用视觉刺激同步脑中Γ振荡治疗痴呆的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求以下每个美国临时申请的优先权权益：于2017年10月10日提交且名称为“neuroprotectiveeffectsofcombinedsensorystimulation”的序列号62/570,250(代理人案卷号mitx-9699/00us)；以及于2017年10月11日提交且名称为“gammaentrainmentbindshigherorderbrainregionsandoffersneuroprotection”的序列号为62/570,929(代理人案卷号mitx-0070/00us)。这些临时申请中的每一个以引用方式全文并入本文。本申请还要求于2018年9月19日提交的名称为“systemsandmethodsforpreventing,mitigating,and/ortreatingdementia,”的pct申请号为pct/us18/51785的优先权，其以引用方式全文并入本文。

政府支持声明

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的资助号rf1ag054321下在美国政府的支持下进行的。美国政府享有本发明的某些权利。

背景技术：

痴呆，包括阿尔茨海默氏病(ad)，是一种以大脑和认知功能下降为特征的破坏性脑病(canter等人，2016年；palop和mucke，2016年)。多种因素促成ad的发病，包括淀粉样-β沉积、过度磷酸化的tau积累、小神经胶质和星形胶质细胞介导的炎症以及神经元和突触的损失(ballatore等人，2007年；huang和mucke，2012年；jacobsen等人，2006年；meyer-luehmann等人，2008年；oakley等人，2006年；ulland等人，2017年；yoshiyama等人，2007年)。

最近的研究越来越多地研究了ad病变的生理学方面，诸如神经元过度兴奋、中间神经元功能障碍、抑制/激发平衡移位、癫痫放电和网络振荡改变(canter等人，2016年；holth等人，2017年；hsia等人，1999年；palop和mucke，2010年；palop和mucke，2016年；verret等人，2012年)。这些发现与在人类ad中观察到的网络异常一致(guillon等人，2017年；koenig等人，2005年；ribary等人，1991年；stam等人，2002年)。ad小鼠模型的最新研究强调，这些变化发生在症状发生前的阶段(gillespie等人,2016年；iaccarino等人,2016年)。先前已显示神经活性的变化会在几种小鼠模型中影响ad病变，诸如淀粉样-β和tau积累(bero等人，2011年；wu等人，2016年；yamada等人，2014年)。鉴于这些观察，已采用多种方法来研究操纵神经元振荡是否可有效改善ad病变(iaccarino等人，2016年；martinez-losa等人，2018年；verret等人，2012年)。

特别地，已发现在包括happ-j20、apoe4、5xfad在内的多种ad小鼠模型中，γ频带(～30-90hz)的振荡减少，但在人类ad患者中也尤为明显(gillespie等人，2016年；guillon等人，2017年；iaccarino等人，2016年；koenig等人，2005年；ribary等人，1991年；stam等人，2002年；verret等人，2012年)。鉴于此，最近的一些研究已经针对了γ振荡，并且他们的发现表明这可能表示缓解ad病变的一种有前途的策略。

在一种先前的方法中，通过在小清蛋白阳性(pv+)中间神经元中表达电压门控的钠通道亚基nav1.1，或通过将nav1.1过表达的中间神经元祖细胞进行脑移植来增加γ振荡，缓解了γ缺陷并降低了happ-j20小鼠中的癫痫样活性和认知下降两者(martinez-losa等人，2018年；verret等人，2012年)。

在第二种方法中，已显示引起强烈的γ频率振荡的pv+中间神经元在40hz的光遗传激活(cardin等人，2009年；sohal等人，2009年)被发现降低淀粉样负荷并增强小神经胶质在5xfad小鼠中的形态学转化(iaccarino等人，2016年)。这种使用40hz视觉刺激的非侵入性方法在降低淀粉样负荷和改变5xfad小鼠的视觉皮层中的小神经胶质方面同样有效(iaccarino等人，2016年)。然而，在该先前研究中，在急性视觉刺激一小时后的24小时，视觉皮层中的淀粉样蛋白水平恢复至基线。然而，该较早的研究发现，将视觉刺激一小时延长至每天一小时，持续七天，不仅降低了淀粉样蛋白水平(可溶和不可溶形式的aβ1-40和aβ1-42)，还降低了6个月大的5xfad小鼠的视觉皮层中的斑块病变(iaccarino等人，2016年)。此外，视觉刺激影响多种细胞类型，包括神经元和小神经胶质，以分别在5xafd小鼠中减少aβ的产生并增强其清除。

技术实现要素：

如在2016年11月23日提交且名称为“systemsandmethodsforpreventing,mitigating,and/ortreatingdementia”的美国专利申请序列号15/360,637中公开的(在此以引用方式全文并入本文)，经由视觉(以及听觉和/或触觉)刺激在大脑中引起同步的γ振荡导致一些脑区中的淀粉样负荷降低和形态变化。然而，发明人已经认识到并理解，仍然需要治疗痴呆和阿尔茨海默氏病的系统和方法，所述系统和方法解决影响多个大脑中枢的全回路疾病，所述大脑中枢对学习和记忆以及其他高级脑功能负有重要责任。

在本公开中，已经证明了用于通过慢性非侵入性视觉刺激在受试者的脑中夹带γ振荡的发明方法和设备，在本文中被称为“使用感觉视觉刺激的γ夹带”(genus)超出了视觉皮层到多个其他脑区(例如，海马体、躯体感觉皮层和前额叶皮层)，同时还增强了跨这些多个脑区的低γ相干性。此外，慢性genus减少了5xfad、p301s和ck-p25小鼠的神经退行性变，并且跨多个脑区都有明显的神经保护作用。收集的数据强调了genus介导的跨脑区的神经元活性的调节如何影响退化神经元中涉及细胞内转运和突触功能的基因和蛋白质。这些结果在genus驱动的γ振荡、跨多个脑区的神经网络的功能性结合、神经保护和受试者的行为表现之间建立了联系。

总而言之，一个发明实施方式涉及一种用于治疗有需要的受试者中的痴呆或阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括：a)非侵入性地向受试者递送具有约30hz至约50hz的频率的慢性视觉刺激，以在受试者的多个脑区(包括至少受试者的前额叶皮层(pfc)和海马体)中夹带同步的γ振荡。

另一个发明实施方式涉及一种用于治疗有需要的受试者中的痴呆或阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括：a)非侵入性地向受试者递送具有约30hz至约50hz的频率的慢性视觉刺激，以在受试者的多个脑区中夹带同步的γ振荡，并改善受试者的多个脑区中的退化神经元中异常修饰的基因和蛋白质。

另一个发明实施方式涉及一种用于治疗有需要的受试者中的痴呆或阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括：a)非侵入性地向受试者递送具有约30hz至约50hz的频率的慢性视觉刺激，以同时在受试者的多个脑区中夹带同步的γ振荡，以显著增加受试者的多个脑区之间具有30hz至50hz之间的频率的γ相干性。

应当理解，前述概念和下面更详细讨论的附加概念的所有组合(假设此类概念并不相互矛盾)被认为是本文所公开的发明主题的一部分。特别地，出现在本公开的结尾处的要求保护的主题的所有组合被认为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可能出现在通过引用并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。

通过查看以下附图和详细描述，其他系统、过程和特征对于所属领域的技术人员将变得显而易见。预期的是将所有此类附加系统、过程和特征包括在本说明书内，在本发明的范围内，并受所附权利要求书保护。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。

本领域技术人员将理解，附图主要是出于说明性目的，并且无意限制本文所述的发明主题的范围。附图不一定按比例绘制；在一些情况下，本文所公开的发明主题的各方面可以在附图中被扩大或放大示出，以促进对不同特征的理解。在附图中，相同的参考特性通常参见例如相同的特征(例如，功能上相似和/或结构上相似的元件)。

图1a至图1j示出了根据公开的发明概念的视觉刺激在受试者的多个脑区中夹带γ振荡超出视觉皮层。

图2a至图2f示出了根据公开的发明概念的慢性40hz(但不是80hz)的视觉闪烁刺激减少了受试者中超出视觉皮层的淀粉样斑。

图3a至图3j示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改善了与阿尔茨海默氏病关联的病变并且显著减少或预防了受试者中的神经退行性变。

图4a至图4q示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激减少了受试者的小神经胶质的炎症应答。

图5a至图5i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改变了神经元中的突触功能和细胞内转运。

图6a至图6i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改变了阿尔茨海默氏病的多个受试者模型中的行为。

