针对癌症特异性抗原对T淋巴细胞的筛选的制作方法

相关申请的交叉引用本发明要求2017年10月6日提交的美国临时专利申请62/569,215的优先权权益，所述临时专利申请以引用的方式并入本文中。本文中提供了鉴定识别t细胞受体的癌症特异性抗原的方法和具有抗原特异性细胞毒活性的t细胞受体工程化t细胞。
背景技术：
：癌症免疫疗法通过加强患者自身的抗肿瘤免疫应答来治疗癌症。具体地说，免疫检查点抑制剂的成功突显了抗癌免疫活性在癌症患者中的重要性。然而，只有少数的患者展现出来自抗免疫检查点治疗的临床益处，而70％-80％的癌症患者没有从这类治疗得到益处或益处极小。因此，重要和紧急的是确定免疫疗法抗性机制并研发出进一步增强和提高免疫应答的方法(参考文献1；以引用的方式整体并入)。虽然细胞毒性t淋巴细胞(ctl)在癌症免疫疗法中起关键作用，但对ctl的t细胞受体(tcr)以及其靶标癌症特异性抗原的鉴定是艰难又费时的。技术实现要素：本文中提供了鉴定识别tcr的癌症特异性抗原的方法和具有抗原特异性细胞毒活性的tcr工程化t细胞。在一些实施方案中，本文提供了包括以下的方法：(a)用包含候选抗原序列的刺激肽刺激靶淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)；(b)用结合于候选肽的t细胞受体(tcr)捕获免疫活性淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)，其中所述捕获包括使所述免疫活性t淋巴细胞与捕获试剂接触，所述捕获试剂展示与包含候选抗原序列的捕获肽结合的主要组织相容性复合体(mhc)；以及(c)对所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分进行测序。在一些实施方案中，靶淋巴细胞是从健康供体获得。在一些实施方案中，靶淋巴细胞为cd8+细胞毒性t淋巴细胞。在一些实施方案中，刺激在体外(例如在细胞培养物中)进行。在一些实施方案中，包含候选抗原序列的肽为致癌抗原和新抗原的全部或片段。在一些实施方案中，候选抗原序列为致癌抗原和新抗原的全部或片段。在一些实施方案中，捕获试剂为mhc多聚体。在一些实施方案中，mhc多聚体为mhc右旋多聚体(dextramer)。在一些实施方案中，测序包括下一代测序技术。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的cdr3。在一些实施方案中，靶淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)为靶淋巴细胞群体，其中刺激肽为包含不同候选抗原序列的刺激肽群体中的一种肽；并且其中所述捕获包括使免疫活性t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)群体与捕获试剂接触，所述捕获试剂展示与包含候选抗原序列的捕获肽群体结合的主要组织相容性复合体(mhc)。在一些实施方案中，本文提供了通过本文所述的方法鉴定的识别tcr的癌症特异性抗原(例如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38、seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43、seqidno:44等)。在一些实施方案中，本文提供了包括以下的方法：(a)用包含候选抗原序列的刺激肽刺激靶淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)；(b)用结合于候选肽的t细胞受体(tcr)捕获免疫活性t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)，其中所述捕获包括使所述免疫活性t淋巴细胞与捕获试剂接触，所述捕获试剂展示与包含候选抗原序列的捕获肽结合的主要组织相容性复合体(mhc)；(c)对所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分进行测序；以及还包括：(d)产生展示所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分的工程化t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)，其中工程化t淋巴细胞识别展示与包含候选抗原序列的肽结合的mhc的抗原呈递细胞。在一些实施方案中，工程化t淋巴细胞为cd8+细胞毒性t淋巴细胞。在一些实施方案中，产生展示所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分的工程化t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)包括：(i)将编码所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的部分的核酸序列克隆至载体中；(ii)将载体引入宿主t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)中；以及(iii)在使所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的部分在工程化t淋巴细胞上表达和展示的条件下培养。在一些实施方案中，tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链。在一些实施方案中，tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的cdr3。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含选自由seqidno:45-132组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程化t淋巴细胞展示包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列对的α和β链(例如cdr3)的tcr：seqidno:45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88、89和90、91和92、93和94、95和96、97和98、99和100、101和102、103和104、105和106、107和108、109和110、111和112、113和114、115和116、117和118、119和120、121和122、123和124、125和126、127和128、129和130以及131和132。在一些实施方案中，将载体引入至来自健康供体宿主的宿主t淋巴细胞中。在一些实施方案中，将载体引入至来自有待用工程化t淋巴细胞治疗的癌症患者的宿主t淋巴细胞中。在一些实施方案中，本文提供了通过本文所述的方法产生的工程化t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)。在一些实施方案中，工程化t淋巴细胞为cd8+细胞毒性t淋巴细胞。在一些实施方案中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的工程化t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)。在一些实施方案中，本文提供了包括以下的方法：(a)用包含候选抗原序列的刺激肽刺激靶淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)；(b)用结合于候选肽的t细胞受体(tcr)捕获免疫活性t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)，其中所述捕获包括使所述免疫活性t淋巴细胞与捕获试剂接触，所述捕获试剂展示与包含候选抗原序列的捕获肽结合的主要组织相容性复合体(mhc)；(c)对所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分进行测序；以及还包括：(d)产生包含所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的序列的全部或一部分的治疗性抗体。在一些实施方案中，tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链。在一些实施方案中，tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的cdr3。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含选自由seqidno:45-132组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗性抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列对的cdr3：seqidno:45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88、89和90、91和92、93和94、95和96、97和98、99和100、101和102、103和104、105和106、107和108、109和110、111和112、113和114、115和116、117和118、119和120、121和122、123和124、125和126、127和128、129和130以及131和132。在一些实施方案中，抗体为抗体片段。在一些实施方案中，本文提供了通过本文所述的方法产生的抗体。在一些实施方案中，抗体为抗体片段。在一些实施方案中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗体。本文中的实施方案被描述为利用cd8+细胞毒性淋巴细胞作为靶细胞和/或用于产生工程化cd8+细胞毒性淋巴细胞。然而，在本文范围内的其它实施方案中，本文所述的靶细胞和/或工程化淋巴细胞可代之以包含cd4+辅助淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、树突状细胞作为靶细胞。附图说明图1a-c.foxm1和ube2t来源的肽特异性ctl的诱导和建立的ctl的细胞毒活性。(a)只有当暴露于用foxm1或ube2t特异性肽刺激的c1r-a24细胞时才证实foxm1和ube2t特异性ctl产生ifn-γ。r/s比率指示应答细胞(ctl)/刺激细胞(c1r-a24细胞)比率。(b、c)foxm1(b)和ube2t特异性ctl(c)对hla-a*24:02阳性sw480细胞发挥显著的细胞杀死作用，但对hla-a*24:02阴性hcc1143细胞或bt549细胞无作用。两种ctl(2×105个细胞/孔)都与癌细胞(2×104个细胞/孔)共同孵育5小时。图2a-b.针对foxm1和ube2t的tcr工程化t细胞的产生。(a)foxm1和ube2t特异性ctl的tcra和tcrbcdr3克隆型的分布呈现于具有cdr3序列的圆饼图中。黑色指示低于1％的读取频率的cdr3克隆型部分。这个群体仅仅含有一个对tcra和tcrb呈显性的克隆型。(b)通过针对cd8和tcrvβ8(foxm1tcr工程化t细胞)或tcrvβ13(ube2ttcr工程化t细胞)染色来检查转导效率。流式细胞术图表示foxm1或ube2t-tcr工程化t细胞。图3a-h.针对foxm1和ube2t的tcr工程化t细胞的细胞毒活性。(a、b)针对foxm1(a)和ube2t(b)的tcr工程化t细胞对hla-a*24:02阳性sw480细胞发挥显著的细胞杀死作用，但对hla-a*24:02阴性hcc1143细胞无作用。(c、d)与foxm1(c)和ube2ttcr工程化t细胞(d)共培养的癌细胞活力的时程。两种经过分选的tcr工程化t细胞(4×105个细胞/孔)都与癌细胞(2×104个细胞/孔)共同孵育20小时。(e、f)在elispot测定中对用在有或无foxm1(e)或ube2t特异性肽(f)下进行脉冲处理时的c1r-a24细胞刺激的针对foxm1和ube2t的tcr工程化t细胞的识别。经过分选的tcr工程化t细胞(5×104个细胞/孔)与经过肽脉冲处理的刺激细胞(2×104个细胞/孔)在96孔板中在37℃下共同孵育20小时。(g、h)在与癌细胞共培养后的0小时、2.5小时和5小时，颗粒酶b和穿孔素从原始特异性ctl或tcr工程化t细胞分泌的蛋白水平。