则本文所用的术语“化合物”是指本文所公开的任何特定化合物，并且包括互变异构体、位置异构体、几何异构体、以及在适用时包括立体异构体，包括其光学异构体(对映异构体)和其它立体异构体(非对映异构体)，以及上下文中适用时，及其药学上可接受的盐和衍生物(包括前药形式)。在上下文中，术语“化合物”通常指单一化合物，还可以包括其它化合物，例如立体异构体、位置异构体和/或光学异构体(包括外消旋混合物)，以及所公开化合物的特定对映异构体或富含对映异构体的混合物(enantiomericallyenrichedmixture)。在上下文中，该术语也指化合物的前药形式，其已被修饰以促进化合物的施用和递送至活性部位。注意到在描述本发明化合物时，描述了许多取代基和与其相关的变量。本领域普通技术人员应理解，本文描述的分子是如下文一般描述的稳定化合物。当显示键时，在所示化合物的范围内代表双键和单键。在整个说明书中，术语“患者”或“受试者”用于描述动物，优选人或家养动物，用根据本发明的组合物向其提供治疗(包括预防性治疗)。为治疗特定动物(例如人患者)特有的那些感染、病症或疾病状态，术语患者指特定动物，包括家养动物(例如狗或猫)或农场动物(例如马、牛、绵羊等)。通常，在本发明中，术语“患者”是指人患者，除非在使用该术语的上下文中另有说明或暗示。术语“有效的”用于描述化合物、组合物或组分的量，当在其预期用途的范围内使用时，会达到预期的结果。术语“有效”包含所有其它有效量或有效浓度的术语，在本申请中另外描述或使用。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸的生物聚合物，除非上下文另有说明，否则包括修饰的和未修饰的核苷酸，以及dna和rna。例如，在某些实施方案中，核酸是肽核酸(pna)。通常，使用dna作为用于扩增的核酸模板进行本文所述的方法。然而，其中来自天然dna或rna的核苷酸被人工衍生物或修饰的核酸替代的核酸也包括在本发明的核酸中，只要其充当合成互补链的模板即可。本发明的核酸通常包含在生物样品中。生物学样品包括动物、植物或微生物组织、细胞、培养物和排泄物、或其提取物。在某些方面，生物学样品包括细胞内寄生基因组dna或rna，例如病毒或支原体。所述核酸可以衍生自所述生物样品中包含的核酸。例如，在所述方法中优选使用基因组dna或由mrna合成的cdna、或基于源自生物样品的核酸扩增所得的核酸。“互补性”是指核酸通过传统的watson-crick或其它非传统类型而形成氢键或与另一核酸序列杂交的能力。如本文所用，“杂交”是指分子在低、中或高度严格的条件下(包括当该序列存在于复杂混合物(例如总细胞)dna或dna中时)，仅与特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。参见例如ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，纽约n.y.1993。如果在多核苷酸特定位置的核苷酸能够与反平行dna或rna链中相同位置的核苷酸形成watson-crick配对，则该多核苷酸与该dna或rna分子在该位置彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可彼此杂交或退火(以实现所需过程)的核苷酸占据时，则多核苷酸和dna或rna分子彼此“基本上互补”。互补序列是能够在严格条件下退火以提供3'-末端作为互补链合成起点的序列。本发明中使用的术语“模板”是指用作模板的核酸，其用于在核酸扩增技术中合成互补链。具有与模板互补的核苷酸序列的互补链，其含义是与模板相对应的链，但是两者之间的关系仅仅是相对的。即，根据本文所述的方法，合成为互补链的链可以再次用作模板。即，互补链可以成为模板。在某些实施方案中，模板衍生自生物样品例如，植物、动物、病毒、微生物、细菌、真菌等。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，例如人患者。“患者样品”是指从患者采集的任何样品，可以包括血液、粪便、拭子、痰、支气管肺泡灌洗液、组织样品、尿液或脊髓液。其它合适的患者样品及其提取方法是本领域技术人员众所周知的。从其获取样品的“患者”或“受试者”可以是人或非人动物。当样品未特别称为患者样品时，该术语还包括从其它来源获取的样品。示例包括来自表面、水样(例如废水、海水、湖水、饮用水)、食品样品、化妆品、药品、发酵产物、细胞和微生物培养物、以及从中可检测微生物的其它样品中的拭子。在本发明中，使用术语核酸的“合成”和“扩增”。本发明中的核酸的合成是指以寡核苷酸作为合成起点的核酸延长或延伸。如果不仅是该合成，而且还连续发生形成其它核酸以及该形成的核酸的延长或延伸反应，则将一系列的这些反应统称为扩增。在本说明书中，简单表述“5'侧”或“3'侧”是指用作模板的核酸链的“5'侧”或“3'侧”，其中5'末端通常包括磷酸基，而3'末端通常包括游离-oh基。术语“疾病状态或病症”用于描述任何疾病状态或病症，特别是癌症，包括与遗传异常有关的癌症，或由于存在病原体(例如病毒、细菌、古细菌、原生动物或多细胞生物)而引起的癌症。本发明中使用的靶模板可以是包含合适的引物结合区的任何多核酸，所述引物结合区允许扩增感兴趣的多核酸。技术人员将理解，正向和反向引物结合位点需要以这样的方式定位在靶模板上，使得正向引物结合区和反向引物结合区分别在正义和反义链上位于待扩增序列的5'。靶模板可以是单链或双链的。当靶模板是单链多核酸时，技术人员将理解，靶模板最初将仅包含一个引物结合区。然而，第一引物的结合将导致互补链的合成，其随后将包含第二引物结合区。足以指导技术人员进行体外扩增方法的技术示例可见于上文的berger、上文的sambrook和上文的ausubel以及mullis等人、美国专利号4,683,202(1987)；和innis等人，pcrprotocolsaguidetomethodsandapplications编辑,academicpressinc.加州圣迭戈(1990)。用于基因组pcr扩增的市售试剂盒是本领域已知的。参见，例如advantage-gc基因组pcr试剂盒(clontech)。另外，例如t4基因32蛋白(boehringermannheim)可用于提高长pcr产物的产率。待治疗的病原生物可以是任何微生物，例如病毒、细菌、支原体和真菌。微生物可以是致病性的，但也可以是非致病性的微生物。微生物也可以是基因修饰生物(gmo)。此外，本发明的方法可以用于鉴定基因修饰的作物和动物，以便检测疾病状态；用于预测治疗中的不良反应以及预测疾病状态的敏感性。在某些实施方案中，微生物是细菌。在某些实施方案中，细菌是选自以下属的成员：芽孢杆菌属(bacillus)、巴尔通体(bartonella)、博德特氏菌属(bordetella)、包柔氏螺旋体(borrelia)、布鲁氏菌属(brucella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜衣原体(chlamydophila)、梭状芽孢杆菌属(clostridium)、棒状杆菌属(corynebacterium)、肠球菌属(enterococcus)、埃希氏菌属(escherichia)、弗氏杆菌属(francisella)、嗜血杆菌属(haemophilus)、军团菌属(legionella)、钩端螺旋体(leptospira)、李斯特菌数(listeria)、分枝杆菌属(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、奈瑟菌属(neisseria)、假单胞菌属(pseudomonas)、立克次体(rickettsia)、沙门氏菌属(salmonella)、志贺氏菌属(shigella)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、梅毒螺旋体(treponema)、脲原体(ureaplasma)、弧菌属(vibrio)和耶尔森氏菌属(yershinia)。在某些实施方案中，所述细菌是选自以下的成员：炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、亨通巴尔通体(bartonellahenselae)、五日热巴尔通体(bartonellaquintana)、百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、加里氏疏螺旋体(borreliagarinii)、短叶疏螺旋体(borreliaafzelii)、回归热螺旋体(borreliarecurrentis)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、犬布鲁氏菌(brucellacanis)、羊布鲁氏菌(brucellamelitensis)、猪布鲁氏菌(brucellasuis)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、肺炎衣原体(chlamydiapneumonia)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热衣原体(chlamydophilapsittaci)、肉毒梭状芽孢杆菌(clostridiumbotulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(clostridiumdifficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(clostridiumperfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(clostridiumtetani)、白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheria)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、大肠杆菌(escherichiacoli)、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)、问号钩端螺旋体(leptospirainterrogans)、圣地罗西钩端螺旋体(leptospirasantarosai)、魏氏钩端螺旋体(leptospiraweilii)、野口钩端螺旋体(leptospiranoguchii)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、溃疡分枝杆菌(mycobacteriumulcerans)、肺炎支原体(mycoplasmapneumonia)、淋病奈瑟氏球菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitides)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、立克次氏体(rickettsiarickettsia)、伤寒杆菌(salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、宋内志贺菌(shigellasonnei)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、肺炎链球菌(streptococcuspneumonia)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、梅毒螺旋体(treponemapallidum)、解脲支原体(ureaplasmaurealyticum)、霍乱弧菌(vibriocholera)、鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(yersiniaenterocolitica)和假结核菌(yersiniapseudotuberculosis)。在某些实施方案中，靶核酸模板来自结核杆菌(mtb或tb)。在某些另外的实施方案中，靶核酸模板来自mtb的rpob基因。在其它实施方案中，靶核酸模板是rpob13.5f6。在某些实施方案中，病毒是选自以下科的成员：腺病毒科(adenoviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、肝脱氧核糖核酸病毒科(hepadnaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、星状病毒科(astroviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、小rna病毒科(picornaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、疱疹病毒科(hepeviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、巨病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)和呼肠病毒科(reoviridae)。