图7a至图7i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激在神经退行性变的小鼠模型中夹带γ振荡超出视觉皮层。

图8a至图8i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激减少了5xfad小鼠中超出视觉皮层的与ad关联的病变。

图9a至图9g示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改善了p301s和ck-p25小鼠的与ad关联的病变。

图10a至图10n示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改变了小神经胶质，改善了神经元中的细胞内转运和突触传递。

图11a至图11j示出了根据公开的发明概念的急性和慢性视觉刺激对受试者的影响的行为表征。

图12a至图12c示出了根据公开的发明概念的80hz的慢性视觉刺激不影响5xfad小鼠的morris水迷宫。

具体实施方式

以下是与用于通过结合高级脑区、减少神经退行性变和神经炎症并改善认知功能的视觉刺激来预防、减轻和/或治疗痴呆的系统和方法有关的各种概念及其实施方式的更详细描述。应当理解，可以以多种方式来实现上面介绍的和下面将更详细讨论的各种概念。特定实施方式和应用的实例主要出于说明性目的而提供，以使本领域技术人员能够实践对本领域技术人员显而易见的实施方式和替代方式。

以下描述的附图和示例实施方式并不旨在将本实施方式的范围限制为单个实施方案。通过互换所描述或所示元件的一些或全部，其他实施方式也是可能的。此外，在可以使用已知部件部分或完全实现所公开示例实施方式的某些元件的情况下，在一些情况下，仅描述了此类已知部件的对于理解本实施方式所必需的那些部分，并且省略了对此类已知部件的其他部分的详细描述，以免混淆本实施方式。

在本公开中，我们证明了涉及用慢性非侵入性视觉刺激治疗受试者的发明技术，在本文中被称为“使用感觉视觉刺激的γ夹带”(genus)，解决了与痴呆(包括阿尔茨海默氏病(ad))有关的症状，并影响了视觉皮层以外的脑区的ad病变。在说明性实例中，我们证实了慢性视觉genus在多种神经退行性变小鼠模型中的作用，包括taup301s、ck-p25和较老的5xfad小鼠。我们观察到慢性视觉genus会在多个脑区(包括高级脑区)中夹带γ振荡，并跨这些脑区在低γ频率下引起功能性结合。在我们测试的几种神经退化性疾病小鼠模型中，我们发现慢性视觉genus改善了多种与ad关联的病变，包括淀粉样斑、tau过度磷酸化和脑萎缩，防止了多个高级脑区中神经元和突触密度损失。转录组学和蛋白质组学分析图谱证明，p301s和ck-p25小鼠的退化神经元中异常修饰的涉及膜运输、细胞内转运和突触功能的基因和蛋白质用慢性genus改善或修复，并且小神经胶质的免疫应答降低。鉴于这些广泛的神经保护作用，我们进一步研究了慢性每日genus对认知功能的影响，并证明了ad的多种小鼠模型中的行为任务的改善的表现。总之，我们的结果强调了视觉genus在治疗痴呆(包括ad)受试者中的神经保护功效。

如将在下面详细描述的，进行了一些研究以评估对慢性视觉刺激的多个脑区的影响。视觉刺激通常具有约30hz至50hz的频率，特别注意视觉刺激的频率为或为约40hz。在一些实例中，采用基于发光二极管(led)的装置来递送视觉刺激，并且以占空比为50％的方波电流模式来驱动基于led的装置。然而，应当理解，可采用各种类型的装置(除基于led的装置以外)来在本文所述范围内的各种频率下有效递送视觉刺激。另外，可采用除方波形式以外的波形以及除50％以外的占空比来在本文所述范围内的各种频率下有效产生视觉刺激。

另外，在本文所述的一些研究中采用了各种治疗方案，包括受试者对视觉刺激的暴露时间为每天1小时，并且受试者暴露周期为7天、22天(约3周)和42天(约6周)。然而，应当理解，可采用其他受试者暴露时间和受试者暴露周期来在本文所述范围内的各种频率下递送视觉刺激，并有效治疗痴呆，包括阿尔茨海默氏病。例如，可以以不同的组合和排列使用每天大于1小时的暴露时间(例如，以多个1小时为增量，以更短增量或以更长增量递送)，和/或小于三周、三周至六周之间和大于六周的暴露周期来有效治疗痴呆，包括阿尔茨海默氏病。

下面我们首先提供实验摘要和各自的观察结果，然后是实验方案的其他详细信息，以说明视觉genus对痴呆(包括阿尔茨海默氏病)受试者的功效。

视觉genus影响高级脑区

我们的首要目标是通过进行c-fos免疫组织化学染色作为野生型c57bl/6j小鼠中神经元激活的标志，来确定40hz视觉刺激是否可以调节视觉皮层以外的脑区的神经元活性，或确定其是否局限于视觉皮层(图1a)。采用定制的led装置以50％的占空比在特定频率下递送视觉刺激(例如，对于40hz刺激，开灯12.5ms并关灯12.5ms)(iaccarino等人，2016年；singer等人，印刷中)。使小鼠适应其环境3天，然后暴露于40hz视觉刺激1小时。然后将它们放回它们的笼中1小时，然后将它们处死，收集脑组织，切片，并用c-fos抗体标记。我们发现40hz视觉刺激导致视觉皮层(v1)中c-fos阳性神经元的显著增加(图1a至图1b)，并且还注意到躯体感觉皮层(ss1)、海马区ca1和前额叶皮层的扣带回皮层(cc)区的显著增加(图1a至图1b)。

为了理解40hz视觉刺激可如何改变这些脑区中正在进行的神经活动，我们向c57bl/6j小鼠植入了定制的微型驱动器(钨丝电极；详见方法)以同时记录自由行动的小鼠的v1、ss1、ca1和前额叶皮层(pfc)的扣带回区的局部场电位(lfp)。小鼠被限制在一个小的genus盒子(8x8英寸)中以减少探索行为，并在它们暴露于最初封闭然后每次解除封闭10分钟的40hz视觉刺激下时同时记录来自v1、ss1、ca1和前额叶皮层(pfc)的局部场电位(lfp)(图1a、图7a)。急性40hz视觉刺激显著增加了35-45hz左右的低γ振荡的功率，在v1中在40hz处具有峰值频率(图1c至图1d)，在ca1中具有小但显著的增加(图1c至图1d)，与先前在头部受约束的小鼠中的发现一致(iaccarino等人，2016年)。在ss1和pfc中也观察到了γ功率的小但显著的增加(图1c至图1d)，这与我们在这些区域观察到的c-fos阳性细胞的增加一致(图1b)。

为了评估这些视觉刺激引起的振荡是否能够在视觉皮层下游的脑区中夹带神经元放电，我们向一组c57bl/6j小鼠植入了针对海马区ca1的四极体，以记录单个单元活性。在光被封闭的基线条件下，ca1锥体细胞对低γ(～35-45hz)显示出强锁相，并在峰值处优先放电，与先前的报道一致(bragin等人，1995年；middleton和mchugh，2016年)(图1e)。在40hz的视觉刺激下，虽然没有改变优选相，但引起了各个神经元更牢固的锁相，量化为跨群体的增加的平均所得长度(mrl；在封闭刺激和40hz视觉刺激之间，p＝0.01)(图1f)，表明γ频率视觉刺激用于以时间上更有组织的方式来驱动海马神经元群体。

为了测试genus对受损的神经元系统的适用性，我们使用了几种神经退行性变的小鼠模型来验证我们是否可以通过视觉刺激来引起γ振荡，如在c57bl/6j动物中观察到的。我们利用ck-p25小鼠品系，其中cdk5激活剂p25的表达由兴奋性神经元特异性camkiiα启动子以诱导方式驱动(camkiiα启动子-ttaxteto-p25+gfp)(cruz等人，2003年)。从饮食中停用强力霉素后，ck-p25表现出进行性神经元和突触损失，并伴有认知损害，其在p25诱导至6周时变得严重(cruz等人，2003年)。与这些发现一致，诱导后6周，来自ck-p25小鼠的体内lfp记录显示，在v1、ca1和pfc中，与对照小鼠相比，在35-45hz处的γ光谱功率大大降低(图7b至图7c)。尽管有这些变化，但40hz的视觉刺激仍然能够显著增强v1、ca1和pfc中的γ振荡(图7c)。我们进一步检查了taup301s小鼠，这些小鼠表达高水平的人源化突变体与微管关联的蛋白tau，并在5个月大时就具有与额颞叶痴呆关联的tau聚集体(yoshiyama等人，2007年)。在v1和pfc中以40hz视觉刺激时，具有突触和神经元损失和认知缺陷的8个月大的p301s小鼠表现出增强的γ功率(图7d至图7e)。这些结果表明，genus足以在ad小鼠中夹带γ振荡，而与这些小鼠的神经元损害的特定模式无关。