图4.癌细胞中的foxm1和ube2t蛋白表达。通过蛋白质印迹分析(westernblotanalysis)检查hla-a*24:02阳性或阴性癌细胞系中内源性foxm1和ube2t蛋白的表达。定义本文中使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，而不是意图限制本文所述的实施方案的范围。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同的含义。但是，万一发生矛盾，将以包括定义在内的本说明书为准。因此，在本文所述的实施方案的上下文中，以下定义适用。如本文和随附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚规定，否则单数形式“一个(a/an)”和“所述”包括多个提及物。因此，举例来说，提及“一个工程化淋巴细胞”是对一个或多个工程化淋巴细胞和本领域的技术人员已知的其同等物等的提及。如本文所用，术语“包含”和其语言变体表示存在所叙述的特征、要素、方法步骤等，不排除另外的特征、要素、方法步骤等的存在。相反地，术语“由……组成”和其语言变体表示存在所叙述的特征、要素、方法步骤等，并且除通常相关的杂质外，排除任何未叙述的特征、要素、方法步骤等。短语“基本上由……组成”表示存在所叙述的特征、要素、方法步骤等和实质上不影响组合物、系统或方法的基本性质的任何另外的特征、要素、方法步骤等。本文中的许多实施方案使用开放性“包含”语言描述。这类实施方案涵盖多个封闭的“由……组成”和/或“基本上由……组成”的实施方案，可替代地使用这类语言要求或描述这些实施方案。如本文所用，“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜伊红白血球、肥大细胞、树突状细胞、嗜中性白血球等)和由这些细胞中的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)引起选择性靶向、结合、破坏、摧毁和/或从受试者消除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织或者癌细胞或其它异常细胞的作用。本文中的一些实施方案包括在受试者中产生免疫应答以治疗癌症。如本文所用，术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其它方式改变免疫应答的方法治疗或预防疾病或疾患。本文中的一些实施方案包括免疫疗法。如本文所用，术语“过继性免疫疗法”和“过继性细胞转移”是指用于治疗癌症或感染性疾病的免疫活性细胞(例如tcr工程化t细胞)转移(june,c.h.编辑,2001,cancerchemotherapyandbiotherapy:principlesandpractice,lippincottwilliams&wilkins,baltimore；vonderheide等人,2003,immun.research27:1-15；以引用的方式整体并入)。本文中的一些实施方案包括过继性免疫疗法。如本文所用，术语“癌症疫苗”是指引起特异性免疫应答的组合物(例如肿瘤抗原)。所述应答是通过施用所述癌症疫苗从受试者自身的免疫系统引起的。如本文所用，术语“天然免疫细胞”是指天然存在于受试者的免疫系统中的免疫细胞。例示性实例包括(但不限于)t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞和树突状细胞。本文中的一些实施方案包括在受试者中引起对受试者天然免疫细胞的应答。如本文所用，术语“工程化免疫细胞”是指进行基因修饰的免疫细胞(例如t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、树突状细胞等)。本文中的一些实施方案包括产生和/或施用工程化免疫细胞。如本文所用，术语“t细胞受体”(“tcr”)是指在t细胞(t淋巴细胞)的表面上发现的负责识别与抗原呈递细胞的主要组织相容性复合体(mhc)结合的抗原片段的分子复合体。tcr与抗原肽之间的结合具有相对较低的亲和力并且是简并的：也就是说，许多tcr识别相同抗原肽，并且许多抗原肽被同一tcr识别。tcr是由两个不同的蛋白质链组成的异源二聚体。在95％人t细胞中，tcr由α(α)链和β(β)链(分别由tra和trb编码)构成，而在5％t细胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)链(分别由trg和trd编码)构成。当tcr与抗原性肽和mhc啮合时，t淋巴细胞通过信号转导而激活。本文中的一些实施方案包括产生工程化tcr，制备展示工程化tcr的细胞，和/或向受试者施用展示工程化tcr的细胞以治疗癌症。如本文所用，术语“人白细胞抗原”(“hla”)是指人中的主要组织相容性复合体(mhc)蛋白或编码所述人类mhc蛋白的基因复合体。如本文所用，术语“抗体”是指全抗体分子或其片段(例如如fab、fab'和f(ab')2的片段)，其可为多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。如本文所用，当抗体或其它实体“特异性识别”或“特异性结合”抗原或表位时，其在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别所述抗原，并且结合所述抗原或表位的亲和力比对未展示所述抗原或表位的其它实体基本上更高。关于此，“基本上更高的亲和力”意指亲和力足够高而能够使用所需测定或测量仪器检测到与实体相区别的抗原或表位。典型地，其意指具有至少107m-1(例如>107m-1、>108m-1、>109m-1、>1010m-1、>1011m-1、>1012m-1、>1013m-1等)的结合常数(ka)的结合亲和力。在某些这类实施方案中，抗体能够结合不同的抗原，只要不同的抗原包含所述特定表位即可。在某些情况下，举例来说，来自不同物种的同源蛋白质可包含相同表位。本文中的一些实施方案包括产生和/或施用结合致癌抗原和/或新抗原的抗体。如本文所用，术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，包括抗原结合区或可变区的至少一部分。抗体片段包括(但不限于)fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、fd、双功能抗体和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其它抗体片段。参见例如hudson等人(2003)nat.med.9:129-134；以引用的方式整体并入本文中。在某些实施方案中，抗体片段是通过由重组dna技术产生的完整抗体的酶催化或化学裂解(例如抗体的木瓜蛋白酶消化和胃蛋白酶消化)或者通过化学多肽合成而产生。举例来说，“fab”片段包含一条轻链，和一条重链的ch1和可变区。fab分子的重链无法与另一重链分子形成二硫键。“fab'”片段包含一条轻链，和包含在ch1与ch2域之间延伸的额外恒定区的一条重链。在fab'片段的两条重链之间可形成链间二硫键，从而形成“f(ab')2”分子。“fv”片段包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。单链fv(scfv)片段包含由柔性连接子连接的重链和轻链可变区，从而形成具有抗原结合区的单一多肽链。例示性单链抗体详细地论述于wo88/01649和美国专利no.4,946,778和5,260,203中；以引用的方式整体并入本文中。在某些情况下，单一可变区(例如重链可变区或轻链可变区)能够识别和结合抗原。熟练技术人员将了解其它的抗体片段。本文中的一些实施方案包括产生和/或施用结合致癌抗原和/或新抗原的抗体片段。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指作为特异性结合于相同表位的基本上均质的抗体群体的一员的抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤分泌。在某些这类实施方案中，杂交瘤根据本领域的技术人员已知的某些方法产生。参见例如kohler和milstein(1975)nature256:495-499；以引用的方式整体并入本文中。在某些实施方案中，单克隆抗体使用重组dna方法产生(参见例如美国专利no.4,816,567)。在某些实施方案中，单克隆抗体是指从噬菌体展示文库分离的抗体片段。参见例如clackson等人(1991)nature352:624-628；和marks等人(1991)j.mol.biol.222:581-597；以引用的方式整体并入本文中。修饰词“单克隆”指示从基本上均质的抗体群体获得的抗体特性，并且不将产生抗体的方法限制于特定方法。关于各种其它的单克隆抗体产生技术，参见例如harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanual(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.)；以引用的方式整体并入本文中。本文中的一些实施方案包括产生和/或施用结合致癌抗原和/或新抗原的单克隆抗体。术语“抗原结合位点”是指能够特异性结合抗原的抗体的一部分。在某些实施方案中，抗原结合位点由一个或多个抗体可变区提供。术语“表位”是指能够特异性结合于免疫球蛋白或t细胞或b细胞受体的任何多肽决定子。在某些实施方案中，表位为抗体特异性结合的抗原区域。在某些实施方案中，表位可包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基组。在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特性(例如“构象”表位)和/或特定的电荷特征。如果具体抗体特异性结合于两个表位，那么一个表位被定义为与另一个表位“相同”。在某些实施方案中，具有不同的一级氨基酸序列的多肽可包含相同的表位。在某些实施方案中，相同的表位可具有不同的一级氨基酸序列。如果不同的抗体竞争特异性结合于某一表位，那么称这些抗体结合于相同表位。如本文所用，术语“序列同一性”是指两个聚合物序列(例如肽、多肽、核酸等)具有相同的单体子单元序列组成的程度。术语“序列相似性”是指两个聚合物序列(例如肽、多肽、核酸等)具有相似的聚合物序列的程度。举例来说，相似的氨基酸是共享相同的生物物理学特征并且可分组成各家族(参见上文)的氨基酸。“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)通过以下来计算：(1)在比较窗口(例如较长序列的长度、较短序列的长度、指定窗口等)上比较两个最佳比对的序列；(2)确定含有相同(或相似)单体(例如两个序列中存在相同氨基酸，两个序列中存在相似氨基酸)的位置数目，得到匹配位置的数目；(3)将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(例如较长序列的长度、较短序列的长度、指定窗口)；以及(4)将结果乘以100，得到序列同一性百分比或序列相似性百分比。举例来说，如果肽a和b都是20个氨基酸长并且在除1位以外的所有位置处都具有相同的氨基酸，那么肽a和肽b具有95％序列同一性。如果非同一位置处的氨基酸共享相同生物物理学特征(例如都是酸性的)，那么肽a和肽b将具有100％序列相似性。再举一例，如果肽c是20个氨基酸长并且肽d是15个氨基酸长，并且肽d中15个氨基酸中的14个与肽c的一部分的氨基酸同一，那么肽c和d具有70％序列同一性，但肽d与肽c的最佳比较窗口具有93.3％序列同一性。在本文中为了计算“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)，比对序列中的任何空位都当做所述位置上的错配。在一些实施方案中，本文中的肽或多肽包含与基础序列最低的序列同一性。术语“有效剂量”或“有效量”是指剂、例如抗体引起患者中症状减少或产生期望生物学结果的量。在某些实施方案中，有效剂量或有效量足够治疗或减少疾病或疾患的症状。如本文所用，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”是指将药物、前药或其它剂或治疗剂给予受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官的动作。