在某些实施方案中，病毒是选自以下的成员：腺病毒、单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、bk病毒、jc病毒、天花病毒、乙型肝炎病毒、人博卡病毒、细小病毒b19、人星状病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸系统综合症病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉萨病毒、马丘波病毒、萨比阿病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人间质肺病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎、轮状病毒、环状病毒、蜱传热病毒或版纳病毒。一方面，本发明涉及含有一种或多种本发明化合物的药物组合物。通过向有此需求的患者施用，可以将这些组合物用于实现所需的药理作用。为了本发明的目的，患者是需要治疗特定病症或疾病的哺乳动物，包括人。因此，本发明包括药物组合物，其包含药学上可接受的载体和药学有效量的本发明的化合物或其盐。药学上可接受的载体优选是，在与活性成分的有效活性相一致的浓度下，对患者相对无毒且无害的载体，从而归因于该载体的任何副作用都不能抵消该活性成分的有益作用。化合物的药学有效量优选是产生结果或对所治疗的特定病症产生影响的量。通过任何有效的常规剂量单位形式(包括速释、缓慢和定时释放的制剂、口服、肠胃外、局部、鼻、眼、局部、舌下、直肠、阴道等)，本发明的化合物可以与本领域公知的药学上可接受的载体一起施用。对于口服施用，可以将化合物配制成固体或液体制剂，例如胶囊剂、丸剂、片剂、锭剂、糖锭剂、融化剂、粉剂、溶液、混悬剂或乳剂，可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的方法制备。固体单位剂型可以是胶囊，其可以是普通的硬壳或软壳明胶类型，其包含例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂(例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以与常规的片剂基质(如乳糖、蔗糖和玉米淀粉)以及粘合剂(如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)、旨在帮助片剂在施用后分解和溶解的崩解剂(例如马铃薯淀粉、海藻酸、玉米淀粉和瓜尔豆胶、黄芪胶、阿拉伯胶)、旨在改善片剂颗粒的流动性并防止片剂材料粘附于片剂模具和冲头表面的润滑剂(例如滑石粉、硬脂酸或硬脂酸镁、硬脂酸钙或锌)、旨在提高片剂的美学品质并使其更易于为患者接受的染料、着色剂和调味剂(例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂)一起压片。用于口服液体剂型的合适赋形剂包括磷酸二钙和稀释剂，例如水和醇(例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇)，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂、助悬剂或乳化剂。各种其它材料可以作为包衣存在或以其它方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用虫胶、糖或两者包衣。分散性粉剂和颗粒剂适合于制备水性悬浮液。它们提供了与分散剂或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或湿润剂和助悬剂由上面已经提到的那些举例说明。也可以存在其它赋形剂，例如上述的甜味剂、调味剂和着色剂。本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油，例如液体石蜡或植物油的混合物。合适的乳化剂可以是(1)天然存在的胶，例如阿拉伯树胶和黄芪胶；(2)天然存在的磷脂，例如大豆和卵磷脂；(3)脂肪酸或己糖醇酐衍生的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，(4)所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳液还可以包含甜味剂和调味剂。可通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制油性悬浮液。油性悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。糖浆剂和酏剂可以与甜味剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖)一起配制。这样的制剂还可以包含缓和剂(demulcent)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)以及调味剂和着色剂。也可以肠胃外施用本发明的化合物，即皮下、静脉内、眼内、滑膜内、肌肉内或腹膜内作为化合物的注射剂量，优选在生理上可接受的稀释剂中与药物载体一起，所述药物载体可以是无菌液体或液体混合物，例如水、盐水、右旋糖水溶液和相关的糖溶液，醇(例如乙醇、异丙醇或十六烷醇)、二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、甘油缩酮(例如2,2-二甲基-1,1-二氧戊环-4-甲醇)、醚(如聚(乙二醇)400)、油、脂肪酸、脂肪酸酯或脂肪酸甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(例如皂或去污剂)、悬浮剂(例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)、或乳化剂和其它药物助剂。可在本发明的肠胃外制剂中使用的油的示例是石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、等渗水杨酸和肉豆蔻酸。合适的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。合适的皂包括脂肪酸碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，以及合适的去污剂包括阳离子去污剂，例如二甲基二烷基卤化铵、卤代烷基吡啶鎓和乙酸烷基胺；阴离子去污剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油硫酸盐和磺基琥珀酸盐；非离子型去污剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚(氧乙烯-氧丙烯)或环氧乙烷或环氧丙烷共聚物；和两性去污剂，例如烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基咪唑啉季铵盐，以及混合物。本发明的肠胃外组合物通常在溶液中含有按重量计约0.5％至约25％的活性成分。有利地也可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，这种组合物可包含具有优选为约12至约17亲水-亲脂平衡(hlb)的非离子型表面活性剂。这种制剂中表面活性剂的量优选为按重量计约5％至约15％。表面活性剂可以是具有上述hlb的单一组分，或者可以是具有所需hlb的两种或更多种组分的混合物。用于肠胃外制剂的表面活性剂的示例是一类聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯以及环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加合物，通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成。药物组合物可以是无菌可注射水性悬浮液的形式。可以按照已知方法，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制这种悬浮液，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂、环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadeca-ethyleneoxycetanol)、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受性稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂和溶剂是例如水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和等渗葡萄糖溶液。另外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸(如油酸)可用于制备注射剂。本发明的组合物也可以栓剂的形式施用，用于药物的直肠施用。可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，该赋形剂在常温下为固体，而在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放出药物。这样的材料例如是可可脂和聚乙二醇。在本发明的方法中采用的另一种制剂采用透皮递送装置(“贴剂”)。这样的透皮贴剂可以用于以控制量连续或不连续地输注提供本发明的化合物。用于递送药剂的透皮贴剂的构造和用途在本领域中是众所周知的(参见例如，1991年6月11日授权的美国专利号5,023,252，其通过引用并入本文)。这样的贴剂可以构造成用于连续、脉冲或按需递送药剂。用于肠胃外施用的控释制剂包括本领域已知的脂质体、聚合物微球和聚合物凝胶制剂。经由机械递送装置将药物组合物引入患者可能是期望的或必要的。用于递送药剂的机械递送装置的构造和使用在本领域中是众所周知的。例如，直接向大脑施用的直接技术通常包括将药物递送导管置于患者的心室系统中，以绕过血脑屏障。用于将药剂运输至身体特定解剖区域的这样一种植入式递送系统，描述于1991年4月30日签发的美国专利号5,011,472中。如果必要或需要，本发明的组合物还可包含其它常规的药学上可接受的混合成分，通常称为载体或稀释剂。可以采用将这种组合物制备成适当剂型的常规程序。这样的成分和程序包括在以下参考文献中描述的那些，每个文献通过引用并入本文：powell,m.f.等人，"compendiumofexcipientsforparenteralformulations"pdajournalofpharmaceuticalscience&technology1998,52(5),238-311；strickley,r.g"parenteralformulationsofsmallmoleculetherapeuticsmarketedintheunitedstates(1999)-part-1"pdajournalofpharmaceuticalscience&technology1999,53(6),324-349；以及nema,s.等人，"excipientsandtheiruseininjectableproducts"pdajournalofpharmaceuticalscience&technology1997,51(4),166-171。