为确保即使在延长的时间段后多次暴露于视觉刺激下仍能够夹带γ振荡，我们采用慢性genus方案，将c57bl/6j和p25诱导的ck-p25小鼠暴露于40hz视觉刺激下42天(1小时/天)(图7f、图7h)。在第43天，从v1、ss1、ca1和pfc记录的lfp跨c57bl/6j小鼠的所有区域显示出显著增强的40hzγ功率，与单个试验性急性genus应用一致(图7f)。以类似的方式，ck-p25小鼠在第43天(现在是p25诱导后85天)也导致v1、ca1和pfc中的低γ功率增加(图7h)。这些结果以及c-fos免疫染色数据表明，急性和慢性40hz视觉刺激不仅募集视觉皮层，还募集其他高级皮层，包括ca1、ss1和pfc。

由于40hz视觉刺激(急性和慢性)同时增强了v1、ss1、ca1和pfc的40hz功率，因此我们还证明了genus可以协调视觉皮层与这些其他高级脑结构之间的神经元活性。我们使用加权相滞后指数(wpli)方法计算了在40hz视觉刺激期间在有光以及没有光被封闭的情况下跨这些脑区的相干性，这使通过体积传导的潜在污染最小化(vinck等人，2011年)。我们跨位于v1-ca1、v1-ss1、v1-pfc、ca1-ss1和ca1-pfc中的电极对分析了c57bl/6j小鼠中的lfp。在有光以及没有光被封闭的情况下，在40hz视觉刺激期间，平均速度无显著差异，从而消除了运动活动的任何潜在差异。急性40hz视觉刺激显著增加了视觉皮层与其他检查的脑区之间，特别是v1-ca1、v1-ss1和v1-pfc之间的30–50hz低γ相干性(与被封闭的光时段相比)(图1g、图1h)。

为了评估慢性genus对跨更宽脑结构的协调性神经元振荡的长期影响，我们将wpli分析应用于从c57bl/6j和p25诱导的ck-p25小鼠的v1、ss1、ca1和pfc收集的lfp，该小鼠暴露于视觉刺激下1小时/天，持续42天。我们观察到，与光封闭条件相比，在40hz视觉刺激期间，v1和ca1(图7g)之间以及v1-ss1、v1-pfc和ca1-pfc之间的30–50hz低γwpli显著增加(图7g)。类似地，在慢性genus之后，与光封闭条件相比，ck-p25小鼠在v1-ca1、ca1-pfc和v1-pfc之间的30–50hz低γwpli也表现出显著增加(图7i)。总体而言，这些数据表明40hz视觉刺激增强了小鼠多个高级皮层中的局部(40hz夹带)以及协调性区域间神经振荡活动(30–50hz低γwpli)。然而，重要的是确定我们观察到的变化是否特定于低γ频率刺激。为了测试这一点，我们将c57bl/6j小鼠暴露于以50％的占空比递送的80hz视觉刺激下，以确保小鼠接受与我们的40hz刺激实验类似的光强度和暴露持续时间(图1i)。与刺激前的时段相比，我们观察到在80hz视觉刺激期间，视觉皮层中的80hz频谱功率没有明显变化(在这里我们观察到40hzgenus的功率增加最大)(图1i、图1j)。

慢性genus改善了视觉皮层以外的淀粉样斑

iaccarino等人(2016年)证明了急性视觉genus降低了症状前的年轻5xfad小鼠的v1中的淀粉样蛋白水平，而7天的视觉genus不仅降低了淀粉样蛋白水平，还改善了具有更晚期病变的6个月大的5xfad小鼠的淀粉样斑。因此，我们旨在研究11个月大的5xfad小鼠在7天的40hz视觉刺激下是否会影响v1，以及ca1、ss1和pfc中的淀粉样斑病变。为实现这一目标，我们将小鼠引入了genus刺激笼中(图8a)，对它们进行40hz或80hz的视觉刺激(其递送与40hz类似的光量，但不在v1中夹带γ振荡(图1i、图1j))，1小时/天，持续7天，并检查淀粉样斑负荷(图2a)。在40hz视觉刺激下7天后，我们看到视觉皮层中的淀粉样斑减少(图2a、图2b)，但与非刺激小鼠相比，ss1和ca1中均未观察到差异(图2a、图2b)。与lfp分析一致，在80hz视觉刺激下的5xfad小鼠在v1和ca1中均未显示淀粉样斑负荷的变化，而在ss1中则显示适度增加(图2a、图2b)。这些结果显示，在7天的视觉genus后淀粉样斑的减少仅限于v1，并且特定于40hz视觉刺激。

接下来，我们将genus方案延长至22天，从9个月大的5xfad小鼠开始，并在小鼠大约10个月大时量化淀粉样斑(图2c)。我们发现22天的genus显著降低了v1中的淀粉样斑的强度和数量(图2c、图2d和图8b至图8d)，与6个月大的5xfad(iaccarino等人，2016年)和11个月大的5xfad小鼠在7天的genus后淀粉样斑的减少一致(图2a、图2b)。重要的是，22天的genus足以减少前额叶皮层的ss1、ca1和cc区中的斑块强度和数量(图2d、图8b至图8d)。该效果再次特定于40hz刺激，因为与非刺激5xfad小鼠相比，22天的80hz刺激不改变5xfad小鼠的v1、ss1和ca1中的淀粉样斑(图2e、图2f)。

我们选择对5xfad小鼠从9个月大时开始应用长期genus，因为先前的研究已显示，在5xfad模型中，神经元和突触标记物的进行性损失始于大约9个月大时(oakley等人，2006年)。与这些研究一致，我们观察到与年龄匹配的野生型同窝仔相比，10个月大的5xfad小鼠的ca1和cc中的神经元计数均显著减少(图8c、图8e)。相反，接受22天的genus的5xfad小鼠除了减少淀粉样负荷(图2c、2d和图8b至图8d)之外，还显示出与非刺激小鼠相比显著减少的神经元损失(图8e)。类似地，虽然我们观察到非刺激5xafd小鼠的ca1和cc中的bassoon(突触标记物蛋白)点的显著损失，但22天的慢性genus减少了突触损失(图8f、图8g)。慢性genus之后减少的神经退行性变和淀粉样病变不是改变的app转基因表达的结果，因为与非刺激对照相比，我们在接受genus的小鼠中未检测到全长app蛋白的表达差异(图8h、图8i)。这些结果证明，慢性视觉genus导致5xfad小鼠的多个脑区中的淀粉样斑负荷的减少，以及神经元和突触的损失减少。

慢性genus减少神经退行性变

为了进一步探索慢性genus在影响疾病病变和减少神经元损失方面的潜力，如在5xfad小鼠中看到的(图8c、图8e)，我们接下来研究了taup301s和ck-p25神经退行性变的小鼠模型。在8个月大时，taup301s小鼠表现出明显的神经病变(yoshiyama等人，2007年)。因此，我们研究了一组taup301s小鼠，并从7个月大开始对它们进行22天的1小时/天的无刺激或genus，并在大约8个月大时检查它们的tau磷酸化水平和与tau关联的病变(图3a至图3e以及图9a、图9b)。我们观察到，与野生型纯种同窝仔(野生型纯种)相比，taup301s小鼠的v1、ss1、ca1和cc中的s202/t205残基处的tau磷酸化程度更高(图3a、图3b)。然而，与非刺激p301s小鼠相比，接受慢性genus的taup301s小鼠具有显著降低的s202/t205tau磷酸化程度(图3a、图3b)。在ad小鼠和p301s小鼠中，tau蛋白在多个残基处被过度磷酸化(hanger等人，2007年；wang等人，2013年；foidl和humpel，2018年；kimura等人，2018年)，并因此利用非偏ser/thr(s/t)磷酸化蛋白质组学方法来检查genus刺激可影响tau磷酸化的程度。与野生型纯种同窝仔相比，我们在taup301s小鼠中识别出被过度磷酸化的46个s/t残基和被去磷酸化的单个残基(s451)(图3c)。我们的分析还表明，慢性genus减少了tau蛋白在6个s/t位点的磷酸化，并增加了s451的磷酸化，表明genus影响了多个位点的tau磷酸化(图3c)。