例示性人体施用途径可通过脑部蛛网膜下的空间，或脊髓(鞘内)、眼睛(经眼)、口腔(经口)、皮肤(体表或经皮)、鼻(经鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(经颊)、耳朵、直肠、阴道、通过注射(例如静脉内、皮下、肿瘤内、腹膜内等)等等。除非另外指示，否则术语“治疗”涵盖治疗性和防治性/预防性措施。需要治疗者包括(但不限于)已经患有具体疾患的个体以及处于患上具体疾患或病症的风险下的个体(例如具有遗传或表观遗传倾向的个体；基于年龄、性别、生活方式等)。术语“治疗”是指向受试者施用剂以达成治疗和/或防治/预防目的。“治疗剂”是指可在体内施用以引起治疗和/或防治/预防作用的剂。“治疗性抗体”是指可在体内施用以引起治疗和/或防治/预防作用的抗体。如本文所用，术语“共同施用(co-administration”)”和“共同施用(co-administering)”是指向受试者施用至少两种剂或疗法。在一些实施方案中，共同施用两种或更多种剂或疗法是并行的。在其它实施方案中，第一剂/疗法在第二剂/疗法前施用。本领域的技术人员了解，使用的各种剂或疗法的配制和/或施用途径可变化。共同施用的适当剂量容易由本领域的技术人员确定。在一些实施方案中，当共同施用剂或疗法时，相应的剂或疗法的施用剂量低于适合其单独施用时的剂量。因此，在共同施用剂或疗法降低可能有害的(例如有毒的)剂的必需剂量的实施方案中和/或当共同施用两种或更多种剂经由共同施用另一剂使受试者对一种剂的有益作用敏感时，共同施用是特别合乎需要的。如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂(例如结合剂)与惰性或活性运载体的组合，使得组合物特别适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。如本文所用，术语“药学上可接受”或“药理学上可接受”是指当施用于受试者时基本上不会产生不良反应，例如有毒、过敏或免疫应答的组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的运载体”是指标准药物运载体中的任一种，包括(但不限于)磷酸盐缓冲生理盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种类型润湿剂、任何及所有溶剂、分散介质、包衣、十二烷基硫酸钠、等张和吸收延迟剂、崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)等等。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于运载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如martin,remington'spharmaceuticalsciences,第15版,mackpubl.co.,easton,pa.(1975)，以引用的方式整体并入本文中。如本文所用，术语“健康供体”是指未患任何形式癌症和/或用于本文中的实施方案中的细胞/组织未显示任何癌症征象(例如癌症形态、癌症生物标志物等)的哺乳动物，例如人。具体实施方式本文提供了鉴定识别tcr的癌症特异性抗原的方法和具有抗原特异性细胞毒活性的tcr工程化t细胞。肿瘤或血液循环中预先存在的识别癌症特异性抗原(致癌抗原和新抗原)的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)起到实现对癌症免疫疗法的有益临床应答的关键作用。举例来说，较高数目的体细胞突变可能增加产生较大数目的可被具有高细胞溶解活性的淋巴细胞识别的免疫原性新抗原的概率，这可能被免疫检查点抑制剂进一步放纵(参考文献2-5；以引用的方式整体并入)。此外，在癌细胞中较高表达水平的程序性死亡-配体1(pd-l1)上调，程序性死亡-配体1与t细胞中的程序性死亡-1(pd-1)相互作用，并且是良好临床应答的生物标志物(参考文献4、6-8；以引用的方式整体并入)。此外，对过继性til转移疗法作出应答的患者中的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)包括靶向新抗原与致癌抗原(共享抗原)的ctl(参考文献9；以引用的方式整体并入)。为了增强ctl介导的抗肿瘤免疫应答以进一步改良癌症免疫疗法的临床结果，本文中的实施方案利用癌症特异性抗原、致癌抗原和新抗原作为疫苗来激活癌症患者中的抗原特异性ctl。致癌抗原是源自于在癌细胞中高度表达但除睾丸或胎儿器官外在正常器官中不表达的致癌蛋白的免疫原性肽(参考文献10；以引用的方式整体并入)。已经预期，源自于致癌抗原的免疫原性肽表位诱导致癌抗原特异性ctl并且提高癌症患者的预后(参考文献11-13；以引用的方式整体并入)。新抗原是源自于癌细胞中非同义突变的免疫原性肽(参考文献10；以引用的方式整体并入)。考虑到新抗原特异性t细胞显示优良临床结果的一些证据(参考文献14-15；以引用的方式整体并入)，新抗原疫苗提供了一种进一步激活患者中的抗癌免疫应答的选择。然而，因为利用疫苗疗法诱导足够数目的抗肿瘤t细胞常常非常缓慢地进行并且需要数个月，所以这种疫苗方法对于具有大的肿瘤负荷的患者来说不起作用。因此，对癌症抗原特异性t细胞受体(tcr)的鉴定、使用自体同源t淋巴细胞产生tcr工程化t细胞以及在有/无抗免疫检查点抗体下输注这类基因工程化t细胞为宿主免疫系统常常显著地受到抑制的晚期肿瘤患者提供了有吸引力的选择。临床前研究和近来的临床试验已经显示鼓舞人心的结果，即致癌抗原/新抗原特异性tcr工程化t细胞对于大尺寸的实体瘤更有效(参考文献16-18；以引用的方式整体并入)。本文提供了鉴定识别新抗原的tcr序列的快速筛选法和个性化tcr工程化t细胞疗法的快速制备。在研发本文中的实施方案期间进行实验，以建立检测致癌抗原/新抗原特异性tcr的快速筛选法。在体外用候选肽刺激来自健康供体的cd8+t淋巴细胞后，在每种肽下使用hlai类右旋多聚体来分选cd8+t细胞，并测定这些细胞的tcr序列。通过刺激表位肽实现独特t细胞的单克隆或低克隆扩增。将tcrcdna克隆并产生tcr工程化t细胞。通过这种方法，产生两种抗原特异性cd8+t细胞克隆；识别源自于foxm1和ube2t的致癌抗原的两种t细胞克隆展现了对表达靶蛋白的hla匹配的癌细胞的强细胞毒活性，但对hla不匹配的癌细胞未展现细胞毒活性。本文所述的方法允许在获得抗原肽后快速鉴定识别tcr的癌症特异性抗原。所述方法允许快速研发出用于治疗癌症的个性化t细胞免疫疗法。本文提供了一种鉴定识别tcr的癌症特异性抗原以及建立具有抗原特异性细胞毒活性的tcr工程化t细胞的渠道，它是将t细胞的体外新抗原刺激、右旋多聚体分选和使用下一代测序仪进行tcr测序一体化。在研发本文中的实施方案期间进行实验，以研发出一种从对假定的源自致癌抗原/新抗原的肽进行筛选到从健康供体的外周血单核细胞(pbmc)诱导特异性t细胞以及建立抗原特异性tcr工程化t细胞的渠道。在整个渠道中，源自免疫原性致癌抗原/新抗原的肽被鉴定为可用于癌症疫苗中，并且鉴定出致癌抗原/新抗原特异性tcr，这引起抗原特异性tcr工程化t细胞的建立，以观察针对hla匹配的癌细胞的细胞毒活性。作为pbmc的来源，来自健康供体的pbmc允许检测用于致癌抗原/新抗原特异性ctl的候选者，因为其具有来自癌症患者的不同的t细胞谱系。从健康供体获得的t细胞拓宽了新抗原特异性t细胞的反应性，并且能够靶向尚未被患者自身的免疫系统识别的新抗原(参考文献30；以引用的方式整体并入)。在一些实施方案中，在鉴定识别tcr的癌症特异性抗原后，由来自患者的自体同源t细胞建立tcr工程化t细胞并作为过继性细胞转移疗法输注。使用本文所述的方法使用来自hla-a*24:02阳性健康供体的pbmc产生的tcr工程化t细胞只识别hla-a*24:02限制肽，并且对hla-a*24:02匹配的癌细胞显示显著的细胞毒活性。考虑到使用自体同源pbmc的靶向hla-a*02:01限制的源自ny-eso-1的肽的tcr工程化t细胞在骨髓瘤患者中显示鼓舞人心的临床应答(参考文献21；以引用的方式整体并入)，值得注意的是本文中来自健康供体的tcr工程化t细胞也对hla-a匹配的癌细胞发挥细胞毒活性。这些结果证明例如在不可能从患者获得自体同源t细胞的情况下从健康供体制备tcr工程化t细胞的可行性。本文所述的渠道提供了对致癌抗原与新抗原都作出应答的个性化免疫疗法。鉴于一些致癌抗原在许多癌症类型中常常过度表达，靶向致癌抗原的tcr工程化t细胞疗法是合理的，因为所鉴定的识别特异性致癌抗原的tcr可广泛用于具有相同hla基因型的患者。举例来说，肿瘤组织中升高的foxm1或ube2t表达与乳腺癌、结肠癌和前列腺癌患者的不良存活相关(参考文献31-34；以引用的方式整体并入)。因此，在一些实施例中，本文所述的foxm1和ube2t特异性tcr工程化t细胞可用于过继性转移疗法。鉴于当前嵌合抗原受体(car)t细胞疗法和tcr工程化t细胞疗法的临床益处只限于血液学恶性病(参考文献35-36；以引用的方式整体并入)，本文中呈现的针对致癌抗原特异性tcr工程化t细胞的渠道为实体瘤提供了另一种过继性细胞转移疗法。相比之下，新抗原对癌细胞具有更大特异性，并且被认为是有吸引力的免疫靶标，不过其呈现取决于癌细胞的体细胞突变。考虑到新抗原特异性til的转移疗法已经不仅针对黑色素瘤，而且还针对实体瘤显示出鼓舞人心的临床结果(参考文献14-15；以引用的方式整体并入)，本文所述的针对新抗原的tcr工程化t细胞为临床背景提供了一种疗法。在一些实施方案中，本文提供了用于鉴定免疫活性tcr的序列的方法，所述方法包括用包含候选抗原序列的刺激肽刺激靶淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)。在一些实施方案中，刺激肽是在癌症和/或肿瘤细胞上表达的蛋白质的片段。在一些实施方案中，刺激肽是癌症特异性抗原和/或肿瘤特异抗原的片段。在一些实施方案中，靶t淋巴细胞是从任何合适的来源(例如供体、细胞培养物等)获得。在一些实施方案中，靶t淋巴细胞是从健康供体获得。在一些实施方案中，靶t淋巴细胞为cd8+细胞毒性t淋巴细胞。在一些实施方案中，刺激在体外(例如在细胞培养物中)进行。在一些实施方案中，通过靶t淋巴细胞的类型来确定细胞培养物的类型。所属领域中了解适用于用刺激肽培养t淋巴细胞和刺激t淋巴细胞的条件和方法。在一些实施方案中，靶淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)为靶t淋巴细胞群体，并且刺激肽为包含不同候选抗原序列的刺激肽群体中的一种肽；并且其中所述捕获包括使免疫活性t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)群体与捕获试剂接触，所述捕获试剂展示与包含候选抗原序列的捕获肽群体结合的主要组织相容性复合体(mhc)。在一些实施方案中，靶淋巴细胞为cd8+细胞毒性淋巴细胞、cd4+辅助淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、树突状细胞等。在一些实施方案中，包含候选抗原序列的刺激肽为致癌抗原和新抗原的全部或片段。在一些实施方案中，候选抗原序列为致癌抗原和新抗原的全部或片段。在一些实施方案中，刺激肽包含随机氨基酸序列，并且本文中的方法允许鉴定能够引起免疫应答的肽。在一些实施方案中，刺激肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38、seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43和seqidno:44。在一些实施方案中，在用刺激肽刺激靶t淋巴细胞后，捕获具有与刺激肽结合的t细胞受体(tcr)的免疫活性t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)。在一些实施方案中，捕获包括使免疫活性t淋巴细胞与捕获试剂接触，所述捕获试剂展示与包含候选抗原序列的捕获肽结合的主要组织相容性复合体(mhc)。在一些实施方案中，捕获试剂展示包含刺激肽中的一种或多种肽的序列的肽。在一些实施方案中，肽以与mhci复合体结合的形式加入t淋巴细胞中。在一些实施方案中，捕获试剂为mhc多聚体。在一些实施方案中，mhc多聚体为mhc右旋多聚体。举例来说，肽可呈递至与mhc右旋多聚体结合的t淋巴细胞。在一些实施方案中，mhc右旋多聚体为与右旋糖主链结合的荧光标记的mhc多聚体。多聚体mhc结构的使用具有呈递肽的多个拷贝，从而提高捕获可能性的优点。