可以酌情用于配制预期施用途径的常用药物成分包括：酸化剂(示例包括但不限于乙酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、硝酸)；碱化剂(示例包括但不限于氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺、三醇胺)；吸附剂(示例包括但不限于粉末状纤维素和活性炭)；气溶胶喷射剂(示例包括但不限于二氧化碳、ccl2f2、f2clc-cclf2和cclf3)；空气置换剂(示例包括但不限于氮气和氩气)；抗真菌防腐剂(示例包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠)；抗微生物防腐剂(示例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、十六烷基氯化吡啶鎓、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；抗氧化剂(示例包括但不限于抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠)；粘结材料(示例包括但不限于嵌段聚合物、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨酯、硅酮、聚硅氧烷和苯乙烯-丁二烯共聚物)；缓冲剂(示例包括但不限于偏磷酸钾、磷酸氢二钾、乙酸钠、无水柠檬酸钠和柠檬酸钠二水合物)；载剂(示例包括但不限于阿拉伯胶糖浆、芳香糖浆、芳香酏剂、樱桃糖浆、可可糖浆、橙糖浆、糖浆、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、抑菌氯化钠注射液和抑菌注射用水)；螯合剂(示例包括但不限于乙二胺四乙酸二钠和乙二酸)；着色剂(示例包括但不限于fd&c红色3号，fd&c红色20号，fd&c黄色6号，fd&c蓝色2号，d&c绿色5号，d&c橙色5号，d&c红色8号，焦糖和氧化铁红)；澄清剂(示例包括但不限于膨润土)；乳化剂(示例包括但不限于阿拉伯胶、鲸蜡醇聚氧乙烯醚(cetomacrogol)、鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯50单硬脂酸酯)；包封剂(示例包括但不限于明胶和邻苯二甲酸乙酸纤维素)；调味剂(示例包括但不限于茴香油、肉桂油、可可、薄荷醇、橙油、薄荷油和香草醛)；湿润剂(示例包括但不限于甘油、丙二醇和山梨糖醇)；研和剂(示例包括但不限于矿物油和甘油)；油(示例包括但不限于花生油(arachisoil)、矿物油、橄榄油、花生油(peanutoil)、芝麻油和植物油)；软膏剂基质(示例包括但不限于羊毛脂、亲水性软膏、聚乙二醇软膏、凡士林、亲水性凡士林、白色软膏、黄色软膏和玫瑰水软膏)；渗透促进剂(透皮递送)(示例包括但不限于单羟基或多羟基醇、一元或多元醇、饱和或不饱和脂肪醇、饱和或不饱和脂肪酯、饱和或不饱和二羧酸、精油、磷脂酰衍生物、脑磷脂、萜烯、酰胺、醚、酮和尿素)；增塑剂(示例包括但不限于邻苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶剂(示例包括但不限于乙醇、玉米油、棉籽油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、纯净水、注射用水、注射用无菌水和冲洗用无菌水)；增硬剂(示例包括但不限于鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、微晶蜡、石蜡、硬脂醇、白蜡和黄蜡)；栓剂基质(示例包括但不限于可可脂和聚乙二醇(混合物))；表面活性剂(示例包括但不限于苯扎氯铵、壬诺酚10、羟丁酚9、聚山梨酯80、月桂基硫酸钠和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)；悬浮剂(示例包括但不限于琼脂、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高岭土、甲基纤维素、黄芪胶和veegum)；甜味剂(示例包括但不限于阿斯巴甜、右旋糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精钠、山梨糖醇和蔗糖)；片剂抗粘剂(示例包括但不限于硬脂酸镁和滑石粉)；片剂粘合剂(示例包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、非交联的聚乙烯基吡咯烷酮和预糊化淀粉)；片剂和胶囊剂稀释剂(示例包括但不限于磷酸氢钙、高岭土、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、粉状纤维素、沉淀碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠、山梨醇和淀粉)；片剂包衣剂(示例包括但不限于液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素和虫胶)；片剂直接压片赋形剂(示例包括但不限于磷酸氢钙)；片剂崩解剂(示例包括但不限于海藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、聚克利林钾、交联聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠、羟乙酸淀粉钠和淀粉)；片剂助流剂(示例包括但不限于硅胶、玉米淀粉和滑石粉)；片剂润滑剂(示例包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌)；片剂/胶囊不透明剂(示例包括但不限于二氧化钛)；片剂抛光剂(示例包括但不限于巴西棕榈蜡和白蜡)；增稠剂(示例包括但不限于蜂蜡、鲸蜡醇和石蜡)；张力剂(示例包括但不限于右旋糖和氯化钠)；增粘剂(示例包括但不限于海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠和黄芪胶)；和润湿剂(示例包括但不限于十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇、卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯)。基于已知用于评估可用于本发明方法的化合物和组合物的标准实验室技术，通过标准毒性试验和通过标准药理学测定法，来确定上述哺乳动物病症的治疗方法，并将这些结果与用于治疗这些病症的已知药物结果进行比较，可以容易地确定本发明化合物治疗每种所需适应症的有效剂量。在治疗这些病症之一中所要施用的活性成分的量可以根据考虑因素(例如所使用的特定化合物和剂量单位、施用方式、治疗时间、待治疗患者的年龄和性别、以及所治疗病症的性质和程度)广泛变化。待施用的活性成分的总量通常将在每天约0.001mg/kg体重至约200mg/kg体重的范围内，优选每天约0.01mg/kg至约20mg/kg体重。临床上有用的给药时间表从一日给药一到三次到每四周给药一次。另外，在某些时间段内不给患者服用药物的“药物假期”可能有益于药理作用和耐受性之间的总体平衡。单位剂量可以包含约0.5mg至约1500mg的活性成分，并且可以每天一次或多次施用或少于一天一次。注射施用(包括静脉内、肌内、皮下和肠胃外注射)的平均日剂量，和使用输注技术优选为0.01至200mg/kg总体重。每日平均直肠剂量方案优选为0.01至200mg/kg总体重。每日平均阴道剂量方案优选为0.01至200mg/kg总体重。每日平均局部剂量方案优选为0.1至200mg，每天施用1至4次。透皮浓度将优选是维持每日剂量为0.01至200mg/kg所需的浓度。平均每日吸入剂量方案优选为0.01至100mg/kg总体重。当然，针对每个患者的具体初始和连续剂量方案将根据主诊医生确定的病症性质和严重程度、所用特定化合物的活性、患者的年龄和一般状况、施用时间、施用途径、药物排泄速率、药物组合等而变化。本发明化合物或其药学上可接受的盐或酯或其组合物的期望治疗方式和剂量数，可以由本领域技术人员使用常规的治疗试验来确定。在另一方面，提供了用于根据本发明方法的试剂盒。优选地，这种试剂盒包括实施本文所述方法所必需的所有组分。在另一方面，本说明书提供了治疗或预防疾病的方法，其包括进行本文所述的方法，和单独施用本文所述的治疗剂、或本文所述的治疗剂与有效量的另一其它治疗剂或生物活性剂(例如抗生素、抗癌药、抗炎药、抗微生物药、抗病毒药、抗真菌药、抗精神病药等)组合施用。术语“生物活性剂”用于描述具有生物活性的药剂，以帮助实现预期的治疗、抑制和/或预防/预防。如本文所用，术语“治”，“治疗”和“处理”等是指对患者提供益处的任何行为，包括对任何疾病状态或病症的治疗。其它治疗剂或生物活性剂可以与本发明的组合物同时或相继施用。可以使用根据本发明的化合物治疗的病症的疾病状态包括，例如哮喘、自身免疫性疾病(例如多发性硬化)、各种癌症、纤毛病、腭裂、糖尿病、心脏病、高血压、炎症性肠病、智力低下、情绪障碍、肥胖、屈光不正、不育、angelman综合征、canavan病、乳糜泻(coeliacdisease)、charcot-marie-tooth病、囊性纤维化、杜氏肌营养不良症、血色素沉着症、血友病、klinefelter综合征、神经纤维瘤病、苯丙酮酸尿症、多囊肾疾病(pkd1)或4(pkd2)prader-willi综合征、镰状细胞病、tay-sachs病、turner综合征。可以通过根据本发明的化合物治疗的其它疾病状态或病症包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(lougehrig病)、神经性厌食症、焦虑症、动脉粥样硬化、注意力缺陷多动障碍、自闭症、双相情感障碍、慢性疲劳综合征、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、冠心病、痴呆、抑郁症、1型糖尿病、2型糖尿病、癫痫、格林-巴利综合征、肠易激综合征、狼疮、代谢综合征、多发性硬化、心肌梗塞、肥胖、强迫症、恐慌症、帕金森氏病、牛皮癣、类风湿关节炎、结节病、精神分裂症、中风、闭塞性血栓性血管炎、图雷特综合症、血管炎。可以通过本发明的化合物治疗的其它疾病状态或病症包括铜蓝蛋白血症、ii型软骨病、软骨发育不全、肢端畸形(acrocephaly)、2型gaucher病、急性间歇性卟啉症、canavan病、腺瘤性息肉病、ala脱水酶缺乏症、腺苷琥珀酸裂合酶缺乏症、肾上腺综合症、肾上腺皮质营养不良、ala-d卟啉症、ala脱水酶缺乏症、黑尿酸尿症、亚历山大病、尿黑酸黄褐病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、α-1蛋白酶抑制剂、气肿、肌萎缩性侧索硬化、综合征、亚历山大病、釉质生长不全、ala脱水酶缺乏症、anderson-fabry病、雄激素不敏感综合征、贫血性血管角膜扩张症、视网膜血管瘤病(vonhippel-lindau病)、apert综合征、蛛网膜炎(marfan综合征)、stickler综合征、关节软骨多发性先天性(ehlers-danlos综合征#关节松弛型)共济失调毛细血管扩张、rett综合征、原发性肺动脉高压、sandhoff病、ii型神经纤维瘤病、beare-stevensoncutisgyrata综合征、家族性地中海热、benjamin综合征、β地中海贫血、双侧听觉神经纤维瘤病(ii型神经纤维瘤病)、v因子莱顿血友病、bloch-sulzberger综合征(色素失禁)、bloom综合征、x连锁铁粒幼细胞贫血、bonnevie-ullrich综合征(turner综合征)、bourneville病(结节性硬化症)、朊病毒病、birt-hogg-dubé综合征、脆性骨病(成骨发育不全)、宽指-hallux综合症(rubinstein-taybi综合征)、青铜糖尿病/青铜肝硬化(血色素沉着症)、球棘肌萎缩症(肯尼迪病)、汉堡-格鲁茨综合征(脂蛋白脂肪酶缺乏症)、cgd慢性肉芽肿病、坎波马氏增生、生物素酶缺乏症、心肌病(noonan综合征)、猫叫综合症(ciduchat)、cavd(先天性输精管缺失)、caylor心-面综合征(cbavd)、cep(先天性红细胞生成性卟啉症)、囊性纤维化、先天性甲状腺功能减退症、软骨营养不良综合征(软骨发育不全)、耳脊椎骨骺发育不良(otospondylomegaepiphysealdysplasia)、lesch-nyhan综合征、半乳糖血症、ehlers-danlos综合征、致死性发育不良、coffin-lowry综合症、科凯恩综合征(家族性腺瘤性息肉病)、先天性红细胞生成性卟啉症、先天性心脏病、高铁血红蛋白血症/先天性血红蛋白血症、软骨发育不全、x连锁铁粒幼细胞性贫血、结缔组织病、面部异常综合征、库氏贫血(β-库利氏贫血)、铜累积病(wilson病)、铜运输病(menkes病)、遗传性共卟啉症、cowden综合征、颅面肌异常(crouzon综合征)、creutzfeldt-jakob病(朊病毒病)、cockayne综合征、cowden综合征、curschmann-batten-steinert综合征(强直性营养不良)、beare-stevensoncutisgyrata综合征、原发性高草酸尿症、脊椎骨骺干骺端发育不良(spondyloepimetaphysealdysplasia)(strudwick型)、duchenne和becker型肌肉营养不良(dbmd)、usher综合征、退化性神经疾病(包括degrouchy综合征和dejerine-sottas综合征)、发育障碍、远端脊髓性肌肉萎缩v型、雄激素不敏感综合征、弥漫性球状体硬化症(krabbe病)、狄乔治氏综合症、二氢睾丸激素受体缺乏症、雄激素不敏感综合症、唐氏综合症、侏儒症、红细胞生成性原卟啉症、类红体5-氨基乙酰丙酸酯合酶缺乏症、红细胞生成性卟啉症、红细胞生成性原卟啉症、红细胞生成性尿卟啉症、弗里德赖希共济失调、家族性阵发性多浆膜炎(familialparoxysmalpolyserositis)、迟发性皮肤卟啉病、家族性压力敏感的神经病、原发性肺动脉高压(pph)、胰腺纤维囊性疾病、脆性x综合征、半乳糖血症、遗传性脑病、巨细胞肝炎(新生儿血色素沉着病)、gronblad-strandberg综合征(弹性假黄瘤)、gunther病(先天性红细胞生成性卟啉症))、血色素沉着症、hallgren综合征、镰状细胞性贫血、血友病、肝红细胞生成性卟啉症(hep)、hippel