接下来，我们表征了taup301s小鼠的神经元损失，并且如先前报道的，它们显示出v1、ca1、ss1和cc中的神经元数量的显著减少，如通过neun阳性细胞的数量进行量化的(图3d、图3e)。从7个月大(开始出现神经元损失的时间点)接受22天的genus的taup301s小鼠，与非刺激对照相比，在我们检查的所有脑区中显示出显著减少的神经元损失(图3d、图3e)。接下来，我们检查了脑重量和侧脑室大小，并且观察到野生型非刺激和genus刺激的p301s小鼠之间没有差异(图9b)。

接下来，我们转向ck-p25模型，因为它们显示出ad样病理特征，诸如在p25诱导6周后脑萎缩、皮层收缩和脑室异常扩张(cruz等人，2003年)。为了检查慢性genus可以改善这些异常的程度，我们同时在ck-p25小鼠中诱导p25达6周，同时还将它们每天暴露于1小时的genus(图3f)。与ck纯种同窝仔相比，非刺激ck-p25小鼠显示出显著减少的脑重量和皮层厚度(camkiiα启动子-tta；cruz等人，2003年)(图3g)。与非刺激ck-p25小鼠相比，在p25诱导期间的慢性genus显著减少了皮层变薄，但没有显著改变脑重量(图3g和图9d)。在人类ad和ck-p25转基因模型中，皮层收缩与脑室扩张紧密相关(cruz等人，2003年)，并且我们还观察到接受慢性genus的ck-p25小鼠的脑室扩张显著减少(图3h和图9e)。此外，与非刺激对照相比，在p25诱导期间具有慢性genus的ck-p25小鼠在v1、ss1、ca1和pfc的cc区中也具有明显更少的神经元损失(图3i、图3j)。先前已报道，双链断裂(dsb)形式的dna损伤表示ck-p25小鼠神经退行性变的早期标志(kim等人，2008年)。与该发现以及我们的genus介导的神经元死亡的减少一致，我们还观察到v1、ss1和ca1中的dsb显著减少，如通过公认的dsb标记物γh2ax阳性细胞的数量所分析的(图9g)。慢性genus的这些神经保护作用不通过改变突变体中的转基因表达来诱导，因为genus与非刺激组之间的总tau和p25表达(分别在p301s和ck-p25小鼠中)没有差异(图9a、图9c、图9f)。总之，这些发现确定了慢性genus在具有严重神经退行性变的p301s和ck-p25小鼠模型中具有神经保护作用。

慢性genus减少炎症应答

我们还证明，在慢性genus之后，我们在taup301s和ck-p25小鼠中观察到的减少的神经退行性变可由有益的小神经胶质应答部分介导。我们在分别接受了22天和42天的genus刺激的p301stau和ck-p25小鼠以及非刺激p301s和ck-p25小鼠和相应的野生型对照的视觉皮层上进行了无偏rna测序(图4a)。解剖视觉皮层，然后酶消化，通过cd11b和cd45免疫染色来识别小神经胶质，然后使用荧光激活细胞分选术(facs)进行分离，如前所述(mathys等人，2017年)(图10a、图10b)。我们从每只小鼠中分离出35,000个小神经胶质，分别从每只小鼠中提取总rna，并在rna测序之前检查rna的质量。每个样品平均获得28.69百万次读取，其中89.42％已比对。

rna测序表明，与纯种ck小鼠相比，源自非刺激ck-p25小鼠的小神经胶质具有2333个上调的基因(图4a)。接下来，我们进行了基因本体论(go)分析，并观察到上调的基因涉及蛋白质合成、核糖体调节和免疫应答(包括病毒免疫应答、抗原呈递和免疫应答调节)，与先前的报道一致(mathys等人，2017年)(图4b)。通过比较，识别出的2019个下调的基因主要与细胞迁移、细胞形态发生和脉管系统发育有关(图4b)。在慢性genus之后，ck-p25小鼠中的355个基因被上调(与非刺激ck-p25相比)，这些基因与蛋白质合成、有丝分裂细胞周期调节、膜运输和囊泡介导的转运关联，而515个下调的基因主要与gtp酶活性、蛋白水解和免疫应答(包括mhc-1介导的抗原加工呈递和免疫适应性)有关(图4c)。这些结果表明，慢性genus显著影响ck-p25小鼠的小神经胶质功能，使它们炎症性降低，并可能更能够吞噬、迁移和蛋白质降解。

在非刺激taup301s小鼠中，相对于它们的野生型纯种同窝仔，我们发现总共331个上调的基因和292个下调的基因(图10c)。基因本体论(go)分析将上调的基因与蛋白质合成和炎症/免疫应答相关联，而下调的基因与细胞骨架组织、细胞迁移和脑发育更相关(图10d)。与非刺激taup301s小鼠相比，慢性genus(22天)后从taup301s小鼠获得的小神经胶质显示出238个上调的基因和244个下调的基因。在此，上调的基因与细胞分解代谢的蛋白水解、细胞迁移、细胞形态发生和膜运输关联，而下调的基因涉及基因表达、翻译起始和干扰素应答(图10c和图10d)。因此，具有慢性genus的ck-p25小鼠显示出与具有慢性genus的taup301s小鼠明显相似的转录组学变化。结合在一起，我们的小神经胶质特异性转录组学分析表明，慢性genus可以形态学上转化小神经胶质，增强蛋白质降解并降低小神经胶质介导的免疫应答，而不依赖于特定的转基因模型(p301s或ck-p25)以产生疾病状态。

为了进一步验证这些发现，我们使用来自慢性genus后的ck-p25和taup301s小鼠(ck-p25：在p25诱导期间，1小时/天，持续42天；taup301s：22天)以及来自它们各自的非刺激和纯种对照组的脑切片来进行免疫组织化学染色。先前已经描述了ck-p25小神经胶质应答，其中早期应答以增殖增加为特征，而晚期应答的特征在于mhcii类和干扰素途径的升高(mathys等人，2017年)。我们首先使用小神经胶质特异性标记物iba1来进行免疫组织化学和3维渲染，其表明6周诱导的ck-p25小鼠的v1中的小神经胶质数量的显著增加和形态的广泛变化(图4d至图4i和图10e)。与对照组相比，ck-p25动物中的小神经胶质在整体上没有显示出细胞体体积的显著差异(图4f)，但许多小神经胶质显示出更复杂的“丛状”分枝图案(箭头)(图4d；中下图)，其与轴突和终末突触变性关联(jensen等人，1994年；jorgensen等人，1993年)。我们还注意到，大部分小神经胶质显示出没有极化过程(箭头)的细长的杆状主体(图4d、图4i)，已知在大鼠和人类受试者中弥漫性脑损伤后存在的表型(bachstetter等人，2017年；taylor等人，2014年)。另外，与纯种ck对照相比，尽管减少了处理体积(图4g)，但ck-p25中的小神经胶质在物理上彼此更接近，如通过测量小神经胶质之间的最小距离所分析的(图4d、图4h)。这表明其区域的损失，并与静息状态形成对比，在静息状态下，每个小神经胶质细胞通常具有其自身的占据区域，相邻区域之间几乎没有重叠(delrio-hortega，1932年；nimmerjahn等人，2005年)。

与非刺激小鼠相比，慢性genus导致ck-p25小鼠的小神经胶质数量显著减少，尽管其保持高于纯种ck小鼠(图4d、图4e)。慢性genus后小神经胶质的总体积表明较少的收缩，使得与ck-p25和ck纯种组相比没有显著差异(图4g)。重要的是，慢性genus后小神经胶质之间的最小距离与纯种ck动物中的最小距离相当(图4d、图4h)，表明慢性genus保留了小神经胶质区域。最后，在具有慢性genus的ck-p25动物中，尽管杆状小神经胶质的总体积保持显著高于纯种ck组，但其增加显著减少(图4i)。接下来，我们表征了taup301s小神经胶质，并且发现p301s中存在小神经胶质增加的趋势，但在我们的iba1免疫染色中未达到统计学显著性(图4k、图4l)。与野生型纯种小鼠相比，p301s中小神经胶质体的总体积也没有差异(图4k、图4m)。然而，慢性genus后在taup301s小鼠中的小神经胶质过程的总体积与非刺激p301s小鼠显著不同，并且与野生型纯种同窝仔相当(图4k、图4n)。这些结果强调了基线和疾病状况下的小神经胶质状态范围，并且总体表明慢性genus对缓解p301s和ck-p25小鼠中与疾病关联的小神经胶质形态学功能障碍的作用。