在一些实施方案中，在捕获免疫活性t淋巴细胞后，对所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分进行测序。在一些实施方案中，测序包括下一代测序技术。下文更详细地描述下一代测序技术。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的cdr3。在一些实施方案中，本文提供了通过本文所述的方法鉴定的识别tcr的癌症特异性抗原(例如seqidno:1、seqidno:2等)。在一些实施方案中，通过本文所述的方法鉴定的癌症特异性抗原用作治疗剂，例如癌症疫苗。用于癌症疫苗的递送系统可包括例如脂质体、由胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯或α-生育酚(例如维生素e)制成的系统、或可连接或插入修饰或合成的新抗原的其它两亲性分子。在一些实施方案中，癌症疫苗包含通过本文中的方法鉴定的癌症特异性抗原或其变体。在一些实施方案中，癌症特异性抗原作为融合肽提供。在一些实施方案中，并入本文中的方法中所鉴定的多个序列。在一些实施方案中，癌症疫苗中的所用的肽为10-80个氨基酸长(例如10、20、30、40、50、60、70、80或之间的范围)。在一些实施方案中，本文提供了治疗性抗体，所述治疗性抗体结合于本文所述的识别tcr的癌症特异性抗原。在一些实施方案中，本文中的治疗性抗体为抗体片段。所属领域中非常了解用于治疗癌症的抗体和抗体片段。在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，治疗性抗体结合于包含选自由seqidno:1-44组成的组的氨基酸序列的抗原。在一些实施方案中，治疗性抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列对的cdr3序列：seqidno:45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88、89和90、91和92、93和94、95和96、97和98、99和100、101和102、103和104、105和106、107和108、109和110、111和112、113和114、115和116、117和118、119和120、121和122、123和124、125和126、127和128、129和130以及131和132。在一些实施方案中，本文提供了用于产生展示所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分的工程化t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)的方法，其中工程化t淋巴细胞识别展示与包含候选抗原序列的肽结合的mhc的抗原呈递细胞。在一些实施方案中，工程化淋巴细胞为cd8+细胞毒性淋巴细胞、cd4+辅助淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、树突状细胞等。在一些实施方案中，免疫活性t淋巴细胞的tcr序列用于制备编码将识别靶致癌抗原或新抗原的tcr的核酸和/或载体。在一些实施方案中，这类核酸和/或载体转化、转染和/或以其它方式放入t淋巴细胞中以产生工程化t淋巴细胞。用于达成这些目的的核酸、载体和方法是所属领域中已知的，并且描述于本文中。在一些实施方案中，工程化t淋巴细胞为cd8+细胞毒性t淋巴细胞。在一些实施方案中，产生展示所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的全部或一部分的工程化t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)包括：(i)将编码所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的部分的核酸序列克隆至载体中；(ii)将载体引入宿主t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)中；以及(iii)在使所捕获的免疫活性t淋巴细胞的tcr的部分在工程化t淋巴细胞上表达和展示的条件下培养。在一些实施方案中，tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链。在一些实施方案中，tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的cdr3。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含选自由seqidno:45-132组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程化t淋巴细胞展示包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列对的α和β链的tcr：seqidno:45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88、89和90、91和92、93和94、95和96、97和98、99和100、101和102、103和104、105和106、107和108、109和110、111和112、113和114、115和116、117和118、119和120、121和122、123和124、125和126、127和128、129和130以及131和132。在一些实施方案中，将载体引入至来自健康供体宿主的宿主t淋巴细胞中。在一些实施方案中，将载体引入至来自有待用工程化t淋巴细胞治疗的癌症患者的宿主t淋巴细胞中。在一些实施方案中，本文提供了用于产生包含嵌合抗原受体(car)的工程化t淋巴细胞(例如cd8+细胞毒性t淋巴细胞)的方法，其中car识别展示与包含候选抗原序列的肽结合的mhc的抗原呈递细胞。在某些实施方案中，抗原结合域为含有特异性结合于所需抗原的重链及轻链可变区(例如通过本文中的方法鉴定的可变区)的单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，car还包含跨膜域(例如t细胞跨膜域(例如cd28跨膜域))和包含一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的信号传导域(例如t细胞受体信号传导域(例如tcrξ链)。在一些实施方案中，car包含一个或多个共刺激域(例如提供第二信号以刺激t细胞激活的结构域)。本发明不受共刺激域的类型限制。在一些实施方案中，工程化淋巴细胞为cd8+细胞毒性淋巴细胞、cd4+辅助淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、树突状细胞等。在一些实施方案中，免疫活性t淋巴细胞的tcr序列用于制备将识别靶致癌抗原或新抗原的car。在一些实施方案中，编码这类car的核酸和/或载体转化或转染至t细胞中，和/或car以其它方式放入t淋巴细胞中以产生工程化t淋巴细胞。用于达成这些目的的核酸、载体和方法是所属领域中已知的，并且描述于本文中。在一些实施方案中，工程化t淋巴细胞为cd8+细胞毒性t淋巴细胞。在一些实施方案中，car包含含有本文中的方法中所鉴定的tcr-α和/或tcr-β链的序列的抗原结合区。在一些实施方案中，car包含tcr-α和/或tcr-β链的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含tcr-α和/或tcr-β链的cdr3。在一些实施方案中，进行测序的tcr的部分包含选自由seqidno:45-132组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程化t淋巴细胞展示包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列对的α和β链的tcr：seqidno:45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88、89和90、91和92、93和94、95和96、97和98、99和100、101和102、103和104、105和106、107和108、109和110、111和112、113和114、115和116、117和118、119和120、121和122、123和124、125和126、127和128、129和130以及131和132。在一些实施方案中，将载体引入至来自健康供体宿主的宿主t淋巴细胞中。在一些实施方案中，将载体引入至来自有待用工程化t淋巴细胞治疗的癌症患者的宿主t淋巴细胞中。在一些实施方案中，本文中的方法适用于产生工程化淋巴细胞，例如cd4+辅助淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、树突状细胞等。在一些实施方案中，对核酸(例如tcrcdna)进行测序。核酸分子可通过多种技术进行序列分析。分析可鉴定核酸全部或一部分的序列。核酸测序技术的例示性非限制性实例包括(但不限于)链终止子(桑格(sanger))测序和染料终止子测序以及“下一代”测序技术。在一些实施方案中，在测序前rna逆转录成cdna。本领域中已知许多dna测序技术，包括基于荧光的测序方法(参见例如birren等人,genomeanalysis:analyzingdna,1,coldspringharbor,n.y.；以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，利用本领域中了解的自动化测序技术。在一些实施方案中，系统、装置和方法采用分开扩增子的平行测序(kevinmckernan等人的pct公布no：wo2006084132，以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，通过平行寡核苷酸延伸来实现dna测序(参见例如macevicz等人的美国专利no.5,750,341和macevicz等人的美国专利no.6,306,597，两者都以引用的方式整体并入本文中)。测序技术的另外的实例包括church聚合酶克隆(polony)技术(mitra等人,2003,analyticalbiochemistry320,55-65；shendure等人,2005science309,1728-1732；美国专利no.6,432,360、美国专利no.6,485,944、美国专利no.6,511,803；以引用的方式整体并入本文中)、454picotiter焦磷酸测序技术(margulies等人,2005nature437,376-380；us20050130173；以引用的方式整体并入本文中)、solexa单碱基增加技术(bennett等人,2005,pharmacogenomics,6,373-382；美国专利no.6,787,308；美国专利no.6,833,246；以引用的方式整体并入本文中)、lynx大规模平行签名测序技术(brenner等人(2000).nat.biotechnol.18:630-634；美国专利no.5,695,934；美国专利no.5,714,330；以引用的方式整体并入本文中)、adessipcr群落技术(adessi等人(2000).nucleicacidres.28,e87；wo00018957；以引用的方式整体并入本文中)和它们合适的组合或替换方法。一组称为“下一代测序技术”的方法已经作为桑格和染料终止子测序方法的替换方法出现(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；每个以引用的方式整体并入本文中)。下一代测序(ngs)法共享大规模平行高通量策略的常见特征，目标是与早期测序方法相比成本更低且速度更快。ngs法可大体分成需要模板扩增的情况与不需要模板扩增的情况。可用于本文中的实施方案中的测序技术包括例如helicostrue单分子测序(tsms)(harrist.d.等人(2008)science320:106-109)。在tsms技术中，dna样品被裂解成大约100至200个核苷酸的链，并且多聚a序列加入每个dna链的3'末端。每个链通过加入荧光标记的腺苷核苷酸而标记。然后dna链与流动池杂交，流动池含有几百万个的被固定至流动池表面的寡聚t捕获位点。模板可处于约100×106个模板/cm2的密度下。然后流动池负载至测序仪中，并且激光照射流动池的表面，展现每个模板的位置。ccd相机可对模板在流动池表面上的位置进行定位。然后模板荧光标记裂解并冲洗掉。