-lindau病(vonhippel-lindau病)、亨廷顿病、hutchinson-gilford早衰综合征(早衰)、高雄激素症、软骨发育不良、低色指数性贫血、免疫系统疾病(包括x连锁严重综合免疫缺陷)、insley-astley综合征、jackson-weiss综合征、joubert综合征、lesch-nyhan综合征、jackson-weiss综合征、肾脏疾病(包括高草酸尿症)、klinefelter综合征、kniest发育不良、腔隙性痴呆、langer-saldino软骨发育不全、共济失调毛细血管扩张、林奇综合征、赖氨酰羟化酶缺乏症、马查多-约瑟夫病、新陈代谢异常(包括kniest发育不良)、马凡氏综合征、运动障碍、莫瓦特-威尔森综合征、囊性纤维化、muenke综合征、多发性神经纤维瘤、nance-insley综合征、nance-sweeney软骨发育不良、niemann-pick病、noack综合征(pfeiffer综合征)、osler-weber-rendu病、peutz-jeghers综合征、多囊肾病、多骨肌纤维发育不良(mccune-albright综合征)、peutz-jeghers综合征、prader-labhart-willi综合征、血色素沉着症、原发性高尿酸血症综合征(lesch-nyhan综合征)、原发性肺动脉高压、原发性老年退行性痴呆、朊病毒病、早衰症(hutchinsongilford早衰综合症)、进行性舞蹈病、慢性遗传性疾病(亨廷顿)(亨廷顿病)、进行性肌肉萎缩、脊髓性肌萎缩、丙酸血症、原卟啉症、近端肌强直性营养不良、肺动脉高压、pxe(弹性纤维假黄瘤)、rb(视网膜母细胞瘤)、雷克林豪森病(i型神经纤维瘤病)、复发性多发性浆膜炎、视网膜病、视网膜母细胞瘤、rett综合征、3型rfals、ricker综合征、riley-day综合征、roussy-levy综合征、严重的软骨发育不全伴有发育延迟和黑棘皮病(saddan)、li-fraumeni综合征、肉瘤、乳腺、白血病和肾上腺(sbla)综合征、结节状硬化(结节性硬化症)、sdat、先天性sed(先天性脊椎骨骺发育不良)、sedstrudwick(脊椎骨骺干骺端发育不良，strudwick型)、sedc(先天性脊椎骨骺发育不良)、semd、strudwick型(脊椎骨骺干骺端发育不良，strudwick型)、shprintzen综合征、皮肤色素沉着症、smith-lemli-opitz综合征、南非遗传性卟啉症(杂斑性卟啉症)、小儿发作性遗传性痉挛性麻痹、言语和沟通障碍、神经脂质病、tay-sachs病、脊髓小脑性共济失调、stickler综合征、中风、雄激素不敏感综合征、四氢抗体蝶呤缺乏、β-地中海贫血、甲状腺病、腊肠样神经病(遗传性神经病，与压力性麻痹有关)、treachercollins综合征、tiplox综合征(三重x综合征)、21三体性(唐氏综合症)、x-三体性、vhl综合征(vonhippel-lindau病)、视力障碍和失明(综合征)、vrolik病、waardenburg综合征、warburgsjofledelius综合征、韦-兹(weissenbacher-zweymüller)综合征、wolf-hirschhorn综合征、wolff周期性疾病、韦-兹综合征和干皮病等。术语“癌症”是指导致癌性或恶性肿瘤形成和生长的病理过程，即通过细胞增殖而生长的异常组织，通常比正常组织生长更快，并在(引发新生长停止的)刺激后继续生长。恶性肿瘤表现出与正常组织和大部分侵袭性周围组织的部分或完全缺乏结构组织和功能协调，除非经过适当治疗，否则其转移到多个部位并且很可能在试图切除后复发并导致患者死亡。可以通过本发明化合物单独治疗的、或本发明化合物与至少一种其它抗癌剂组合治疗的示例性癌症包括：鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肝细胞癌、和肾细胞癌、膀胱癌、肠癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、头部癌、肾癌、肝癌、肺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病；良性和恶性淋巴瘤，特别是伯基特淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；良性和恶性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤，包括尤因氏肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、脂肪肉瘤、肌瘤、周围神经上皮瘤、滑膜肉瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜上皮瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节瘤、神经节神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、松果细胞瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤、和神经鞘瘤；肠癌、乳癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、食道癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤；癌肉瘤、霍奇金病、威尔姆斯瘤和畸胎瘤。可以使用根据本发明的化合物治疗的其它癌症包括，例如t-谱系急性淋巴细胞白血病(t-all)、t-谱系淋巴母细胞淋巴瘤(t-ll)、外周t细胞淋巴瘤、成人t-细胞白血病、前-ball、前-b淋巴瘤、大-b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、b-细胞all、费城染色体阳性all和费城染色体阳性cml。术语“抗癌剂”用于描述抗癌剂。这些药剂包括例如依维莫司、曲贝替丁、abraxane、tlk286、av-299、dn-101、帕唑帕尼、gsk690693、rta744、on0910.na、azd6244(arry-142886)、amn-107、tki-258、gsk461364、azd1152、恩扎他汀(enzastaurin)、凡德他尼、arq-197、mk-0457、mln8054、pha-739358、r-763、at-9263、flt-3抑制剂、vegfr抑制剂、egfrtk抑制剂、极光激酶抑制剂、pik-1调节剂、bcl-2抑制剂、hdac抑制剂、c-met抑制剂、parp抑制剂、cdk抑制剂、egfrtk抑制剂、igfr-tk抑制剂、抗hgf抗体、pi3激酶抑制剂、akt抑制剂、mtorc1/2抑制剂、jak/stat抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、map激酶(mek)抑制剂、vegf捕获抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙他尼、尼洛替尼、地卡他尼、帕尼单抗、氨柔比星、奥雷哥马布、lep-etu、诺拉曲德、azd2171、巴塔布林、奥法木单抗、扎诺木单抗、依德卡林(edotecarin)、粉防己碱(tetrandrine)、鲁贝替康、替米尼芬、奥利美生、替利木单抗、伊匹单抗、棉酚、bio111、131-i-tm-601、alt-110、bio140、cc8490、西仑吉肽、吉美坦、il13-pe38qqr、ino1001、ipdr1krx-0402、甲硫恩酮(lucanthone)、ly317615、neuradiab、vitespan、rta744、sdx102、他兰潘奈尔、阿曲生坦、xr311、罗米地辛、ads-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、脂质体多柔比星、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、zk-304709、seliciclib；pd0325901、azd-6244、卡培他滨、l-谷氨酸、n-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰]-二钠盐七水合物、喜树碱、peg-标记的伊立替康、他莫昔芬、柠檬酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、des(二乙基苯雌酚)、雌二醇、雌激素、缀合雌激素、贝伐单抗、imc-1c11、chir-258；3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹诺酮、瓦他拉尼、ag-013736、ave-0005、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、曲普瑞林棕榈酸酯、醋酸甲羟孕酮、羟孕酮己酸酯、醋酸孕烯醇、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸甲地孕酮、cp-724714；tak-165、hki-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡尼替尼、abx-egf抗体、爱必妥、ekb-569、pki-166、gw-572016、爱奥那尼、bms-214662、替比法尼；氨磷汀、nvp-laq824、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanalidehydroxamicacid)、丙戊酸、曲古抑菌素a、fk-228、su11248、索拉非尼、krn951、氨基谷氨酰胺、阿那沙林、阿那格雷、l-天冬酰胺酶、卡介苗芽孢杆菌(bcg)疫苗、亚德里亚霉素、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐盐、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、二乙基间苯三酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、格列卫、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲氧乙胺、美法仑、6-巯基嘌呤、麦斯纳、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸盐、戊喷他汀、普卡霉素、卟吩姆(porfimer)、甲(基)苄肼、雷替曲塞(raltitrexed)、利妥昔单抗、链脲霉素、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、硫替帕、维甲酸、长春地辛、13-顺-视黄酸、苯丙氨酸芥末、尿嘧啶芥末、雌莫司汀、六甲嘧胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧考福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光神霉素、长春碱、长春瑞滨、拓扑替康、雷佐辛、马马司他(marimastat)、col-3、neovasta、bms-275291、角鲨胺、恩度、su5416、su6668、emd121974、白介素12、im862、血管生成抑制素、vitaxin、屈洛昔芬、依托芬、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼洛丁地氟托昔芬、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、无克列莫佛的紫杉醇、多西紫杉醇、埃博霉素b、bms-247550、bms-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌多昔芬、era-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿可比芬、拉索昔芬、异昔芬、tse-424、hmr-3339、zk186619、托泊替康、ptk787/zk222584、vx-745、pd184352、雷帕霉素、40-o-(2-羟乙基)雷帕霉素、替西罗莫司、ap-23573、rad001、abt-578、bc-210、ly294002、ly292223、ly292696、ly293684、ly293646、渥曼青霉素、zm336372、l-779,450、peg-非格司亭、达贝泊汀、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来膦酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、聚乙二醇化干扰素α-2a、干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、peg-l-天冬酰胺酶、来那度胺、吉妥单抗、氢化可的松、白细胞介素-11、右雷佐生、阿来珠单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基强的松龙、替坦异贝莫单抗(ibritgumomabtiuxetan)、雄激素、地西他滨、六甲蜜胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢霉素、脂质体柔红霉素、埃德温-天冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、nk-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、二苯胺(diphendramine)、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲基泼尼松龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、恩丹西酮、多拉司琼、托烷司琼、培非格司亭、促红细胞生成素、阿法依伯汀、阿法达贝泊及其混合物。