接下来，我们检查了go术语，显示免疫应答受慢性genus影响。使用特定于干扰素应答基因cd40的抗体的免疫组织化学表明，与纯种ck小鼠相比，其在ck-p25小鼠中显著升高(图4d、图4j)，与先前的报道一致(mathys等人，2017年)。慢性genus导致ck-p25小鼠的cd40信号强度显著降低，尽管其保持显著高于纯种ck对照(图4d、图4j)。接下来，我们检查了另一个免疫应答基因c1q(经典补体成分)，该基因在我们的小神经胶质特异性rna测序实验中被显著上调，并且先前在ad小鼠模型中与突触损失有关(hong等人，2016年)。与它们各自的纯种对照同窝仔相比，c1q的免疫组织化学显示在非刺激ck-p25和taup301s小鼠的v1中信号升高(图4o、图4p、图4q)。慢性genus显著降低了ck-p25小鼠中c1q的增加，尽管c1q强度保持高于纯种ck水平(图4o、图4p)。在p301s小鼠中，慢性genus减弱c1q的增加，使得野生型纯种小鼠和无刺激p301s小鼠之间没有显著差异(图4o、图4q)。总之，我们的免疫组织化学结果一致表明，慢性genus有助于降低小神经胶质的免疫应答。

慢性genus改变神经元中的突触传递和细胞内转运的调节

接下来，我们分离neun阳性(neun+)神经元核并进行无偏rna测序分析，以研究慢性genus对ck-p25小鼠和taup301s的v1神经元中基因表达的作用(图5a、图5b和图10f至图10g)。在慢性genus(ck-p25：p25诱导42天；taup301s：22天)之后，从小鼠收获视觉皮层。随后通过facs将100,000个神经元核分选到裂解缓冲液中，然后提取rna并测序(图5a、图5b)。与我们对脑重量的发现以及通过使用免疫组织化学对neun和皮层变薄进行量化的发现一致(图3g、图3i和图9d)，我们发现当与纯种ck同窝仔(100±3.87)相比时，非刺激ck-p25小鼠(81.56±3.29)中neun+核的百分比显著降低，这在具有慢性genus的ck-p25小鼠(88.56±4.49)中不明显(图10f、图10h)。类似地，虽然非刺激taup301s小鼠中neun+核的百分比(86.11±2.26)显著低于纯种野生型同窝仔(100±3.87)，但具有慢性genus的taup301s小鼠(96.05±3.99)与野生型小鼠没有差异(图10g、图10h)，与我们的免疫组织化学发现一致(图3e、图3j)。这些结果证明在具有慢性genus的ck-p25和taup301s神经退行性小鼠模型中神经元核的损失减少，并指出genus的总体神经保护作用。

接下来，我们从这些facs分选的神经元rna中进行rna测序。每个样品平均获得18.09和2279百万次读取，其中ck-p25和p301s小鼠分别从85.23％和84.45％比对。neun+核的无偏转录组分析显示，与它们各自的对照小鼠相比，ck-p25(618个基因)和taup301s(351个基因)中被下调的基因比上调的基因(ck-p25：565个基因；taup301s：229个基因)相对更多(图5a、图5b)。与它们各自的非刺激对照相比，慢性genus导致ck-p25(409个上调；422个下调)和taup301s(220个上调；221个下调)中类似数量的上调与下调的基因(图5a、图5b)。

我们随后进行了go分析，以检查与差异化表达基因关联的生物学功能。慢性genus后ck-p25小鼠中的神经元特异性下调基因(618个基因)涉及化学突触传递、细胞内转运、自噬、atp代谢过程、跨突触信号传导和细胞间信号传导(图5a)。有趣的是，genus通过ck-p25小鼠神经元中涉及这些过程的显著上调的基因来拯救了这些生物学过程(图5a；右图)。taup301s中的下调基因(351个基因)涉及化学突触传递、跨突触信号传导、包括囊泡介导的转运的细胞内转运、中脑发育以及凋亡过程的调节(图5b)。从与上调的基因关联的最重要生物学功能揭示了taup301s小鼠的慢性genus后，这些相同的过程—包括囊泡介导的转运、细胞内转运、突触传递、中脑发育和凋亡过程的调节—全部被上调(图5b，和图10i)。另一方面，与我们针对γh2ax的免疫组织化学数据一致，ck-p25和taup301s中的一些生物学过程均被上调(与纯种对照相比)，包括那些涉及dna双链断裂和dsb修复的过程(图9g)。重要的是，慢性genus后ck-p25和taup301s小鼠中下调的基因包括已知对dna损伤应答的凋亡途径必需的那些，与神经元向较少退化状态的转变一致。总之，这些数据表明，即使在两种机制不同的神经退行性变小鼠模型(ck-p25和taup301s)中，基因调制的改变模式也收敛于类似的细胞和生物学功能—包括突触功能的下调、细胞内转运和凋亡调节—最终促进神经元死亡。重要的是，慢性genus后，许多涉及挽救突触传递、突触组织和包括囊泡介导的转运的细胞内转运中的缺陷的基因被上调(图5a、图5b和图10h)。

为了进一步表征和验证这些被慢性genus修饰的生物学过程，我们进行了无偏液相色谱-串联质谱分析(lc-ms/ms)，以检测ck-p25和taup301s小鼠的v1中的蛋白的差异表达和s/t磷酸化(图5c、图5d)。我们首先检查了由质谱识别出的所有蛋白，分别在组合的ck-p25组(纯种ck对照以及具有和不具有genus的ck-p25)和组合的taup301s组(野生型纯种对照以及具有和不具有genus的p301s)中，并将它们与从各自神经元特异性rna序列数据中检测到的所有rna进行比较。我们发现在组合的ck-p25组和组合的taup301s组中分别识别出的总蛋白的92.75％和91.95％，映射到神经元特异性rna测序数据中的表达基因(图5c、图5d)，表明识别出的大多数蛋白质都涉及神经元功能。接下来，我们将ck-p25和taup301s小鼠中的s/t磷酸化蛋白质与它们各自的纯种对照同窝仔进行比较，发现ck-p25和taup301s小鼠中s/t磷酸化蛋白质总体上有所增加(图5c、图5d；左下图)，表明两种神经退行性变小鼠模型中功能蛋白的异常修饰。与它们各自的无刺激对照相比，慢性genus导致ck-p25和taup301s小鼠的蛋白质的s/t磷酸化降低(图5c、图5d；右下图)。与我们的神经元特异性基因表达分析(图5a、图5b)一致，慢性genus修饰的蛋白质涉及化学突触传递、树突发育、长期增强，调节囊泡介导的转运，调节突触中的囊泡介导的转运以及调节细胞内转运(图5e和图10j至图10m)，表明这些过程在退化的神经元中被改变并且被慢性genus改善。

根据我们的磷酸化蛋白质组学分析的与囊泡转运、内吞作用和突触传递有关的一个示例性蛋白质是dynamin1(dnm-1)(armbruster等人，2013年)，其在ck-p25和taup301s中慢性genus后的差异化s/t磷酸化蛋白注释中时与多个go术语关联(图5e)。突触囊泡的内吞作用需要ser774处的磷酸化作用(clayton等人，2009年)，并且是在ck-p25和taup301s小鼠中被过度磷酸化并在慢性genus中减少的许多残基之一。我们进行了免疫组织化学和蛋白质印迹，发现dmn-1ser774磷酸化在ck-p25和taup301小鼠中显著增加，并通过慢性genus减少(图5f和图10m、图10n)。我们还对囊泡谷氨酸转运蛋白1(vglut1)进行了免疫组织化学，其为涉及囊泡和神经递质转运、突触传递以及学习和记忆的另一种蛋白质(balschun等人，2009年)。我们发现与纯种ck小鼠相比，在ck-p25小鼠中vglut1点显著减少(图5g、图5h)，并且在慢性genus后(与非刺激对照相比)在ck-p25小鼠中vglut1表达显著更高，不仅在v1，还在ss1、ca1和pfc的acc区中(图5g、图5h)。类似地，在taup301s小鼠中慢性genus后，跨这些脑区的taup301s小鼠中突触标记物vglut1puncta的表达降低被减轻(图5i)。这些数据与跨两个神经退行性变模型中具有慢性genus的这些脑区的神经元减少(图3d和图3i)和突触损失(图4o、图4p、图4q)一致。