测序反应通过引入dna聚合酶和荧光标记的核苷酸开始。寡聚t核酸用作引物。聚合酶以模板引导方式将标记核苷酸并入至引物中。去除聚合酶和未并入的核苷酸。已经引导荧光标记的核苷酸并入的模板通过使流动池表面成像来检测。成像后，裂解步骤去除掉荧光标记，并且用其它的荧光标记的核苷酸重复所述过程，直到实现所需读段长度。收集在每个核苷酸加入步骤下的序列信息。tsms的进一步描述示于例如lapidus等人(美国专利no.7,169,560)、lapidus等人(美国专利申请号2009/0191565)、quake等人(美国专利no.6,818,395)、harris(美国专利no.7,282,337)、quake等人(美国专利申请号2002/0164629)和braslaysky等人,pnas(usa),100:3960-3964(2003)，各以引用的方式整体并入本文中。可用于本文中的实施方案中的dna测序技术的另一实例为454测序(roche)(margulies,m等人2005,nature,437,376-380；以引用的方式整体并入)。454测序涉及两个步骤。在第一步中，dna被剪切成大约300-800碱基对的片段，并且使片段产生平端。然后寡核苷酸衔接子与片段末端连接。衔接子用作片段扩增和测序的引物。使用例如含有5'-生物素标签的衔接子b将片段连接于dna捕获珠粒、例如经抗生蛋白链菌素涂布的珠粒。连接至珠粒的片段在水包油乳液的液滴内进行pcr扩增。结果为每个珠粒上多个拷贝的克隆扩增的dna片段。在第二步中，珠粒被捕获在孔(皮升尺寸)中。同时在每个dna片段上进行焦磷酸测序。加入一种或多种核苷酸产生光信号，被测序仪器中的ccd相机记录。信号强度与并入的核苷酸的数目成比例。焦磷酸测序利用焦磷酸基(ppi)，它在加入核苷酸时释放。在5'磷酸硫酸腺苷存在下atp硫酸化酶使ppi转变成atp。荧光素酶使用atp将荧光素转变成氧化荧光素，并且这个反应产生光，对光进行检测和分析。可用于本文中的实施方案中的dna测序技术的另一实例为solid技术(appliedbiosystems)。在solid测序中，基因组dna被剪切成片段，并且衔接子连接至片段的5'和3'末端，产生片段文库。可替代地，内部衔接子可通过以下来引入：将衔接子连接至片段的5'和3'末端，使片段成环形，消化环化片段以产生内部衔接子，并且将衔接子连接至所得片段的5'和3'末端以产生末端配对文库。然后，在含有珠粒、引物、模板和pcr组分的微型反应器中制备克隆珠粒群体。在pcr后，使模板变性并富集珠粒以分离出具有延伸模板的珠粒。所选珠粒上的模板经受3'修饰，所述修饰允许结合至载玻片。序列可通过部分随机的寡核苷酸与通过特定荧光团鉴定的中央确定碱基(或碱基对)的连续杂交和连接来测定。在记录颜色后，使连接的寡核苷酸裂解并且去除，然后重复所述过程。可用于本文中的实施方案中的dna测序技术的另一实例为iontorrent测序(美国专利申请号2009/0026082、2009/0127589、2010/0035252、2010/0137143、2010/0188073、2010/0197507、2010/0282617、2010/0300559)、2010/0300895、2010/0301398和2010/0304982；以引用的方式整体并入)。在iontorrent测序中，dna被剪切成大约300-800碱基对的片段，并且使片段产生平端。然后寡核苷酸衔接子与片段末端连接。衔接子用作片段扩增和测序的引物。片段可连接于表面并且以使片段可个别地分辨的分辨率连接。加入一种或多种核苷酸会释放质子(h+)，测序仪器中可检测到此信号并记录。信号强度与并入的核苷酸的数目成比例。可用于本文中的实施方案中的dna测序技术的另一实例为illumina测序。illumina测序是基于在固体表面上使用折回pcr和锚定引物对dna进行扩增。使基因组dna片段化，并将衔接子加入片段的5'和3'末端。将连接至流动池通道表面的dna片段延伸并进行桥式扩增。片段变成双链，并使双链分子变性。先固相扩增后变性的多次循环可在流动池的每个通道中建立数百万簇的大约1,000拷贝的相同模板的单链dna分子。引物、dna聚合酶和四个荧光团标记的可逆终止的核苷酸用于进行连续测序。在核苷酸并入后，使用激光激发荧光团，并且捕获影像并记录第一碱基的身份。去除来自每个并入的碱基的3'终止子和荧光团并重复并入、检测和鉴定步骤。可用于本文中的实施方案中的dna测序技术的另一实例为pacificbiosciences的单分子实时(smrt)技术。在smrt中，四个dna碱基中的每一个连接于四种不同荧光染料之一。这些染料经磷酸连接。在零模波导(zmw)底部将单一dna聚合酶用单分子的模板单链dna固定。zmw是一种密闭结构，其能够相对于在zmw外迅速扩散(以微秒计)的荧光核苷酸的背景，观测到单一核苷酸通过dna聚合酶的并入。核苷酸并入生长链上花费几毫秒。在此期间，激发荧光标记，并产生荧光信号，并且使荧光标签裂解掉。检测到染料的对应荧光指示哪个碱基并入。重复所述过程。可用于本文中的实施方案中的dna测序技术的另一实例涉及纳米孔测序(sonigv和mellera.(2007)clinchem53:1996-2001；以引用的方式整体并入)。纳米孔是直径为大约1毫微米的小孔。将纳米孔浸入导电流体中并对其施加电位，由于离子传导通过纳米孔而产生轻微电流。流动的电流量对纳米孔的尺寸敏感。当dna分子通过纳米孔时，dna分子上的每个核苷酸不同程度地阻碍纳米孔。因此，当dna分子通过纳米孔时通过纳米孔的电流的变化表示dna序列的一次读取。可用于本文中的实施方案中的dna测序技术的另一实例涉及使用化学敏感场效应晶体管(chemfet)阵列对dna进行测序(例如如美国专利申请公布no.20090026082中所述；以引用的方式整体并入)。在所述技术的一个实例中，可将dna分子放入反应腔室中，并且模板分子可与结合于聚合酶的测序引物杂交。一个或多个三磷酸基在测序引物的3'末端并入新的核酸链中可通过电流变化用chemfet检测出。阵列可具有多个chemfet传感器。在另一个实例中，单核酸可连接于珠粒，并且核酸可在珠粒上扩增，并且个别珠粒可转移至chemfet阵列上的个别反应腔室，其中每个室都具有chemfet传感器，并且可对核酸进行测序。在一些实施方案中，所属领域中了解的其它测序技术(例如ngs技术)或以上技术的替换技术或组合可用于本文中的实施方案中。本文中的某些实施方案包括检测一种或多种生物标志物(例如检测细胞因子(例如ifn-γ)以检测和/或定量免疫应答)。在所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括从生物样品或体外培养物分离一种或多种生物标志物(例如检测细胞因子(例如ifn-γ)以检测和/或定量免疫应答)。在一些实施方案中，提供与生物标志物结合的试剂。这类试剂选自抗体、抗体片段、适体等。在一些实施方案中，检测方法包括酶/底物组合，所述组合产生与生物标志物水平对应的可检测信号(例如使用elisa、蛋白质印迹法、等电点聚焦的技术)。一般地说，酶催化显色底物的化学改变，这可使用各种技术，包括分光光度法、荧光和化学发光来测量。合适的酶包括例如荧光素酶、荧光素、苹果酸脱氢酶、尿素酶、辣根过氧化酶(hrpo)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等等。在一些实施方案中，检测方法为荧光、化学发光、放射性核素或产生测量信号的酶/底物组合的组合。在一些实施方案中，多峰信号传导在生物标志物测定格式中具有独特而有利的特征。在一些实施方案中，使用任何分析方法来检测生物标志物的存在/水平，所述分析法包括单重适体测定、多重适体测定、单重或多重免疫测定、表达谱分析、质谱分析、组织学/细胞学方法等，如下所论述。在一些实施方案中，使用合适的免疫测定来检测/定量生物标志物(例如检测细胞因子(例如ifn-γ)以检测和/或定量免疫应答)。免疫测定法是基于抗体对其相应靶标或分析物的反应，并且可检测样品中的分析物，取决于特定的测定格式。为了提高基于免疫反应性的测定法的特异性和灵敏度，常常使用单克隆抗体和其片段，因为其特异性识别表位。多克隆抗体也已经成功地用于各种免疫测定中，因为与单克隆抗体相比，这些抗体对靶标的亲和力增加。已经设计出用于大量生物样品矩阵的免疫测定。免疫测定格式已经被设计成能提供定性、半定量和定量结果。已经设计出许多免疫测定格式。对于检测分析物来说，elisa或eia可为定量的。这种方法取决于标记与分析物或抗体的连接，并且标记直接或间接包括酶。elisa测试可被格式化用于分析物的直接、间接、竞争或夹心检测。其它方法取决于例如放射性同位素(i125)或荧光的标记。另外的技术包括例如凝集法、浊度测定法、比浊法、蛋白质印迹法、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、luminex测定等等(参见immunoassay:apracticalguide,brianlaw编辑,taylor&francis有限公司出版,2005版；以引用的方式整体并入本文中)。例示性测定格式包括酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定、荧光、化学发光和荧光共振能量转移(fret)或时间分辨-fret(tr-fret)免疫测定。用于检测生物标志物的程序的实例包括生物标志物免疫沉淀，然后是允许尺寸和肽水平差别的定量方法，例如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱法等等。检测和/或定量可检测标记或产生信号的物质的方法取决于标记的性质。由适当酶(在可检测标记为酶的情况下；参见上面)催化的反应的产物可为不限于荧光、发光或放射性的，或其可吸收可见光或紫外光。适合于检测这类可检测标记的检测器的实例包括不限于x射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计和密度计。用于检测的任一种方法可呈允许对反应进行任何合适准备、加工和分析的任何格式进行。这可为例如在多孔测定板(例如96孔或384孔)中或使用任何合适的阵列或微阵列。各种剂的原液可手动或自动制成，并且所有后续移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育、样品读取、数据收集和分析都可以使用市售分析软件、机器人和能够检测可检测标记的检测仪器自动进行。在一些实施方案中，用于本文中的实施方案中的抗原性肽和其序列源自于癌症或肿瘤细胞标志物。这类标志物可选自包括但不限于以下的组：表皮生长因子受体(egfr、egfr1、erbb-1、her1)。erbb-2(her2/neu)、erbb-3/her3、erbb-4/her4、egfr配体家族；胰岛素样生长因子受体(igfr)家族、igf结合蛋白(igfbp)、igfr配体家族(igf-1r)；血小板源性生长因子受体(pdgfr)家族、pdgfr配体家族；成纤维细胞生长因子受体(fgfr)家族、fgfr配体家族、血管内皮生长因子受体(vegfr)家族、vegf家族；hgf受体家族：trk受体家族；蝶素(eph)受体家族：axl受体家族；白细胞酪氨酸激酶(ltk)受体家族；tie受体家族、血管生成素1、2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ror)受体家族；盘状结构域受体(ddr)家族；ret受体家族；klg受体家族；ryk受体家族；musk受体家族；转化生长因子(tgf-α)、tgf-α受体；转化生长因子-β(tgf-β)、tgf-β受体；白细胞介素β受体α2链(il13rα2)、白细胞介素-6(il-6)、1l-6受体、白细胞介素-4、il-4受体、细胞因子受体、i类(促红细胞生成素家族)和ii类(干扰素/1l-10家族)受体、肿瘤坏死因子(tnf)家族、tnf-α、肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族(tntrsf)、死亡受体家族、trail-受体；癌症-睾丸(ct)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α-辅肌动蛋白-4、artc1、断裂点簇集区-艾贝尔森(breakpointclusterregion-abelson，bcr-abl)融合产物、b-raf、半胱天冬酶-5(casp-5)、半胱天冬酶-8(casp-8)、β-链蛋白(ctnnb1)、细胞分裂周期27(cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud-2、延长因子2(elf2)、ets变异基因6/急性骨髓性白血病1基因ets(etc6-aml1)融合蛋白、粘连蛋白(fn)、gpnmb、低密度脂质受体/gdp-l岩藻糖:β-d半乳糖2-α-l岩藻糖基转移酶(ldlr/fut)融合蛋白、hla-a2、mla-a11、热休克蛋白70-2突变(hsp70-2m)、kiaa0205、mart2、黑色素瘤广泛突变1、2、3(mum-1、2、3)、前列腺酸性磷酸酶(pap)、neo-pap、肌球蛋白1类、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、k-ras(kras2)、n-ras(nras)、hras、rbaf600、sirt12、snrpd1、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、磷酸丙糖异构化酶、bage、bage-1、bage-2、3、4、5、gage-1、2、3、4、5、6、7、8、gnt-v(异常n-乙酰基葡糖胺基转移酶v、mgat5)、herv-kmel、kk-lc、km-hn-1、lage、lage-1、黑色素瘤上的ctl识别抗原(camel)、mage-a1(mage-1)。mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-as、mage-a6、mage-a8、mage-a9、mage-a10。mage-all、mage-a12、mage-3、mage-b1、mage-b2、mage-b5。mage-b6、mage-c1、mage-c2、粘蛋白1(muc1)、mart-1/黑色素-a(melan-a)(mlana)、gp100、gp100/pme117(s1lv)、酪氨酸酶(tyr)、trp-1、hage、na-88、ny-eso-1、ny-eso-1/lage-2、sage、sp17.ssx-1、2、3、4、trp2-1nt2、癌胚抗原(cea)、血管舒缓素4、乳腺珠蛋白-a、oa1、前列腺特异性抗原(psa)、前列腺特异性膜抗原、trp-1/、75.trp-2亲脂素、黑色素瘤2中不存在的干扰素诱导蛋白(aim-2)。bing-4、cpsf、细胞周期蛋白d1、上皮细胞粘附分子(ep-cam)、epba3、成纤维细胞生长因子-5(fgf-5)、糖蛋白250(gp250肠道羧基酯酶(ice)、α-胚胎蛋白(afp)、m-csf、mdm-2、muci、p53(tp53)、pbf、prame、psma、rage-1、rnf43、ru2as、sox10、steap1、存活素(bircs)、人端粒酶逆转录酶(htert)、端粒酶、韦尔姆斯氏瘤基因(wilms'tumorgene，wt1)、sycp1、brdt、spanx、xage、adam2、page-5、lip1、ctage-1、csage、mma1、cage、boris、hom-tes-85、af15q14、hca66i、ldhc、morc、sgy-1、spo11、tpx1、ny-sar-35、fthli7、nxf2tdrd1、tex15、fate、tpte、免疫球蛋白个体基因型、本琼氏蛋白(bence-jonesprotein)、雌激素受体(er)、雄激素受体(ar)、cd40、cd30、cd20、cd19、cd33、cd4、cd25、cd3、癌症抗原72-4(ca72-4)、癌症抗原15-3(ca15-3)、癌症抗原27-29(ca27-29)、癌症抗原125(ca125)、癌症抗原19-9(ca19-9)、β-人绒毛膜促性腺激素、1-2小球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇酶、热休克蛋白gp96.gm2、沙格司亭、ctla-4、707丙氨酸脯氨酸(707-ap)、由t细胞4识别的腺癌抗原(art-4)、癌胚性抗原肽-1(cap-1)、钙激活氯离子通道2(clca2)、亲环蛋白b(cyp-b)、人印戒肿瘤-2(hst-2)等。在一些实施方案中，用于本文中的实施方案中的抗原性肽和其序列源自于对癌症/肿瘤细胞具有特异性或主要展示在癌症/肿瘤细胞上(例如可由抗体和/或免疫细胞识别)的细胞表面标志物。在一些实施方案中，本文提供了经过工程化以表达免疫活性tcr的t淋巴细胞。在一些实施方案中，本文提供了经过工程化以表达免疫活性car的t淋巴细胞。工程化细胞可通过本领域中的任何合适方法产生。在一些实施方案中，t淋巴细胞经过工程化以表达/展示通过本文所述的方法(例如刺激、捕获、测序)获得的免疫活性tcr。在一些实施方案中，t淋巴细胞经过工程化以表达/展示通过本文所述的方法(例如刺激、捕获、测序)获得的免疫活性car。在一些实施方案中，本文提供了编码如上所述的免疫活性tcr(或免疫活性car)的核酸和核酸序列和具有这类核酸的细胞。在一些实施方案中，核酸分子为重组核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子为合成的。编码免疫活性tcr和其部分的核酸可包含dna、rna、pna(肽核酸)和它们的杂交物。在一些实施方案中，编码免疫活性tcr和其部分的核酸包含一个或多个调控序列。举例来说，可采用启动子、转录强化子和/或允许诱导本公开的多核苷酸表达的序列。在一些实施方案中，核酸分子由包含允许在细胞中转录核酸分子的嵌合基因的适当载体转录。在一些实施方案中，核酸分子为包含单独或组合的任一上述核酸分子的重组产生的嵌合核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子为载体的一部分。在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述的核酸分子(例如编码免疫活性tcr和其部分)的载体。分子生物学的技术人员已知许多合适的载体，对载体的选择将取决于期望的功能并且包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因工程中常用的其它载体。可使用本领域的技术人员众所周知的方法构建各种质粒和载体；参见例如以下中所述的技术：sambrook等人(1989)和ausubel,currentprotocolsinmolecularbiology,greenpublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.(1989),(1994)；以引用的方式整体并入。可替代地，本公开的多核苷酸和载体在脂质体中复原以递送至靶细胞。克隆载体可用于分离dna的个别序列。相关序列可转移至需要表达具体多肽的表达载体中。典型的克隆载体包括pbluescriptsk、pgem、puc9、pbr322和pgbt9。典型的表达载体包括ptre、pcal-n-ek、pesp-1、pop13cat。在一些实施方案中，载体包含作为可操作地连接于编码免疫活性tcr和其部分的核酸序列的调控序列的核酸序列。技术人员已知这类调控序列(控制元件)并且可包括启动子、剪接盒、翻译起始密码子和用于将插入物引入至载体中的插入位点。在特定实施方案中，核酸分子可操作地连接于允许在真核或原核细胞中表达的所述表达控制序列。在一些实施方案中，载体为病毒载体，例如慢病毒载体或腺病毒相关载体。在一些实施方案中，核酸和/或载体用于细胞中以在所述细胞中表达编码的多肽(例如免疫活性tcr和其部分等)。含有编码本文所述的任一免疫活性tcr的dna序列的核酸分子或载体被引入至细胞中，所述细胞又产生多肽。所叙述的核酸分子和载体可被设计成直接引入或经由脂质体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)引入至细胞中。根据上文，本文提供了获得包含编码本文所述的多肽序列(例如免疫活性tcr和其部分)的核酸分子的载体、特别是基因工程中常用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体的方法。在一些实施方案中，载体为表达载体和/或基因转移或靶向载体。源自于例如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒等病毒的表达载体可用于将多核苷酸和/或载体递送至靶细胞群体。可使用本领域的技术人员众所周知的方法构建重组载体。众所周知的方法将载体转移至宿主细胞中，方法视细胞宿主类型而变化。在一些实施方案中，本文提供了细胞，所述细胞包含经上文所定义的载体(例如编码本文所述的免疫活性tcr)转化或转染的宿主细胞。宿主细胞可通过将上述载体中的至少一种或上述核酸分子中的至少一种引入至宿主细胞中来产生。宿主中至少一种载体或至少一种核酸分子的存在可介导编码上述免疫活性tcr和其部分的基因的表达。引入至宿主细胞中的核酸分子或载体可并入至宿主基因组中或者其可维持在染色体外。在一些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括在允许引入核酸和/或载体的条件下培养上文定义的宿主细胞。在一些实施方案中，本文提供了方法，所述方法包括在允许表达构建体(例如包含免疫活性tcr或其部分)的条件下培养上文定义的宿主细胞。在具体的实施方案中，向受试者(例如原始细胞所获自的受试者、第二受试者等)提供培养细胞。本领域中已知培养具有表达构建体的细胞的条件。在一些实施方案中，根据本文中的实施方案用于工程化的淋巴细胞来自于任何合适的来源。举例来说，淋巴细胞的来源是受试者(例如有待治疗的受试者、健康受试者等)。可从许多来源获得淋巴细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，通过适当的方法获得本文所述的实施方案所期望的特定类型的淋巴细胞(例如细胞毒性t细胞)。在一些实施方案中，通过已知的方法(例如细胞分选)获得表达具体标志物的淋巴细胞。在一些实施方案中，在分离后培养细胞。在一些实施方案中，使用本文所述的方法对细胞进行工程化。在一些实施方案中，单独或呈任何组合的本文中的组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗、核酸分子、载体等)使用标准递送系统和方法并且在至少一些方面，连同药学上可接受的运载体或赋形剂一起施用。在核酸分子或载体的情况下，其可稳定地并入至受试者的基因组中。在一些实施方案中，提供了有关预防、治疗或改善癌症的方法和组合物，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文中所涵盖和/或通过如本文所涵盖的方法产生的本文中的组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗、核酸分子、载体等)的步骤。当施用细胞时，向治疗部位施用工程化细胞或者可集中在治疗部位(例如细胞类型、组织类型等)。可用本文所述的组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法治疗的癌症的非限制性实例包括(但不限于)：来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。