术语“抗病毒剂”包括例如核苷逆转录酶抑制剂(nrti)、其它非核苷逆转录酶抑制剂(即，不代表本发明的那些)、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂等，其示例性化合物可包括，例如3tc(拉米夫定)、azt(齐多夫定)、(-)-ftc、ddi(地达诺新)、ddc(扎西他滨)、阿巴卡韦(abc)、替诺福韦(pmpa)、d-d4fc(reverset)、d4t(司他夫定)、racivir、l-fddc、l-fd4c、nvp(奈韦拉平)、dlv(地拉韦定)、efv(依非韦伦)、sqvm(甲磺酸沙奎那韦)、rtv(利托那韦)、idv(茚地那韦)、sqv(沙奎那韦)、nfv(萘非那韦)、apv(氨普奈韦)、lpv(洛匹那韦)、融合抑制剂(例如t20)等、其融合体(fuseon)及其混合物，包括目前在临床试验或开发中的抗hiv化合物。可以使用的其它抗hiv剂包括，例如其它nnrti(即，除了根据本发明的nnrti之外)，可以选自：奈韦拉平(bi-r6-587)、地拉夫定(u-90152s/t)、依非韦伦(dmp-266)、uc-781(n-[4-氯-3-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-2-甲基-3-呋喃硫代酰胺、依曲韦林(tmc125)、卓维啶(ly300046.hcl)、mkc-442(依米韦林、coactinon)、hi-236、hi-240、hi-280、hi-281、利比韦林(tmc-278)、msc-127、hby097、dmp266、黄芩苷(tjn-151)adam-ii(甲基3'，3'-二氯-4'，4”-二甲氧基-5'，5”-双(甲氧基羰基)-6,6-二苯基己酸酯)、甲基3-溴-5-(1-5-溴-4-甲氧基-3-(甲氧基羰基)苯基)庚-1-烯基)-2-甲氧基苯甲酸酯(烯基二芳基甲烷类似物，adam类似物)、(5-氯-3-(苯基亚磺酰基)-2'-吲哚羧酰胺)、aap-bhap(u-104489或pnu-104489)、卡普韦林(ag-1549、s-1153)、阿替维定(u-87201e)、玫红三羧酸(sd-095345)、1-[((6-氰基-2-吲哚基)羰基]-4-[3-(异丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、1-[5-[[n-(甲基)甲基磺酰基氨基]-2-吲哚基羰基-4-[3-(异丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、1-[3-(乙基氨基)-2-[吡啶基]-4-[(5-羟基-2-吲哚基)羰基]哌嗪、1-[(6-甲酰基-2-吲哚基)羰基]-4-[3-(异丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、1-[[5-(甲基磺酰氧基)-2-吲哚基)羰基]-4-[3-(异丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、u88204e、双(2-硝基苯基)砜)(nsc633001)、calanolidea(nsc675451)、calanolideb、6-苄基-5-甲基-2-(环己氧基)嘧啶-4-酮(dabo-546)、dpc961、e-ebu、e-ebu–dm、e-epseu、e-epu、膦甲酸(foscavir)、hept(1-[(2-羟基乙氧基)甲基]-6-(苯硫基)胸腺嘧啶)、hept-m(1-[(2-羟基乙氧基)甲基]-6-(3-甲基苯基)硫代)胸腺嘧啶)、hept-s(1-[(2-羟基乙氧基)甲基]-6-(苯硫基)-2-硫代胸腺嘧啶)、inophyllump、l-737,126、米歇尔胺a(nsc650898)、米歇尔胺b(nsc649324)、米歇尔胺f、6-(3,5-二甲基苄基)-1-[(2-羟基乙氧基)甲基]-5-异丙基尿嘧啶、6-(3,5-二甲基苄基)-1-(乙氧基甲基)-5-异丙基尿嘧啶、npps、e-bptu(nsc648400)、奥替普拉(4-甲基-5-(吡嗪基)-3h-1,2-二硫基-3-硫酮)、n-{2-(2-氯-6-氟苯乙基]-n'-(2-噻唑基)硫脲(pettc1、f衍生物)、n-{2-(2,6-二氟苯乙基]-n'-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(pett衍生物)、n-{2-(2,6-二氟苯乙基]-n'-[2-(5-甲基吡啶基)]硫脲(pett吡啶基衍生物)、n-[2-(3-氟呋喃基)乙基]-n'-[2-(5-氯吡啶基)]硫脲、n-[2-(2-氟-6-乙氧基苯乙基)]-n'-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲、n-(2-苯乙基)-n'-(2-噻唑基)硫脲(ly-73497)、l-697,639、l-697,593、l-697,661、3-[2-(4,7-二氟苯并噁唑-2-基)乙基}-5-乙基-6-甲基(吡啶-2(1h)-硫酮(2-吡啶酮衍生物)、3-[[((2-甲氧基-5,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]胺]-5-乙基-6-甲基(吡啶-2(1h)-硫酮、r82150、r82913、r87232、r88703、r89439(洛韦胺)、r90385、s-2720、舒拉明钠、tbz(硫偶氮苯并咪唑、nsc625487)、噻唑异吲哚-5-酮、(+)(r)-9b-(3,5-二甲基苯基-2,3-二氢噻唑啉[2,3-a]异吲哚-5(9bh)-酮、替维拉平(r86183)、uc-38和uc-84等。抗微生物剂包括例如抗生素。在某些实施方案中，所述抗微生物剂是抗结核药，例如吡嗪酰胺或苯甲酰胺、普瑞玛尼(pretomanid)和苯达喹啉等。实施例在本申请中引用的所有参考文献、专利、未决专利申请和公开的专利的内容在此明确地通过引用并入。上述组合物和方法通过参考附图和下面的随附描述进一步举例说明。ppi依赖性逆向反应生成dntp因为带切口的dna将引物末端定位在n位点，所以通常将带有32p-标记的3'引物末端的带切口底物用于动力学测量(图1a)。采用这种dna底物，焦磷酸解就可以生成[α-32p]dntp和单核苷酸缺口的dna。可以通过放射性标记dna的丢失或放射性标记dntp的形成来观察焦磷酸解。在使用薄层色谱法(tlc)形成[32p]dctp之后，显示观察到的单转化(酶/dna>1)时程的速率取决于ppi浓度(图1b)。这些观察到的速率常数的二级图提供了表观ppi结合亲和力(约90μm)和观察到的焦磷酸解速率常数(krev约0.03s-1)(图1c；补充结果，补充表1)。由于配体(dntp或ppi)的结合导致了催化所必需的从开放到封闭聚合酶构象的结构转变，所以在化学反应前后会发生大的整体构象变化(图1d)。为了确定逆向反应的慢速率是否受化学或非化学步骤的限制，测定了去除3′-末端硫代磷酸的速率。由于硫相对于氧的空间、电子和金属结合特性不同，硫取代时速率的大幅降低表明化学反应是速率限制性的。使用(α-s)datp的sp-非对映异构体酶促合成底物。由于存在构型反转，该反应生成带有3'-末端rp-硫代磷酸核苷酸间键的带切口的dna。与正向反应相反，焦磷酸解没有观察到硫代磷酸的元素(elemental)作用(图7)，表明化学反应不是速率限制性的。此外，在切口处用t–a进行焦磷酸解的速率常数与使用g–c所测的速率常数相似。为了确定ppi结合是否可以绕过动力学障碍，测量交换反应以跟踪[32p]ppi中放射性标记向dntp的运动。如果ppi结合发生在构象变化之前(图8a)，则交换速率和焦磷酸解速率将相同。催化循环过程中交换反应的速率与通过单转化分析测得的速率相同，表明ppi结合发生在化学反应前的构象变化之前(图8b)。ppi类似物依赖性逆向反应的调查双膦酸盐(图2)具有在ppi中代替桥氧的碳原子，并用于治疗骨质疏松症和骨转移18。我们调查了三种双膦酸盐(依替膦酸盐、氯膦酸盐和帕米膦酸盐)作为逆向反应底物的能力，这将会生成在β-和γ-磷酸(pβ和pγ)之间带有修饰桥原子的dntp类似物。此外，我们还研究了亚氨二磷酸盐(用作atp和gtp类似物(即nmppnp)的一部分以研究使用腺苷-和鸟苷-的酶)能否可以作为ppi类似物用于逆向反应。对这些类似物进行调查的定性分析表明，双膦酸盐是中(例如，依替膦酸盐)至弱(氯膦酸盐和帕米膦酸盐)底物，但是pnp表现出强活性，将大多数dna底物连续降解为非常短的产物(图2)。为了定量用氮代替ppi桥氧的影响，进行了单转化实验以确定该酶的速率和pnp结合亲和力(图3和补充表1)。尽管pnp的结合亲和力比ppi弱一些(约4倍)，但逆向反应的速度要快1000倍(krev约30s-1)。如先前观察的，用tlc溶剂系统，与针对dcdp所预期相比，dcmppnp产物以相似迁移率进行迁移。还证实pnp引发的逆向反应的产物可用于正向反应中以进行协同的(coupled)dna合成反应。该反应使用两种dna底物：在切口边缘处带有3'-dcmp的未标记带切口的dna以及单核苷酸缺口的dna，其在缺口中带有模板脱氧鸟苷和5'32p-标记的引物。添加低浓度的pnp会在缺口的dna底物上导致缺口填补-dna合成，表明pnp可以生成dcmppnp，随后可以填补缺口的底物(图9)。此外，三元切口-dna-pnp复合物的晶体学表征表明，pnp支持强的逆向反应，而生成在pβ和pγ之间的桥原子是氮原子的dntp类似物(见下文)。为观察由pnp引发的观察到更快速率的逆向反应是否受到化学或非化学步骤的限制，确定了去除3'-末端硫代磷酸的速率。与缺乏硫代磷酸元素对观察到的ppi所引发反应的作用(图7)不同的是，当去除3'-末端rp-硫代磷酸核苷酸时pnp依赖性逆向反应相当慢(图10)。在这种情况下，硫代磷酸作用约为30(krev(o)/krev(s))。因为dgtp的pβ和pγ之间的桥氧被取代为亚甲基衍生物，显示出对插入效率的影响，所以对插入2'-脱氧鸟苷-5'-[(β，γ)-亚氨基]三磷酸(dgmppnp)的动力学进行了定量。单转化分析表明插入速率大大降低，但结合亲和力增加(图11和补充表1)。正向反应的降低连同逆向反应的增加，表明相对于使用ppi的反应的化学平衡的降低。总体平衡常数在多种ppi浓度下测量了酶结合的缺口dna和带切口的dna的总体平衡常数。在单转化条件下，将50nm缺口dna与mg2+和低浓度dctp和不同浓度的ppi进行孵育。在各种时间间隔后将反应淬灭，并在测序凝胶上分离反应产物。定量测定底物(缺口的dna)和产物(带切口的dna)条带，并计算总体平衡常数(图12)；keq＝[带切口的dna][ppi]/[缺口dna][dctp]。在不同的ppi浓度下确定的总体平衡常数为keq＝68,700±7,200。在亚氨基类似物(dgmppnp和pnp)的情况下，以类似方式测量总体平衡。在这种情况下，模板碱基为胞嘧啶，因为进入的核苷酸为dgmppnp。在这种情况下，产生充分正向反应所需的dgmppnp浓度(平衡使用pnp的强烈的逆向反应)要比三磷酸pβ和pγ之间的桥原子为氧原子时所需的浓度高得多(图12)。该反应的总体平衡明显低于用天然底物所进行的平衡(keq＝1.7±0.1)。dna底物对逆向反应的特异性链终止核苷酸或不正确核苷酸的插入导致dna产物破坏进一步的dna合成。这提供了通过焦磷酸解去除3′-末端核苷酸的机会。ppi依赖性去除3'错配核苷酸，非常弱，这可能是由于聚合酶活性位点中末端错配的几何结构失真所致。但是，链终止核苷酸通常在其糖部分进行修饰，不会干扰watson-crick氢键或磷酸骨架的几何结构，从而为解封反应(即“通过逆转而去除”)提供了良好的底物。图4显示了焦磷酸-和pnp-依赖性去除链终止核苷酸。从带有5'32p-标记引物链的单核苷酸缺口的dna开始，原位制备dna底物。将(相对于dna而言)过量的链终止的核苷三磷酸添加到缺口dna底物中，并与polβ一起孵育以生成带有3'链终止核苷酸的带切口的dna底物。