慢性genus改变行为表现

到目前为止，我们的研究结果表明genus可以使v1以外的神经振荡(包括ca1、ss1和pfc)消失，并减少ck-p25和taup301s小鼠中所有这些脑区的ad相关病变，包括淀粉样斑、tau过度磷酸化、突触丢失和神经元丢失。我们的rna测序和磷酸化蛋白质组学数据支持慢性genus减轻与疾病关联的突触传递和细胞内转运缺陷的能力，这些能力与保留的突触功能一致。因此，我们询问慢性genus是否也改善认知功能。我们首先试图确定genus是否触发了任何可能使对任何认知变化的解释复杂化的系统性行为变化。在c57bl/6j小鼠中，在急性genus期间或之后的行进距离中的运动活性没有明显差异(图11a至图11c)。此外，由印防己毒素引起的癫痫发作易感性和新颖的对象辨别都没有改变(图11b至图11c)。用genus长期刺激的所有组的动物(c57bl6：7天；ck-p25：在p25诱导期间，1小时/天，持续42天；taup301s：22天)具有与非刺激对照相当的体重(图11d至图11f)。最后，七天的genus不影响c57bl/6j小鼠中的应激反应标记物血浆皮质酮(图11i)。

为了评估genus的认知优势，在ck-p25小鼠中用genus长期刺激诱导p25表达6周后，我们集中研究了ad的ck-p25小鼠模型中的学习和记忆。在最后一周，将小鼠暴露于旷场(of)，然后进行新颖的对象识别(nor)测试(图6a)。我们的结果表明，genus不影响ck-p25小鼠的焦虑—这通过在旷场场地的中心花费的时间来衡量(图6a、图6b)，也不改变血浆皮质酮水平(图11i)，表明慢性genus不影响ck-p25小鼠的焦虑或压力。有趣的是，genus刺激的ck-p25小鼠虽然在运动活性上未显示出任何差异，但与熟悉的对象相比，其探索新颖的对象花费了显著更多的时间(图6a、图6c和图11g)，表明与非刺激ck-p25小鼠相比，慢性genus改善了ck-p25小鼠中新颖的对象识别。接下来，我们在第6周的genus期间对诱导6周的ck-p25小鼠进行了morris水迷宫(mwm)测试。在mwm测试中，与纯种ck小鼠相比，非刺激ck-p25小鼠显示出受损的空间学习表现为在训练期间寻找平台的更高潜伏期(图6d)。与纯种ck组相比，非刺激ck-p25小鼠也表现出空间记忆受损，如通过平台位置访问次数减少，在探针测试中(最后一个训练日后24小时)在目标象限中花费的时间更少可见(fischer等人，2005年)(图6d)。慢性genus显著改善了这些损伤，并且这些损伤不是改变游泳速度的结果，改变的游泳速度在各组和所有训练日中保持相当(图6d和图11j)。

为了确定这种genus介导的行为表现改善不仅限于认知障碍的单一机制，而且更普遍地适用于ad相关的认知功能下降，我们测试了多只ad模型小鼠。我们对8个月大的taup301s小鼠进行genus持续22天(1小时/天)，并在刺激的第三周对小鼠进行了of和nor任务测试，并将其与年龄匹配的非刺激组进行比较(图6e)。与ck-p25小鼠一样，genus既不改变在of场地的中心花费的时间(图6e、图6f)，也不改变taup301s小鼠的血浆皮质酮水平(图11i)，表明慢性genus不改变taup301s小鼠的类似焦虑的行为。接下来，我们进行了新颖的对象识别测试，并观察到与熟悉的对象相比，野生型纯种和genus刺激的taup301s小鼠对新颖的对象表现出更高的偏好(图6g)。类似地，在非刺激taup301s小鼠中，新的对象偏好更高(图6g)。

接下来，我们在第三周的genus对taup301s小鼠进行了mwm测试。与非刺激taup301s小鼠相比，野生型纯种和genus刺激的taup301s小鼠在mwm训练中表现出显著增加的学习曲线(图6h和图11j)。最后，我们测试了genus对改善ad淀粉样蛋白模型行为的有效性。在第三周的训练期间，我们对genus刺激的5xfad小鼠(22天—1小时/天)进行了mwm测试(图6i)。尽管genus刺激的5xfad小鼠在前四天的mwm训练期间表现出略低的学习曲线，但与野生型同窝仔相比，它们在多项训练试验中均有改善，这与显著受损的非刺激5xfad小鼠相反(图6i和图11j)。最后，采用80hz视觉刺激，我们调查了其他频率的慢性刺激是否可以改变行为。与v1的体内记录类似，在mwm中经历80hz视觉刺激22天的5xfad小鼠与非刺激5xfad对照(量化为在探针测试中寻找平台和目标交叉的潜伏期)相比没有显示出差异(图12a至图12c)。总之，这些结果表明，特别是40hz下的慢性刺激改善神经退行性变的多种小鼠模型中的行为表现。

越来越多的证据支持以下观点：操纵神经网络振荡可表示减轻与神经系统疾病关联的病理变化和行为表现缺陷的有前途的策略(cho等人，2015年；iaccarino等人，2016年；kastanenka等人，2017年；martinez-losa等人，2018年；verret等人，2012年)。在此，我们证明了通过40hz视觉刺激长期每天夹带低γ振荡在夹带γ振荡方面(即使在晚期神经退行性变的情况下)是有效的，以减少多个脑区的神经病变。慢性genus的神经保护作用包括减少小神经胶质介导的炎症应答，增强基因和蛋白质的表达，这些基因和蛋白质促进神经元中突触传递和细胞内转运，并改善行为表现。

慢性视觉genus夹带低γ振荡并增加整个脑区的γ相干性

我们先前显示，在年轻的症状前3个月大的5xfad小鼠中，40hz的急性一小时(1h)视觉刺激夹带神经元活性以在γ频率范围内振荡，并减少ad相关表型(iaccarino等人，2016年)。在本公开中，我们证明了genus在具有神经退行性变的ck-p25和taup301s小鼠模型中，在脑的多个部分—包括视觉皮层(v1)、海马ca1、躯体感觉皮层(ss1)和前额叶皮层(pfc)—显著增加了低γ(～35-45hz)振荡功率，尽管存在严重的ad样病变和神经元损失。运动活性可能是检测γ振荡的一个混杂因素，尽管在封闭和可见的40hz视觉刺激之间的记录阶段期间，我们检测到速度和总行进距离没有差异，使得我们在genus期间观察到的低γ夹带不太可能与活动水平的差异有关。此外，对ca1中单个单元记录的分析表明，genus能够在v1下游的多个脑区中募集神经元激活(另见martorell和paulson等人，随同来文)和加权相位滞后指数(wpli)的测量，其对不相关噪声源的体积电导较不敏感，表明v1、ca1、ss1和pfc显示出增强的低γ相干性，从而与genus在功能上更加耦合。考虑到通过“通过相干性交流(ctc)”对于认知功能必不可少(fries，2015年)，并且不令人惊讶的是，人类ad受试者在皮层间区域相干性方面存在缺陷(stam等人，2009年)。

视觉genus跨多个神经退行性变小鼠模型赋予广泛的神经保护作用

为了确定genus的长期应用是否会影响整个脑区的病变，我们集中研究了视觉皮层和默认模式网络的其他关键结构，诸如前额叶皮层(pfc)的海马体和扣带回部分，其对ad有很大影响。我们首先对老的5xfad小鼠应用七天的genus，然后发现，如iaccarino等人(2016年)所述，尽管v1中淀粉样斑显著减少，但未能改变海马体中的淀粉样蛋白水平(图2a、图2b)。