此外，癌症可特别属于以下组织学类型，不过其不局限于这些：赘生物，恶性；癌瘤；癌瘤，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管细胞癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管细胞癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病(paget'sdisease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢基质肿瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；和母细胞瘤(roblastoma)，恶性；塞尔托利细胞癌(sertolicellcarcinoma)；莱迪希氏细胞瘤(leydigcelltumor)，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣内恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合瘤，恶性；米勒管混合瘤(mullerianmixedtumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳氏瘤(brennertumor)，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤(kaposi'ssarcoma)；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间胚叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；造釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；造釉细胞性纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；成星形细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚瘤；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞肿瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)；霍奇金氏淋巴瘤；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样真菌病；其它指定非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴细胞性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；骨髓性白血病；嗜碱性细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；原始巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。在一些实施方案中，癌症为黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、胰腺癌(例如腺癌)、乳腺癌、结肠癌、胆囊癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其它恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症为实体瘤癌。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法与一种或多种用于治疗癌症的联合疗法一起采用。在一些实施方案中，一种或多种化学疗法和/或免疫疗法与本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法共同施用。在一些实施方案中，一种或多种化学治疗剂和/或免疫疗法作为联合疗法提供，有或者没有(已知)协同效应。本公开进一步涵盖与经由免疫细胞起作用的其它化合物，例如靶向毒素或其它阻断或功能抗体或化合物的共同施用方案。共同施用的临床方案可涵盖与另一组分的施用同时、在另一组分的施用前或施用后共同施用。具体组合疗法包括化学疗法、放射线、手术、激素疗法或其它免疫疗法类型。目前在本领域中已知许多化学治疗剂，并且可与本发明的化合物组合使用。在一些实施方案中，化学治疗剂选自由以下组成的组：有丝分裂抑制剂、烷基化剂、抗代谢物、插入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生体应答调节剂、抗激素、血管生成抑制剂和抗雄激素。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法与一种或多种化学治疗剂共同施用。用于本文中共同施用的化学疗法包括所有类别的化学治疗剂，例如烷基化剂、抗代谢物、植物碱、抗生素、激素剂和其它抗癌药。特定剂包括例如白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、六甲蜜胺(altretamine)、多西紫杉醇(docetaxel)、赫塞汀(herceptin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、诺消灵(novantrone)、诺雷德(zoladex)、顺铂(cisplatin，cddp)、卡铂(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、甲二氯二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、喜树碱(camptothecin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、放线菌素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博莱霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide，vp16)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、雌激素受体结合剂、紫杉酚(taxol)、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨(fuldarabine)、诺维本(navelbine)、法呢基蛋白转移酶抑制剂(farnesyl-proteintansferaseinhibitors)、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、新长春碱(vincristin)和长春碱(vinblastin)或上述任一剂的任何类似物或衍生物变体以及它们的组合。在一些实施方案中，在本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法施用前、施用期间和/或施用后采用化学疗法。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法与放射线疗法共同施用，所属领域中了解放射线疗法的方法。在一些实施方案中，在本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法施用前、施用期间和/或施用后采用放射线疗法。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法与非免疫性靶向疗法、例如抑制如wnt、p53和/或信号传导通路的剂共同施用。其它实例包括抑制酪氨酸激酶、braf、stat3、c-met，调控基因表达，诱发细胞死亡或阻断血管形成的剂。特定剂的实例包括甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、博舒替尼(bosutinib)、拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefinitib)、埃罗替尼(erlotinib)、替西罗莫司(tensirolimus)、依维莫司(everolimus)、威罗菲尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、伏瑞斯特(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin)、贝沙罗汀(bexarotene)、阿利曲宁(alitrionin)、维生素a酸(tretionin)、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞戈非尼(regorafenib)或卡博替尼(cabozantinib)。在一些实施方案中，在施用工程化淋巴细胞前、施用期间和/或施用后采用非免疫性靶向疗法。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法与免疫疗法共同施用。免疫治疗剂一般依赖于使用免疫效应细胞和分子靶向和摧毁癌细胞。免疫效应子可为例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独抗体可用作疗法效应子，或其可补充其它细胞以实际上实现细胞杀死。抗体还可预防癌症免疫逃避或免疫抑制。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、篦麻毒素a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且只是用作靶向剂。可替代地，效应子可为运载直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。在一些实施方案中，在施用工程化淋巴细胞前、施用期间和/或施用后采用免疫疗法。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法与基因疗法共同施用，其中在施用本文所述的工程化淋巴细胞前、施用后或同时施用治疗性多核苷酸。涵盖多种表达产物，包括细胞增殖诱导剂、细胞增殖抑制剂或程序性细胞死亡调控剂。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法在手术前、手术期间和/或手术后施用。手术包括将所有或一部分的癌组织物理去除、切除和/或摧毁的切除术。肿瘤切除术是指物理去除至少一部分的肿瘤。除肿瘤切除术外，通过手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电切术和显微镜下控制的手术(莫氏手术(mohs'surgery))。进一步预期本文中的实施方案可结合去除表面癌症、癌前期或伴随量的正常组织使用。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法与提高治疗的治疗功效的其它剂共同施用。在一些实施方案中，共同施用的剂被配制成单一剂量和/或组合物。在一些实施方案中，共同施用的剂呈单独剂量和/或组合物。在施用单独剂量和/或组合物的一些实施方案中，剂量和/或组合物同时、连续或在一段时间内(例如<30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或更多时间或之间的任何合适范围)间隔施用。在一些实施方案中，本文中的治疗性组合物(例如工程化淋巴细胞、抗体、疫苗等)和方法作为试剂盒或系统的一部分提供，连同一种或多种另外的组件如说明书、施用装置、另外的治疗剂、诊断剂、研究剂等一起。实验材料与方法肽通过使用标准固相合成方法合成9聚体和10聚体肽，并通过反相高效液相色谱法(hplc)来纯化(参见表1a-e)。肽的纯度(>90％)和身份分别通过分析型hplc和质谱分析来确定。使肽溶于二甲亚砜中，达20mg/ml，并且存储在-80℃下。表1.用于建立肽特异性ctl的肽氨基酸序列表1a.用于建立肽特异性ctl的hla-a*24:02限制肽的清单肽名称氨基酸序列seqidnocdca5-a24-10-232ewaaamnaef1cdh3-a24-10-807dylnewgsrf2foxm1-a24-9-262iytwiedhf3hjurp-a24-9-408kwlispvki4inhbb-a24-9-180lylkllpyv5kif20a-a24-10-66kvylrvrpll6melk-a24-9-87_7neycpggnlf7neil3-a24-9-545ewadlsfpf8rnf43-a24-9-721nsqpvwlcl9sema5b-a24-10-290aydiglfayf10smyd3-a24-9-197qycfecdcf11topk-a24-10-289syqkvielfs12ube2t-a24-9-60rypfeppqi13vangl1-a24-9-443rylsagptl14vegfr1-a24-9-1084sygvllwei15vegfr2-a24-9-169rfvpdgnri16wdhd1-a24-9-844gysntatew17wdrpuh-a24-9-314iyrvsftdf18表1b.用于建立肽特异性ctl的hla-a*02:01限制肽的清单表1c.用于建立肽特异性ctl的hla-a*11:01限制肽的清单肽名称氨基酸序列seqidnocdca1-a11-9-219ktkrlnelk36depdc1v1-a11-9-627msqnvdmpk37kif20a-a11-9-45vvstsledk38mphosph1-a11-10-1546stsfeisrnk39表1d.