加入焦磷酸盐或pnp，并监测标记的dna引物链的缩短。通过逆向反应去除链终止核苷酸，当用pnp替代ppi时，反应发生得更快。与watson-crick碱基配对的引物末端相反，引物末端的错配不是焦磷酸解的良好底物11。但是，用pnp代替ppi可以显著消除错配(图4)。此外，似乎g–t错配(模板-引物)的去除比g–a末端更快。焦磷酸解的延时晶体学为了在分子细节上分析逆向反应的稳健性，进行了延时晶体学。在这种方法中，将二元dna复合物的晶体用底物或金属浸泡以启动化学反应，并通过快速冷冻在一定时间间隔内停止反应。然后确定结构，以识别反应进程并捕获反应路径中的独特分子特征。尽管针对正向dna合成反应已经完成，但未能成功地引发焦磷酸解，即ppi结合未生成dntp。该结果可能是由于不利的化学平衡造成的。由于pnp引发强烈的逆向反应，因此pnp–ca2+被添加到二元polβ–带切口的dna络合物的晶体中。由于ca2+具有催化惰性，因此pnp结合会产生封闭的预催化三元复合物(pol–带切口的dna–pnp)，其中两个ca2+离子位于正向dna合成反应所需的金属结合位点(补充表2和图5a)。将三元pnp–ca2+复合物与mg2+生成的三元ppi产物复合物进行了比较(pdb4klo；图5b)。尽管结构总体上是相似的(在326个cα原子上r.m.s.)，但仍存尽在一些明显的细微差别。pnp结构在催化位点和核苷酸金属结合位点上包含两个ca2+离子，而ppi结构具有与核苷酸金属位点结合的单个mg2+离子和在催化金属位点结合的na+。此外，相对于ppi观察到的，pnp中非桥氧的精确位置偏移了约(图5c)。与ppi相比，这种适度的重新定位使pnp上的攻击氧向离去基团的磷酸移动，更接近了(分别相距2.8和)。将晶体浸泡在含有mg2+的溶液中导致mg2+交换ca2+离子。短时间后，将晶体快速冷冻，并衍射至占用率的细化(refinement)表明，大约40％的复合物发生了逆向反应。通过配位距离和几何结构推导出，催化和金属结合位点包含mg2+离子。此外，独特的水分子在arg183与dcmppnp的pβ和pγ间的氮之间起“桥”分子作用(图5d)。其它mg2+浸泡导致晶体复合物的完全转化，其中产物dcmppnp结合在封闭的聚合酶复合物中。值得注意的是，mg2+仍然占据催化金属位点，而没有明显的dna合成活性。在这种情况下，与脱氧尿苷5'-[(β，γ)-亚氨基]三磷酸观察到的相比，o3'(引物末端)与pα(dcmppnp)之间的距离为(pdb2fms；图5e)。已建议焦磷酸解在dna聚合酶保真度、和hiv-1逆转录酶、以及线粒体dna聚合酶γ对链终止核苷药物的敏感性中起作用。在插入链终止或异常核苷酸后停顿的dna聚合酶可以利用焦磷酸解来去除这种障碍，而具有校正活性的3'-5'核酸外切酶的dna聚合酶，可以利用水解切除活性来去除末端核苷酸。在后一种情况下，会生成核苷一磷酸而不是三磷酸。对逆向反应的更好理解对于定义将影响或调节这些所述活性的总体反应是必不可少的，并且是合理药物设计的前提。在这方面，ppi类似物可以抑制正向或逆向反应，而增强逆向反应的其它物质可以降低总体正向反应。dna聚合酶单核苷酸插入的过度简化通用方案(图1d)，用作讨论和解释动力学和结构观察的有用概述。它不包括可能对活性产生重大影响的几个关键步骤，例如催化金属结合以及可能影响酶-配体复合物分布的其它构象调整。化学反应前和化学反应后构象变化步骤的特性也是未知的。但是，在不同的配体状态下对各种dna聚合酶进行深入的结构表征表明，配体结合后存在蛋白质和底物构象性调节。这些变化的范围从较大的酶亚结构域运动(例如t7dna聚合酶)到微小的环和侧链调节(例如polμ)。当polβ-dna二元复合物(带切口的dna或缺口dna)结合ppi或dntp时，转变为封闭复合物。这种修饰涉及羧基末端的n-亚结构域(右手dna聚合酶的“指”)的重新定位，从而与底物和产物紧密接触。因此，将在构象变化的背景下，采用n亚结构域的打开和关闭(图1d)。通过隔离(sequester)正确的三磷酸核苷(大k3，图1d)和排列催化原子，底物和蛋白质的构象调整在促进确保高保真dna合成中起重要作用31。此外，通过两步反应快速分解三元产物复合物，其中化学反应后构象变化(大k5，图1d)促进ppi快速释放，也使反应向正向进行。尽管已经建立了两步dntp结合的机制，但化学反应后构象变化和焦磷酸解的影响却很少受到关注。为了分析核苷酸插入后发生的动力学步骤，对逆向反应进行了表征。dna聚合酶已经进化为在复制dna的同时，阻止逆向核酸降解的焦磷酸解反应。部分原因是由于使用高电荷的活性位点可“调节”天然底物进行dna合成。用a和b家族有校正活性的dna聚合酶(exo突变体)的平衡常数实验估计值约为5,000。对于缺乏校正活性的polβ(x家族)，根据酶结合的底物和产物的平衡浓度所确定的平衡常数比这些报告值高10倍以上。对正向反应的更大保证可能部分是由于针对polβ观察到的在核苷酸插入后快速的催化金属解离，这会阻止逆向反应。量子力学-分子力学机制的计算表明，这种金属是焦磷酸解所需的。此外，催化后活性位点的水渗透会导致与ppi的核苷酸金属配位丧失，从而引发产物解离，这也将阻止了焦磷酸解的进行。如通过单转化分析(酶>dna，无催化循环)以及通过交换反应(在交替插入和去除核苷酸时，其测量放射性标记从ppi到dntp的转移)所测量的，dnapolβ的焦磷酸解是缓慢的(krev约0.03s-1)(图8)。缺乏硫元素对焦磷酸解的作用与焦磷酸解之前的限速非化学构象变化是一致的(图7a)。由于核苷酸插入化学反应后的平衡常数不利(k5大)，所观察到的焦磷酸解速率将低估固有速率(k–4，图1d)，因为产生的三元产物复合物仅占总酶产物(dna+1-ppi)复合物的一部分。通过使用具有修饰的离去基团(即桥β，γ-亚甲基衍生物)的核苷三磷酸，显示出核苷酸的插入强烈地依赖于离去基团的酸度(较低的酸度导致插入减少)，表明键的断裂至少部分是速率限制性的。β，γ-亚氨基修饰的核苷三磷酸的酸度低于其天然对应物的酸度37。与亚甲基取代一致，dgmppnp的插入减少了两个数量级，而观察到的pnp的逆向反应则增加了三个数量级(补充表1)，表明总体平衡变化了约105倍。用pα(dntp)上的非桥氧原子取代硫，为聚合酶催化的反应提供了有价值的机理细节。硫取代pα上的非桥氧应使该磷酸盐不易受到亲核攻击(硫的负电性比氧低)，从而在化学反应是唯一限速步骤的情况下降低了观察到的反应速率。尽管ppi引发的逆向反应没有硫元素作用，但pnp引发的反应中观察到了实质性的作用(krev(o)/krev(s)约30；图10)。更快的速率必须反映出在逆向反应之前构象变化速率的实质性提高(k-5)，因此不再是速率限制性的。在亚氨基部分和arg183之间观察到的水介导的氢键可以促进该步骤(图5d，图5e)。polβ与缺口dna和胸苷5'-[(α，β)-甲基(β，γ)-亚氨基]三磷酸(tmpcpnp)的三元复合体中也报道了类似的氢键模式。对polβ和polη的正向反应的时间延迟晶体学表征(参考文献40)确定了辅助的二价金属阳离子配位反应产物(即插入的dnmp和ppi)。有人提出，这种金属降低了插入反应的活化势垒(即，增加了k4)。相反，使用polβ进行的计算研究与该金属在阻止焦磷酸解反应中的作用(即降低了k-4)一致。与后一种解释一致，可以用带切口的dna和ppi以及不进行焦磷酸解(即没有形成dntp)的辅助金属形成封闭的polβ三元产物复合物。另外，我们还不能解析封闭二元带切口的dna复合物的结构，这与亚结构域开放后发生的ppi快速释放是一致的。值得注意的是，在结构上观察pnp(而非ppi)的封闭复合物中逆向反应的能力表明，当用pnp代替ppi时，内部化学平衡显著降低。重要的是，未观察到可能干扰逆向反应的辅助产物金属。通过pnp依赖性反应所测得的强硫元素作用表明，化学反应现在是限速的。因此，至少更改了两个步骤(图1d，步骤4和5)以显著降低平衡常数。结合pnp后，polβ必须迅速闭合，形成活化的三元复合物(k-5>k-4)。在催化和核苷酸结合位点处存在镁时，在结构上捕获pnp依赖性逆向反应的产物复合物(即，和dcmppnp和单核苷酸缺口的dna)的能力，表明化学平衡常数(k4)显著小于1。如果将测得的单转化率作为该步骤的固有速率常数，则k4＝0.003。由于keq比所得的k4大1,000倍，因此周围的平衡必须向正向推动dna合成反应。新形成的引物末端(o3’)与dcmppnp的pα之间的距离(图5e)显著大于在正向反应的预催化复合物中观察到的距离其中正向反应被不可水解的核苷酸类似物所捕获。这种增加的距离可能部分解释了核苷酸插入速率的降低。与错配末端相比，带有匹配末端的焦磷酸依赖性引物末端去除显著更好。尽管pnp改善了错配的去除，其效果不如匹配末端所示的(图4b)，表明最佳活性需要适当定位的引物末端。观察到polλ可以通过焦磷酸解去除(与8-氧代-脱氧鸟苷(8-氧代-dg)相对的)错误插入的damp，这与这种观点一致8。在这种情况下，错配模拟了a-t碱基对，其中8-氧代-dg为syn构象，并且hoogsteen碱基与腺嘌呤配对。对于天然底物，通过插入后的构象变化将反应推向正向，可最大程度降低对链终止核苷酸的抗性(图1d，大k5)。这种构象变化的逆转(k-5)限制了焦磷酸解。在焦磷酸解增加的情况下，耐药性可归因于核苷酸插入后非化学步骤的改变。该步骤的分子特征是未知的，但是通常归因于已知与hiv-1逆转录酶(polγ和polβ)一起发生的亚结构域重新定位(打开和关闭)。通过降低正向速率并加快逆向反应，亚氨基取代进入核苷三磷酸和ppi中的β，γ-桥氧显著削弱了dna合成的有利平衡(补充表1)。这是通过改变构象和化学平衡而发生的。因此，逆向反应的产物(dgmppnp)是正向反应的良好抑制剂(即紧密结合并缓慢插入)。尽管pnp依赖性链终止核苷酸的去除明显好于ppi(图4a)，但最终结果是dna聚合酶活性非常低(即抑制)。重要的是，总体反应的平衡对dna合成离去基团的性质很敏感，这表明进入核苷酸的末端磷酸的化学性质会影响化学和构象平衡。示例性方法材料。表达并纯化了人polβ44。氯膦酸盐、依替膦酸盐、亚氨二磷酸盐、帕米膦酸盐和焦磷酸盐购自sigma-aldrich。β，γ-亚氨基修饰的核苷三磷酸类似物、2′-脱氧鸟苷5′-[(β，γ)-亚氨基]三磷酸(dgmppnp)来自jenabioscience。链终止核苷三磷酸：ddctp来自gehealthcare；3’-叠氮-2’，3’-二脱氧胸苷三磷酸(azttp)和阿拉伯呋喃糖胞嘧啶三磷酸(aractp)来自trilinkbiotechnologies；吉西他滨(dfdctp)获自jenabioscience。[α-35s]datp、[α-32p]dctp和[32p]ppi来自perkinelmer。含有荧光指示剂的聚乙烯亚胺(pei)纤维素薄层色谱(tlc)板购自emdmillipore。反应缓冲液。所有动力学测量均在以下缓冲液中进行：含有50mmmes、25mmtris、25mm乙醇胺(在37℃下调节ph7.5)、100mmkcl、10mmmgcl2补充有10％甘油、100μg/ml牛血清白蛋白、1mmdtt和0.1mmedta的缓冲液。产物的分离。观察5'-标记的引物链长度的变化，并在16％变性聚丙烯酰胺凝胶上解析。使用磷相仪以荧光模式扫描凝胶，观察6-羧基荧光素(6-fam)-标记的寡核苷酸。将干燥的凝胶暴露于磷屏后，检测放射性标记的寡核苷酸。逆向反应产物也在pei纤维素tlc板上分离。除非另有说明，否则将板在0.2或0.3mnapiph7.0中显影。在含有10mmβ-巯基乙醇的缓冲液中进行35s-标记的逆向反应产物的tlc。dna制备。如前所述45，制备了含有5'-6-fam标记的单核苷酸缺口的dna底物。用来定性监测逆向反应的带切口的dna底物的如下制备。简而言之，用[γ-32p]atp和optikinase在5'末端进行16-mer寡核苷酸引物的放射性标记。使用biospin6柱去除未并入的[γ-32p]atp。将5’-标记的引物(1当量)与1.2当量的34-mer模板和含有5’-po4基团的18-mer下游寡核苷酸混合。在pcr热循环仪中进行退火。寡核苷酸在95℃变性5分钟，然后缓慢冷却(1℃/min)至10℃。以下序列用于构建具有匹配或错配引物末端的带切口的dna底物；引物5’-ctgcagctgatgcgcy-3’，其中y表示a、c或t；下游寡核苷酸5’-gtacggatcccccgggtac-3’；模板链5’-gtacccggggatccgtacxgcgcatcagctgcag-3’，其中x表示g。pnp诱导的缺口填补反应。在不含mg2+的反应混合物中，将polβ(5μm)与2.5μm带切口的dna和20μmpnp进行预孵育。将其与含20mmmgcl2的溶液混合(1：1，v/v)，并在37℃的反应缓冲液中孵育。混合后，最终浓度为2.5μmpolβ、1.25μm带切口的dna、10μmpnp和10mmmgcl2。10分钟后，将等分试样与溶液混合(4：1，v/v)，其中所述溶液含有2.5μm单核苷酸缺口的dna(缺口中为g)以及5'-6-fam标记的15-mer引物和10mmmgcl2。在不同时间取出等分试样(10μl)，并在等体积的0.3medta，ph8.0中淬灭。