因此，我们使用具有较严重病变的相对较老的5xfad小鼠(10个月大)将genus方案延长了3周，并发现不仅v1中，而且在脑的包括ss1、海马和pfc在内的其他分布部位中的淀粉样斑负荷得到了显著改善。我们在整个6周p25诱导的ck-p25模型中应用了这种延长的genus方案，并在神经元开始在这些各自的模型中损失的年龄时在taup301s和5xfad小鼠中应用了3周。我们发现它们各自的病变显著降低，包括过度磷酸化的tau蛋白、突触和神经元损失以及dna损伤，不仅减少到v1，而且在ck-p25、taup301s和5xfad小鼠模型的ca1、ss1和cc(额叶前皮层的扣带回部分)中也很明显。genus预防神经元丢失的神经保护作用在ck-p25小鼠模型中尤为明显，该模型通常表现出剧烈的脑萎缩、皮层体积收缩和相应的脑室扩张，而后者在神经元及其扩展过程退化时与人类ad关联。因此，我们证明genus赋予具有不同病变特征的多种小鼠模型广泛的神经保护作用。

视觉genus修改突触功能、细胞内转运和行为

为了在分子水平上检查genus的影响，我们接下来转向无偏转录组学和蛋白质组学分析。我们从分离/纯化的taup301s和ck-p25神经元中获得的数据表明，调节突触功能的多个基因、蛋白和翻译后修饰的蛋白显著失调，这与先前在这些神经退行性变模型中报道的改变的神经元兴奋性和兴奋性/抑制性平衡一致(fischer等人，2005年；yoshiyama等人，2007年)。还已知ad引起树突状脊柱密度降低，并且已证明通过基因操作、组蛋白脱乙酰基酶(hdac)的药理学抑制或光遗传学减轻ad小鼠中的脊柱密度可减轻认知障碍(fischer等人，2007年)；graff等人，2012年；roy等人，2016年)。此外，我们发现慢性视觉genus减轻了ck-p25和taup301s模型中的这些基因表达和蛋白质磷酸化缺陷，并且用特异于突触蛋白(vglut1，bassoon)的标记物进行的免疫组织化学分析证实了与相应对照小鼠相当的突触密度。这些基因表达的变化和突触密度的挽救，以及我们在慢性视觉genus中看到的增强的低γ相干性，提示慢性genus改变了视觉皮层和下游脑区的可塑性。

死后人类ad样品、ad小鼠、ipsc模型和原代培养细胞的研究也涉及ad中细胞内转运、囊泡运输和内体功能的破坏(millecampsandjulien，2013年；small等人，2017年；israel等人，2012年；cataldo等人，2000年)。内吞作用和aβ产生之间的联系已被许多研究充分证明(marks和mcmahon，1998年；cirrito等人，2008年；schobel等人，2008年；wu和yao，2009年)。我们的无偏转录组学和蛋白质组学数据表明，慢性genus在基因表达和蛋白质水平的翻译后修饰中引起对这些细胞内转运、囊泡运输和内吞过程的改变。我们的发现与急性光遗传学驱动的γ振荡后年轻的5xfad小鼠的ca1中增大的早期内体的减少一致(iaccarino等人，2016年)。此外，我们的数据显示，慢性genus减少了p301s和ck-p25神经退行性变的小鼠模型中s774dynamin1的过度磷酸化，这影响了dynamin在内吞作用中的作用(raimondi等人，2011年；armbruster等人，2013年)。

综上所述，我们发现，通过慢性genus增强神经元存活最有可能是通过挽救(或“修复”)涉及调节dna损伤应答、自噬、突触传递、细胞内转运、囊泡运输并减少神经炎症的广泛范围的基因和蛋白质来实现的。支持慢性视觉genus的广泛的神经保护作用，以促进神经元存活并维持神经元功能，我们发现慢性genus后多种小鼠模型的行为表现有所改善，包括改善的ck-p25小鼠的新颖的对象识别和空间morris水迷宫以及增强的taup301s小鼠和5xfad小鼠的空间水迷宫学习和记忆。尽管我们观察到行为表现得到改善，但慢性genus不改变c57bl/6j、ck-p25和p301s小鼠的体重(图11d至图11f)、通过旷场探索引起的焦虑或通过标记物皮质酮测定的应激反应(图11a、图11c、图11g至图11i)。有趣的是，zhang等人(2015年)证明了慢性2hz视觉刺激(每天6小时，持续4周)改善了认知能力，但它并不改变3xtg小鼠的扣带皮层中的aβ1-42。

视觉genus减少神经炎症

炎症过程在ad和神经退行性变中起着至关重要的作用，急性genus先前已显示出引起小神经胶质显著的形态激活(iaccarino等人，2016年)。小神经胶质在神经退行性变中的具体作用是复杂的(因为它可能是有益的或有害的)，有待进一步研究，最近的研究表明，小神经胶质表型可随着疾病进展而变形(mathys等人，2017年；lee等人，2018年；ulland等人，2017年；deczkowska等人，2018年)。在本公开中，我们用免疫组织化学和小神经胶质特异性转录组学分析进行了详细的形态学分析，以更紧密地检查受慢性genus影响的潜在过程。我们发现，尽管慢性genus可改变ck-p25和taup301s小鼠模型的小神经胶质形态、免疫应答和分解代谢过程，但仍存在一系列形态学表型。

首先，iba1免疫染色表明，在ck-p25小鼠中，小神经胶质非常增生(更多的小神经胶质；与mathys等人(2017年)一致)，并趋于聚集，这在慢性genus后会降低。小神经胶质的总体积减少，除了杆状小神经胶质的子集外，在非刺激ck-p25小鼠中，其总的体细胞和原代细胞体积更高，慢性genus减少了这些异常的小神经胶质表型。有趣的是，最近有报道称杆状小神经胶质存在于弥漫性脑损伤的大鼠脑中，以及在遭受颅脑损伤的人类受试者中(bachstetter等人，2017年；taylor等人，2014年)。接下来，小神经胶质进入吞噬状态，以摄取5xfad小鼠的aβ，这种情况发生在几种类型的genus(视觉、听觉或两者的组合)中，小神经胶质的形态变化与淀粉样斑数量减少相关(iaccarino等人，2016年；martorell和paulson等人，随同来文)。此外，小神经胶质的吞噬状态伴随着蛋白质降解的增加(go鉴定为蛋白质分解代谢过程)。最近在神经退行性变和ad的背景下研究了小神经胶质的炎症应答。我们的数据表明，慢性genus减少了ck-p25小鼠的小神经胶质的炎症应答，下调了基因(诸如涉及自适应免疫系统和ii类mhc的那些)，已知这些基因在神经退行性病变中被上调(mathys等人，2017年)。也许是由于这种炎症应答减少的结果，我们看到突触修剪标记物c1q减少(hong等人，2016年)，同时突触标记物vglut1和bassoon的增加也表明了慢性genus突触密度的保持。重要的是要注意，在martorell和paulson等人所附的论文中，证实了慢性听觉genus以及听觉和视觉genus合并后的星形胶质细胞应答和脉管系统变化。

总之，我们的数据表明视觉genus可以传播到前脑的多个区(ss1、ca1、pfc)，并引起多种细胞类型(神经元、小神经胶质、星形胶质细胞)的应答。使用视觉刺激的γ夹带表示非侵入性策略，用于提供保护作用并改善针对神经系统疾病的认知功能。我们发现，慢性视觉genus减少了神经元和突触的损失，并修饰了与突触功能相关的基因和蛋白质，共同支持了我们观察到的行为改善。本公开证明了慢性视觉genus在ad小鼠模型中的神经保护作用，以影响多个脑区和行为中的ad病变，表明genus赋予神经保护的总体功效。

附图的详细描述

图1a至图1j示出了根据公开的发明概念的视觉刺激在受试者的多个脑区中夹带γ振荡超出视觉皮层。

在图1a中，使用arduino系统以50％的占空比递送40hz视觉刺激(开灯12.5ms并关灯12.5ms)。c57bl/6j小鼠在1小时内未受到刺激或受到40hz视觉刺激，之后被处死并对大脑染色以表达c-fos。将微驱动器植入单独的组中以进行体内电生理学检查。

在图1b中，在40μm厚的冠状脑切片中量化c-fos表达以评估神经元活性。代表性c-fos免疫染色图像。比例尺表示50μm。右：与非刺激小鼠相比，40hz视觉刺激显著增加了视觉皮层(v1；n＝4只小鼠/组。独立样本t检验，t＝-7.110，p＝0.002)、躯体感觉皮层(ss1；t＝-5.239，p＝0.006)、海马体(ca1；t＝-4.989，p＝0.008)和前额叶皮层(cc；t＝-2.938，p＝0.01)中的神经元活性标记物c-fos。