用于建立肽特异性ctl的hla-a*33:03限制肽的清单肽名称氨基酸序列seqidnocdca1-a33-9-43evlhmiymr40foxm1-a33-9-308wtihpsanr41mphosph1-a33-9-608eftqywaqr42vegfr2-a33-9-114iyvyvqdyr43表1e.用于建立肽特异性ctl的hla-a*03:01限制肽的清单肽名称氨基酸序列seqidnokoc1-a03-10-120avvnvtyssk44细胞系tisi(hla-a*24:02，b淋巴母细胞样细胞系)是从国际组织相容性工作组(internationalhistocompatibilityworkinggroup)购得。t2(hla-a*02:01，b-淋巴母细胞样细胞系)、eb-3(hla-a3/aw32，b-淋巴母细胞样细胞系)、jiyoye(hla-a32，b-淋巴母细胞样细胞系)、sw480(hla-a*24:02，结肠直肠腺癌)、hcc1143(hla-a*31:01，乳腺癌)、bt549(hla-a*02:01，乳腺癌)和c1r(缺乏hla-a和hla-b，b淋巴母细胞)是从美国典型菌种保藏中心(americantypeculturecollection)(rockville,md)购得。所有细胞都根据其相应的保藏者的建议培养。稳定地表达hlai类的c1r细胞的产生除tisi和t2外，经人白细胞抗原(hla)转染的c1r细胞用作刺激细胞。编码hlai类(a*24:02、a*02:01、a*11:01、a*33:03或a*03:01)的开放阅读框的cdna通过pcr来扩增并插入至表达载体中。将c1r细胞用hlai类表达载体转染并在g418(invitrogen,carlsbad,ca)存在下培养14天。将g418抗性单细胞和饲养细胞涂铺至含有补充有g418的培养基的96孔细胞培养板(corning公司,corning,ny)中并进一步培养30天。通过流式细胞术分析来确认转染的hlai类在c1r细胞上的表达。体外ctl诱导单核球源性树突状细胞(dc)用作抗原呈递细胞以诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，其针对在hlai类上呈递的肽作出应答。体外产生dc(参考文献37；以引用的方式整体并入)。通过ficoll-paqueplus(gehealthcare)从健康志愿者的血液分离外周血单核细胞(pbmc)。在含有2％热灭活人血清的aim-v培养基(invitrogen)(aim-v/2％hs培养基)中在1000iu/ml的颗粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(r&dsystems,minneapolis,mn)和1000iu/ml的白细胞介素(il)-4(r&dsystem)存在下培养单核球(pbmc中的粘附细胞)以诱导成dc。在培养七天后，在aim-v培养基中在3μg/ml的β-2-微球蛋白存在下在37℃下用20μg/ml的合成肽对单核球源性dc进行脉冲处理3小时。这些经过肽脉冲处理的dc通过x射线辐照(20gy)灭活，并以1:20比率与通过使用cd8阳性分离试剂盒(thermofisherscientific,carlsbad,ca)从pbmc获得的自体同源的cd8+t细胞混合。这些培养物设定在48孔细胞培养板(corning)中。每个孔含有0.5mlaim-v/2％hs培养基中1.5×104个经过肽脉冲处理的dc、3×105个cd8+t细胞和10ng/mlil-7(r&dsystem)。后天(第2天)，将il-2(novartis)加入培养物中，最终浓度为20iu/ml。在第7天和第14天，用自体同源的经过肽脉冲处理的dc进一步刺激cd8+t细胞。每次以与上述相同的方式制备dc。在第21天通过elispot测定来测试cd8+t细胞的肽特异性ifn-γ产生(参考文献38-39；以引用的方式整体并入)。扩增培养在有限稀释后，使用快速扩增法扩增cd8+t细胞(参考文献40；以引用的方式整体并入)。将eb-3和jiyoye用丝裂霉素c处理并用作饲养细胞。将cd8+t细胞与饲养细胞(每种5×106个细胞)和40ng/ml的抗cd3抗体在25mlaim-v/5％hs培养基中一起培养。次日(第1天)，将3000iu的il-2加入培养物中。在第5天、第8天和第11天将一半体积的培养基更换成新鲜的含有60iu/mlil-2的aim-v/5％hs培养基。在第14天与第16天之间通过elisa测试cd8+t细胞的肽特异性ifn-γ产生(参考文献38-39；以引用的方式整体并入)。肽特异性ifn-γ的检测为了检查cd8+t细胞的肽特异性ifn-γ产生，进行elispot测定或elisa。制备经过肽脉冲处理的t2、tisi或表达hlai类的c1r细胞(1×104个细胞)作为刺激细胞。cd8+t细胞用作应答细胞。根据制造商程序(bdbiosciences,sanjose,ca)进行ifn-γelispot测定和ifn-γelisa。通过延时记录对ctl针对癌细胞的细胞毒活性的评估将ctl和tcr工程化t细胞用il-2(100u/ml)预先处理16小时。在实验前将靶细胞用ifn-γ(100u/ml)预处理48小时。将细胞与1ug/ml钙黄绿素(calcein)am(dojindo,kumamoto,japan)一起孵育30分钟。在用pbs洗涤3次后，将2×104个靶细胞与2×105个foxm1/ube2t特异性ctl或4×105个tcr工程化t细胞混合至lab-tekchamberslide盖玻片无菌16孔(thermoscientific)中。通过倒置显微镜axiovert.a1tl(zeiss,oberkochen,germany)进行延时记录。使用imagej程序(美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth),bethesda,md)定量活细胞和死细胞。t细胞受体测序测定tcr序列(参考文献41；以引用的方式整体并入)。从扩增的或右旋多聚体阳性的t细胞提取总rna。使用smart文库构建试剂盒(clontech,mountainview,ca)合成具有常见的5'-race衔接子的cdna。使用与smart衔接子序列相对应的正向引物和与tcra或tcrb每一者的恒定区相对应的反向引物进行融合pcr，以扩增tcra或tcrbcdna。在使用nextera索引试剂盒(illumina,sandiego,ca)加入具有条型码的illumina索引序列后，通过在miseq(illumina)上300bp双端读段，对制备的文库进行测序。使用tcrip软件分析所得的序列读段(参考文献41；以引用的方式整体并入)。还通过桑格测序使用融合pcr产物作为模板(thermoscientific)确认序列。tcr工程化t细胞tcra与tcrb序列进行密码子优化并克隆至pmp71-pre中(参考文献18、42；以引用的方式整体并入)。为了最大化tcr表达，使用修饰鼠类tcra和tcrb恒定域。产生短暂逆转录病毒上清液并且转导来自供体的pbmc(参考文献18；以引用的方式整体并入)。用抗人tcrβv抗体评估tcr的表达。在适于针对foxm1和ube2t的tcr工程化t细胞的条件下，用apc缀合的抗小鼠tcrβ单克隆抗体(h57-597,ebioscience,sandiego,ca)进行染色，接着根据制造商的说明书，与抗apc微珠(miltenyibiotec,bergischgladbach,germany)一起孵育，只使转导的tcr工程化的t细胞转导。为了增加用未被抗体占据的所需tcr转导的t细胞的数目，条件是基于峰值荧光强度和通过比较抗体稀释的五个不同条件分选的细胞的数目。确定1:2000(0.1ug/ml)和1:4000(0.05ug/ml)比率的抗体染色分别适合针对foxm1和ube2t的tcr工程化t细胞的分选。结果肽特异性ctl诱导对来自表1a-e的hla-a*24:02、hla-a*02:01、hla-a*11:01、hla-a*33:03或hla-a*03:01限制肽具有特异性的ctl克隆。用每种肽的hla右旋多聚体捕获ctl，并且测定这些细胞的tcr序列(肽特异性ctl中tcr的cdr3氨基酸序列参见表2a-e)。使用有或者没有肽的表达hla的细胞，通过elisa测定，针对肽特异性ifn-γ产生评估所有44个ctl克隆。表2.肽特异性ctl中tcr的cdr3氨基酸序列表2a.对hla-a*24:02限制肽具有特异性的ctl克隆的主要cdr3序列的清单表2b.对hla-a*02:01限制肽具有特异性的ctl克隆的主要cdr3序列的清单表2c.对hla-a*11:01限制肽具有特异性的ctl克隆的主要cdr3序列的清单表2d.对hla-a*33:03限制肽具有特异性的ctl克隆的主要cdr3序列的清单表2e.对hla-a*03:01限制肽具有特异性的ctl克隆的主要cdr3序列的清单对癌细胞具有细胞毒活性的foxm1和ube2t来源的肽特异性ctl的诱导诱导对源自于foxm1和ube2t的肽具有特异性的ctl克隆(参考文献19-20；以引用的方式整体并入)。通过干扰素(ifn)-γ酶联免疫斑点(elispot)测定来鉴定高度免疫原性的foxm1和ube2t来源的短肽(例如分别iytwiedhf(seqidno:3)和rypfeppqi(seqidno:13))，这些肽可从健康供体的pbmc诱导hla-a*24:02限制ctl。在通过有限稀释获得ctl克隆后，证实这些foxm1和ube2t特异性ctl在暴露于用特异性肽进行脉冲刺激的表达hla-a*24:02的抗原呈递c1r细胞(c1r-a24细胞)时产生ifn-γ，而在对c1r-a24细胞无肽刺激下未检测到或检测到低的ifn-γ产生(图1a)，这表明建立的foxm1和ube2t特异性ctl特异性识别hla-a*24:02限制肽。在通过蛋白质印迹分析检查癌细胞系中的foxm1和ube2t蛋白水平(图4)后，通过延时记录系统检查foxm1和ube2t特异性ctl针对几种癌细胞系的细胞毒活性。foxm1和ube2t特异性ctl对表达高水平hla-a24以及foxm1与ube2t蛋白的sw480细胞显示极强细胞毒活性。几乎未观察到针对hla-a24阴性癌细胞系hcc1143和bt549细胞的细胞毒性(图1b和1c)。结果清楚表明抗原特异性t细胞针对癌细胞的hla限制性细胞毒活性。foxm1和ube2t特异性tcr工程化t细胞的产生随后，这些foxm1和ube2t特异性ctl的tcra和tcrb链通过用下一代测序进行tcr谱系分析来测序(图2a)。这两个ctl克隆均显示单克隆tcr谱系(图2a)。通过dna测序，针对foxm1-ctl(cacpimwgsnykltf(seqidno:49)和casslrvheqyf(seqidno:50))以及ube2t-ctl(camregrnfnkfyf(seqidno:69)和casslsggpneqff(seqidno:70))鉴定显性tcra和tcrbcdr3克隆型。使用cdna信息构建表达tcr的载体，克隆至慢病毒载体，并产生识别foxm1和ube2t的tcr工程化t细胞。通过tcrvβ特异性抗体测量转导效率(代表性染色数据展示于图2b)。对于测定，仅仅转导tcr转导的细胞。foxm1和ube2t特异性tcr工程化t细胞的细胞毒活性然后评定作为原始ctl克隆，tcr工程化t细胞是否杀死癌细胞，如图1b和1c所示。针对foxm1和ube2t的tcr工程化t细胞对hla-a24阳性sw480细胞发挥显著杀死作用，并且在起始五小时期间使细胞活力降低47.5％和39.3％，但对hla-a24阴性hcc1143细胞无作用(图3a-3d)。当与用相应肽进行脉冲处理的c1r-a24细胞共同培养时，tcr工程化t细胞在elispot测定中显示肽特异性ifn-γ产生(图3e和3f)。参考文献以下参考文献以引用的方式整体并入，其中一些在上文中以编号引用。1.postowma，callahanmk，wolchokjd.immunecheckpointblockadeincancertherapy.jclinoncol.2015；33：1974-82.2.yarchoanm，johnsonba3rd，lutzer，laheruda，jaffeeem.targetingneoantigenstoaugmentantitumourimmunity.natrevcancer.2017；17：209-222.3.rizvina，hellmannmd，snydera，kvistborgp，makarovv，haveljj，leew，y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