反应底物和产物在16％变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过磷相仪显现。3'-32p-或35s-标记的带切口的dna底物的制备。使用dna聚合酶β与[32p]dctp或[35s]datp填补1个核苷酸缺口的dna底物，以产生3'-放射标记的带切口的dna底物。反应混合物包含50mmtris–cl，ph7.4(37℃)、100mmkcl、10mmmgcl2、1mmdtt、2.5μm缺口的dna、5μm[32p]dctp或[35s]datp。单核苷酸dna底物与上述带切口的底物相似，不同之处在于引物链短一个核苷酸(缺失了3'-核苷酸)。通过添加polβ引发缺口填补，并在37℃下孵育5-10分钟。通过添加0.5medta(0.1体积)淬灭反应。为了去除酶和未并入的核苷酸，用苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)提取混合物，然后两次通过biospin6柱。在提取和去除步骤之前和之后，取出标记反应的等分试样，以确定最终dna底物浓度。将之前-和之后-的等分试样(1μl)点到pei纤维素板上，并在0.375mkh2po4，ph4.0中显影。该比率(提取后/提取前)用于校正由于缺失或稀释底物的初始dna浓度。逆向反应测定。在反应缓冲液中，将polβ(1μm)与100nm带有匹配或错配引物末端的带切口的dna于37℃孵育5分钟。在反应缓冲液中含有2mmppi或焦磷酸盐类似物的20mmmgcl2的溶液，用来引发反应。混合后，最终浓度为500nmpolβ、50nm的带切口的dna、10mmmgcl2和1mmppi或焦磷酸盐类似物。在不同时间取出等分试样(5或10μl)，并在等体积的0.3medtaph8.0中淬灭。如上所述，分离和显示反应底物和产物。通过逆向反应去除终止的引物末端需要带切口的dna底物的酶促合成。将4μmpolβ和0.4μm单核苷酸缺口的dna的预孵育混合物，与20mmmgcl2和0.2μm各种链终止核苷酸的三磷酸(ddctp、azttp、aractp或dfdctp)1：1(v/v)混合。缺口填补反应在37℃下进行10-20分钟，以生成终止的带切口的dna底物。取出等分试样并淬灭以验证完全的缺口填补(16-mer)。通过添加等体积的10mmmgcl2和250μmppi或pnp引发逆向反应。取出等分试样(时间＝3分钟)，淬灭，并在变性凝胶上进行分析。通过逆向反应去除末端错配，然后将1μmpolβ与100nm带有匹配(g–c)或错配(g–a或g-t)引物末端碱基对的5'-32p-标记的带切口的dna底物在37℃下孵育5分钟。将其与20mmmgcl2和2mmppi或pnp(1：1，v/v)的溶液混合以引发反应。在不同的时间间隔通过加入等体积的0.3medta淬灭反应，并在变性凝胶上分离底物和逆向反应产物。在37℃单转化条件下(e/dna＝10)，确定逆向反应的动力学参数。在反应缓冲液中polβ(1μm)与100nm带切口的dna的3′-32p-标记引物以及各种浓度的ppi或pnp进行预孵育。通过在反应缓冲液中与等体积的20mmmgcl2和50μmdntp阱溶液混合，来启动时程。dntp阱可防止放射性标记产物dntp的重新插入，并与反应过程中产生的核苷酸三磷酸性质相对应。在焦磷酸解的情况下，通过手动混合或通过使用kintekrqf-3与pnp的快速混合来进行反应的引发。edta(0.1或0.2m)用作淬灭剂。通过tlc在0.2或0.3mnapiph7.0缓冲液中分离底物和产物。焦磷酸交换测定。在含有20mmmgcl2的反应缓冲液中，polβ(2.5μm)与500nm含有匹配引物末端碱基对(g-c，模板-引物)的未标记的带切口的dna底物预孵育，并与预热溶液(反应缓冲液、2mm[32p]ppi和100μmdctp)手动混合(1：1，v/v)。在各个时间点取出等分试样，并用1体积0.3medta淬灭。将淬灭的反应混合物施加到pei纤维素板上，并在0.3m磷酸钾缓冲液ph8.0中显影。扫描板，然后使用磷相仪和imagequant软件进行定量。缺口填补dna合成动力学测定。为了测量第一次插入的速率(kpol)和表观平衡核苷酸解离常数(kd)，如前所述进行单转化动力学测定(酶/dna＝10)。简而言之，使用kintekrqf-3快速淬灭流，将酶和dna的预孵育溶液与各种浓度的mgcl2和dgmppnp快速混合。用0.25medta淬灭反应。动力学分析。在给定的gmppnp、ppi或pnp浓度下，单转化时程拟合至单指数方程以产生一级速率常数(kobs)。在这些条件下，kobs取决于底物的浓度。kobs浓度依赖性的二级图是双曲线，并通过非线性最小二乘法拟合至方程(1)，其中kmax是限制第一个核苷酸插入(正向反应)或去除(逆向反应)步骤的固有速率常数。kobs＝kmax[s]/(kd[s])(1)其中s＝dgmppnp、ppi或pnp。对于dgmppnp的插入，由于其相对于酶浓度的高亲和力，因此二级图拟合至二次方程(方程(2))。kobs＝(kpol)((((kd+[dgmppnp]+[edna])((kd+[dgmppnp]+[edna]2)-(4[dgmppnp][edna]))0.5)/2[edna](2)选择数据点、时间和配体浓度以提供完全覆盖；即分别在反应半衰期(≥6个时间点)和配体结合亲和力(≥5个浓度)的以下和以上，收集多个点。除非另有说明，否则动力学常数代表最佳拟合参数及其标准误差。总体平衡常数的确定。500nmpolβ与单核苷酸缺口的dna(pol/dna＝10；模板g或c)的混合物(其中包含各种浓度的ppi(500–2,000μm)或pnp(20、50、100μm))，与等体积的含60–100nmdctp或50μmdgmppnp的20mmmgcl2混合，并在37℃下孵育不同的时间间隔。在不同时间取出等分试样(10μl)，并用等体积的0.3medta淬灭。10–80s后将反应淬灭，在测序凝胶上分离反应产物。定量底物(缺口dna)和产物(带切口的dna)条带，并计算总体平衡常数；keq＝[带切口的dna][ppi]/[缺口dna][dctp]或[带切口的dna][pnp]/[缺口dna][dgmppnp]。文中报告了6个独立测定的平均值和标准误差。结构确定。如前所述43，培养带切口的dna的二元复合物晶体。按照之前所述11以及本文所简要总结的，进行延时晶体学。首先将二元polβ/dna复合物晶体转移到含有15％乙二醇、50mm咪唑ph7.5、20％peg3350、90mm乙酸钠、2mmpnp和50mmcacl2的冷冻溶液中1小时。然后将这些基态(gs)三元复合物晶体转移到含有200mmmgcl2的冷冻溶液中维持不同的时间。在本地来源或advancedphotonsource(阿贡国家实验室)收集数据之前，在100k冻结晶体来停止所有反应。内部数据收集是通过安装在miramax-007hf旋转阳极发生器上的saturn92ccd检测器系统完成的。这允许在通过分子取代进行定相后进行异常数据检测。通过东南地区合作访问团队(ser-cat)bm-22光束在advancedphotonsource(阿贡国家实验室)和mar225区域探测器进行远程数据收集。使用hkl2000软件包对数据进行处理和缩放47。使用polβ的开放二元结构(pdbid3isb)或封闭三元结构(pdbid2fms)进行分子取代确定最初的模型，所有rfree标志(flag)均来自起始模型。使用phenix进行细化(refinement)，并使用coot建立模型。由readyset(phenix)生成金属-配体配位约束，不使用直到最后一轮优细化。使用反应物和产物种类生成部分催化模型，并进行了占用率细化。在pymol(llc)中制备结构图，并在执行模拟退火后生成所有密度图。ramachandran分析确定100％的非甘氨酸残基位于允许的区域，其中至少97％位于有利区域。在本文所述的任何实施方案中，所述方法包括将(b)分为至少一个其它二级反应，这包括和第二感兴趣位点互补的第二位点特异性二级引物，所述第二感兴趣位点可能存在于一级扩增子中，并在感兴趣区域中限定第二兴趣位点。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述发明特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案旨在包含在所附权利要求中。应当理解，本文所描述的详细实施例和实施方案仅通过举例的方式给出，仅用于说明目的，绝不认为是对本发明的限制。对于本领域技术人员将提出各种修改或改变，这些修改或改变被包括在本申请的精神和范围内，并且被认为在所附权利要求的范围内。例如，可以改变成分的相对量以优化所需的效果，可添加的其它成分和/或相似的成分可以用代替所述成分中的一种或多种。根据所附权利要求，与本发明的系统、方法和过程相关的其它有利特征和功能将是显而易见的。此外，本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述本发明的特定实施方案的许多等同方案。所附权利要求书旨在涵盖这些等同方案。参考文献出于任何目的，以下参考文献通过引用其整体并入此处。1.bebenek,k.&kunkel,t.a.functionsofdnapolymerases.adv.proteinchem.69,137–165(2004).2.deutscher,m.p.&kornberg,a.enzymaticsynthesisofdeoxyribonucleicacid.28.thepyrophosphateexchangeandpyrophosphorolysisreactionsofdeoxyribonucleicacidpolymerase.j.biol.chem.244,3019–3028(1969).3.parsons,j.l.,nicolay,n.h.&sharma,r.a.biologicalandtherapeuticrelevanceofnonreplicativednapolymerasestocancer.antioxid.redoxsignal.18,851–873(2013).4.mckenna,c.e.,kashemirov,b.a.,peterson,l.w.&goodman,m.f.modificationstothedntptriphosphatemoiety:frommechanisticprobesfordnapolymerasestoantiviralandanti-cancerdrugdesign.biochim.biophys.acta.1804,1223–1230(2010).5.smith,a.j.,meyer,p.r.,asthana,d.,ashman,m.r.&scott,w.a.intracellularsubstratesfortheprimer-unblockingreactionbyhumanimmunodeficiencyvirustype1reversetranscriptase:detectionandquantitationinextractsfromquiescent-andactivated-lymphocytesubpopulations.antimicrob.agentschemother.49,1761–1769(2005).6.urban,s.,urban,s.,fischer,k.p.&tyrrell,d.l.effcientpyrophosphorolysisbyahepatitisbviruspolymerasemaybeaprimer-unblockingmechanism.proc.natl.acad.sci.usa98,4984–4989(2001).7.hanes,j.w.&johnson,k.a.anovelmechanismofselectivityagainstaztbythehumanmitochondrialdnapolymerase.nucleicacidsres.35,6973–6983(2007).8.crespan,e.,maga,g.&hübscher,u.anewproofreadingmechanismforlesionbypassbydnapolymerase-.emborep.13,68–74(2011).9.beard,w.a.&wilson,s.h.structureandmechanismofdnapolymeraseβ.biochemistry53,2768–2780(2014).10.perera,l.,beard,w.a.,pedersen,l.g.&wilson,s.h.chapterfour-applicationsofquantummechanical/molecularmechanicalmethodstothechemicalinsertionstepofdnaandrnapolymerization.adv.proteinchem.struct.biol.97,83–113(2014).freudenthal,b.d.,beard,w.a.,shock,d.d.&wilson,s.h.observingadnapolymerasechooserightfromwrong.cell154,157–168(2013).12.kirby,t.w等人，metal-induceddnatranslocationleadstodnapolymeraseconformationalactivation.nucleicacidsres.40,2974–2983(2012).13.das,k等人，conformationalstatesofhiv-1reversetranscriptasefornucleotideincorporationvspyrophosphorolysis—bindingoffoscarnet.acschem.biol.11,2158–2164(2016).14.sawaya,m.r.,prasad,r.,wilson,s.h.,kraut,j.&pelletier,h.crystalstructuresofhumandnapolymeraseβcomplexedwithgappedandnickeddna:evidenceforaninducedfitmechanism.biochemistry36,11205–11215(1997).15.eckstein,f.nucleosidephosphorothioates.annu.rev.biochem.54,367–402(1985).16.vandeberg,b.j.,beard,w.a.&wilson,s.h.dnastructureandaspartate276influencenucleotidebindingtohumandnapolymeraseβ.implicationfortheidentityoftherate-limitingconformationalchange.j.biol.chem.276,3408–3416(2001).17.liu,j.&tsai,m.d.dnapolymeraseβ:pre-steady-statekineticanalysesofdatpαsstereoselectivityandalterationofthestereoselectivitybyvariousmetalionsandbysite-directedmutagenesis.biochemistry40,9014–9022(2001).18.lipton,a.emergingroleofbisphosphonatesintheclinic-antitumoractivityandpreventionofmetastasistobone.cancertreat.rev.34(suppl.1),s25–s30(2008).19.rozovskaya,t等人，pyrophosphateanaloguesinpyrophosphorolysisreactioncatalyzedbydnapolymerases.febslett.247,289–292(1989).20.penningroth,s.m.,olehnik,k.&cheung,a.atpformationfromadenyl-5-ylimidodiphosphate,anonhydrolyzableatpanalog.j.biol.chem.255,9545–9548(1980).21.oertell,k等人，transitionstateindnapolymeraseαcatalysis:rate-limitingchemistryalteredbybase-pairconfiguration.biochemistry53,1842–1848(2014).22.oertell,k等人，effectofβ,-chf-andβ,γ-chcl-dgtphalogenatomstereochemistryonthetransitionstateofdnapolymeraseβ.biochemistry51,8491–8501(2012).23.sucato,c.a等人，modifyingtheβ,leaving-groupbridgingoxygenaltersnucleotideincorporationeffciency,fidelity,andthecatalyticmechanismofdnapolymeraseβ.biochemistry46,461–471(2007).24.sucato,c.a等人，dnapolymeraseβfidelity:halomethylene-modifiedleavinggroupsinpre-steady-statekineticanalysisrevealdifferencesatthechemicaltransitionstate.biochemistry47,870–879(2008).25.batra,v.k.,beard,w.a.,pedersen,l.c.&wilson,s.h.structuresofdnapolymerasemispaireddnaterminitransitioningtopre-catalyticcomplexessupportaninduced-fitfidelitymechanism.structure24,1863–1875(2016).26.vaisman,a.,ling,h.,woodgate,r.&yang,w.fidelityofdpo4:effectofmetalions,nucleotideselectionandpyrophosphorolysis.emboj.24,2957–2967(2005).27.li,a.,gong,s.&johnson,k.a.rate-limitingpyrophosphatereleasebyhivreversetranscriptaseimprovesfidelity.j.biol.chem.291,26554–26565(2016).28.cruchaga,c.,ansó,e.,rouzaut,a.&martínez-irujo,j.j.selectiveexcisionofchain-terminatingnucleotidesbyhiv-1reversetranscriptasewithphosphonoformateassubstrate.j.biol.chem.281,27744–27752(2006).29.yanvarev,d.v等人，methylenebisphosphonatesastheinhibitorsofhivrtphosphorolyticactivity.biochimie127,153–162(2016).30.balbo,p.b.,wang,e.c.-w.&tsai,m.-d.kineticmechanismofactivesiteassemblyandchemicalcatalysisofdnapolymeraseβ.biochemistry50,9865–9875(2011).31.tsai,y.-c.&johnson,k.a.anewparadigmfordnapolymerasespecificity.biochemistry45,9675–9687(2006).32.dahlberg,m.e.&benkovic,s.j.kineticmechanismofdnapolymerasei(klenowfragment):identificationofasecondconformationalchangeandevaluationoftheinternalequilibriumconstant.biochemistry30,4835–4843(1991).33.oertell,k等人，kineticselectionvs.freeenergyofdnabasepairingincontrolofpolymerasefidelity.proc.natl.acad.sci.usa113,e2277–e2285(2016).34.patel,s.s.,wong,i.&johnson,k.a.pre-steady-statekineticanalysisofprocessivednareplicationincludingcompletecharacterizationofanexonuclease-deficientmutant.biochemistry30,511–525(1991).35.olson,a.c.,patro,j.n.,urban,m.&kuchta,r.d.theenergeticdifferencebetweensynthesisofcorrectandincorrectbasepairsaccountsforhighlyaccuratednareplication.j.am.chem.soc.135,1205–1208(2013).36.perera,l等人，requirementfortransientmetalionsrevealedthroughcomputationalanalysisfordnapolymerasegoinginreverse.proc.natl.acad.sci.usa112,e5228–e5236(2015).37.yount,r.g.adenylylimidodiphosphateandguanylylimidodiphosphatemethodsenzymol.38,420–427(1974).38.johnson,k.a.conformationalcouplingindnapolymerasefidelity.annu.rev.biochem.62,685–713(1993).39.kadina,a.p等人，twoscaffoldsfromtwoflips:(α,β)/(β,γ)ch2/nh“met-im”analoguesofdttp.org.lett.17,2586–2589(2015).40.nakamura,t.,zhao,y.,yamagata,y.,hua,y.j.&yang,w.watchingdnapolymerasemakeaphosphodiesterbond.nature487,196–201(2012).41.gao,y.&yang,w.captureofathirdmg2+isessentialforcatalyzingdnasynthesis.science352,1334–1337(2016).42.vyas,r.,reed,a.j.,tokarsky,e.j.&suo,z.viewinghumandnapolymeraseβfaithfullyandunfaithfullybypassanoxidativelesionbytime-dependentcrystallography.j.am.chem.soc.137,5225–5230(2015).43.batra,v.k等人，magnesium-inducedassemblyofacompletednapolymerasecatalyticcomplex.structure14,757–766(2006).44.beard,w.a.&wilson,s.h.purificationanddomain-mappingofmammaliandnapolymeraseβ.methodsenzymol.262,98–107(1995).45.freudenthal,b.d等人，uncoveringthepolymerase-inducedcytotoxicityofanoxidizednucleotide.nature517,635–639(2015).46.beard,w.a.,shock,d.d.,batra,v.k.,prasad,r.&wilson,s.h.substrateinduceddnapolymeraseβactivation.j.biol.chem.289,31411–31422(2014).47.otwinowski,z.&minor,w.processsingofx-raydiffractiondatacollectedinoscillationmode.methodsenzymol.276,307–326(1997).48.adams,p.d等人，phenix:acomprehensivepython-basedsystemformacromolecularstructuresolution.actacrystallogr.dbiol.crystallogr.66,213–221(2010).49.emsley,p.&cowtan,k.coot:model-buildingtoolsformoleculargraphics.actacrystallogr.dbiol.crystallogr.60,2126–2132(2004).50.gabbara,s.,和peliska,j.a.(1996)catalayticactivitiesassociatedwithretroviralandviralpolymerases.methodsenzymol.275,276-310。当前第1页12当前第1页12