在图1c中，记录来自v1、ss1、ca1和pfc的c57bl/6j小鼠lfp的功率谱。红线表明在可见的40hz视觉刺激呈递过程中进行记录，而蓝线表明被封闭的40hz灯闪烁(覆盖led阵列以封闭光；参见方法；n＝7只小鼠)。

在图1d中，由图1c计算出组γ面积功率(40±5hz)。与对照条件(led闪烁被遮挡)相比，40hz视觉刺激显著增加了跨v1(wilcoxon-ranksum,z＝5.9,p＝3.1x10^-9)、ss1(z＝2.4,p＝0.018)、ca1(z＝3.4,p＝6.9x10^-4)和pfc(z＝3.3,p＝9.2x10^-4)的γ功率。

在图1e中，我们将定制的四极体微型驱动器植入c57bl/6j小鼠中，将四极体调整至ca1并分离出单个单元。图表显示了在光封闭和40hz刺激周期内跨40hz相位的尖峰概率。

在图1f中，与光封闭条件(oc.led)相比，40hz视觉刺激显示出显著增加锥体神经元尖峰对局部lfp的锁相强度，如通过平均所得长度(mrl)所分析的(n＝4只小鼠的24个细胞。wilcoxon-ranksum，z＝2.5，p＝0.011)。

在图1g中，使用加权相滞后指数方法(wpli；n＝7只小鼠)量化了结构之间的lfp相干性，指出了记录位点。

在图1h中，示出了与图1g有关的低γ波段(30-50hz)wpli中的组变化。40hz视觉刺激导致v1-ca1(wilcoxon-ranksum,z＝2.2,p＝0.03)、v1-ss1(p＝0.021)和v1-pfc(z＝2.5,p＝0.014)之间的相干性显著增加。

图1i是以50％的占空比(开灯6.25ms并关灯6.25ms)递送80hzled灯的示意图。

图1j，对于左侧，显示了经受光封闭(oc.led)或80hz视觉刺激的c57bl/6j小鼠中v1lfp的功率谱。对于右侧，以80hz(±5hz)为中心的面积功率与80hz视觉刺激无显著差异(n＝5只小鼠，wilcoxon-ranksum检验，z＝1.2，p＝0.22)。

图2a至图2f示出了根据公开的发明概念的慢性40hz(但不是80hz)的视觉闪烁刺激减少了受试者中超出视觉皮层的淀粉样斑。

图2a显示了暴露于无刺激、40hz或80hz视觉刺激下1小时/天，连续7天的5xfad小鼠中的淀粉样斑负荷，如通过d54d2抗体的免疫组织化学染色可见的。在每种情况下，来自v1、ss1和ca1的代表性图像，比例尺表示50μm。

图2b示出了组量化，该组量化显示genus每天1小时，持续7天减少v1中的淀粉样斑，但是它没有显著改变ss1或海马区ca1中的淀粉样斑。80hz的视觉刺激暴露不会改变v1或ca1中的淀粉样斑水平，而显著增加ss1中的淀粉样斑。n＝8只非刺激小鼠和6只小鼠，每只来自40hz和80hz组。组间双向方差分析效应f(2,51)＝5.378，p＝0.0076。bonferroni的事后多重比较，***p<0.001，*p<0.05。

图2c显示了暴露于无刺激或22天(每天1小时)的延长genus方案的5xfad小鼠中淀粉样斑负荷的代表性图像。比例尺表示50μm。

图2d显示了22天的genus显著减少了v1、ss1、ca1和cc中的淀粉样斑。n＝每个条件6只小鼠。组间双向方差分析效应f(1,40)＝51.00，p<0.0001。bonferroni的多重比较测试，***p<0.001，**p≤0.01。

图2e显示了从暴露于无刺激或80hz灯闪烁，每天1小时，持续22天的小鼠观察到的v1、ss1和ca1中淀粉样斑的代表性图像，比例尺表示50μm。

图2f与图2e有关，显示了量化v1、ss1和ca1中淀粉样斑的组数据。n＝每组6只小鼠。发现组间双向方差分析测量f(1,30)＝0.0033，p＝0.9565无显著差异。

图3a至图3j示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改善了与阿尔茨海默氏病关联的病变并且显著减少或预防了受试者中的神经退行性变。

图3a提供了实验概述，其显示了p301s小鼠经受无刺激或genus22天(每天1小时)，随后进行了免疫组织化学和磷酸化蛋白质组学分析。未经历刺激方案的野生型笼同窝仔被认为是野生型纯种小鼠。

图3b提供了显示来自视觉皮层的s202/t205磷酸化tau免疫染色的代表性图像。比例尺50μm。右：p301stau小鼠在v1、ss1、ca1和cc中表现出较高的s202/t205水平，而22天的genus在所有检查的区域中表现出显著降低的s202/t205。n＝7只野生型纯种，8只非刺激p301s小鼠和7只genus刺激的p301s小鼠。组间双向方差分析效应f(2,76)＝45.35，p<0.0001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图3c示出了来自视觉皮层的丝氨酸/苏氨酸磷酸化tau蛋白的磷酸化蛋白质组学分析。热图显示了与野生型小鼠相比，p301s中差异化磷酸化的tau蛋白的s/t残基。组间双向方差分析效应f(2,322)＝2146，p<0.0001。如方法中所述对所有磷酸肽作图。热图中显示的tau的所有s/t残基在野生型纯种和非刺激p301s之间具有统计学意义。图表中显示了非刺激和genus刺激的p301s小鼠之间对特定残基的统计比较(p值)。genus减少了tau蛋白在6个s/t位点的磷酸化，并增加了s451的磷酸化。顶部显示了常见的人类taus/t位点。

图3d显示来自经受无刺激或genus的野生型纯种和p301s小鼠的视觉皮层中的神经元标记物neun的代表性图像。比例尺表示50μm。

图3e显示了组数据，表明与野生型纯种小鼠相比，p301s小鼠显示出v1、ss1、ca1和cc中的神经元显著损失。genus刺激的p301s组显示出显著降低的神经退行性变。n＝与图3b相同。组间双向方差分析效应f(2,76)＝19.73，p<0.0001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图3f提供了实验概述，显示了在ck-p25小鼠中诱导p25表达，持续42天。在一个实验组中，伴有genus，每天1小时，非刺激对照组接收室内照明。未经历刺激方案的ck(camk2α-启动子xtta)笼同窝仔被视为纯种ck小鼠。

图3g是显微照片，显示了诱导后42天的纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间脑的定性差异。右：与纯种ck小鼠相比，ck-p25小鼠表现出减少的脑重量(即脑萎缩)，而慢性genus部分地缓解ck-p25小鼠的脑萎缩。n＝13只纯种ck小鼠，非刺激组和genusck-p25组各10只小鼠。方差分析f(2,30)＝15.46，p<0.001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，****p<0.0001，*p<0.05。

图3h提供了侧脑室的代表性图像和尺寸量化(概述)，比例尺表示1000μm。右：与纯种ck小鼠相比，ck-p25小鼠表现出异常的脑室扩张，其在慢性genus后显著降低。n＝9只纯种ck小鼠和来自非刺激和genusck-p25组中的每组的6只小鼠。方差分析f(2,18)＝12.36，p<0.001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，****p<0.0001，*p<0.05。也参见图9e。

图3i提供来自经受无刺激或genus的纯种ck和ck-p25小鼠的视觉皮层中的神经元标记物neun的代表性图像。比例尺表示50μm。

图3j显示了ck-p25小鼠在v1、ss1、ca1和cc中表现出严重的神经元损失，而慢性genus在ck-p25小鼠中减少了神经元损失。n＝与图3g相同。双向方差分析f(2,72)＝31.38，p<0.0001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，****p<0.001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图4a至图4q示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激减少了受试者的小神经胶质的炎症应答。

图4a涉及ck-p25小鼠，其经受无刺激或genus，每天1小时，持续42天。然后使用荧光激活细胞分选术(facs；使用cd11b和cd45双重阳性标准)从视觉皮层中分离出小神经胶质，然后提取rna并进行测序。差异化表达的基因(deg)在火山图中示出。组比较显示在底部。左：纯种ck和非刺激ck-p25小鼠之间的deg，n＝每组4只小鼠。右：非刺激和genusck-p25小鼠之间的deg，n＝每组4只小鼠。

图4b显示了与所识别的deg相关联的生物过程的所选基因本体论(go)术语。顶部：与纯种ck小鼠相比，go术语与非刺激ck-p25小鼠中的上调(up)基因关联。底部：与纯种ck小鼠相比，go术语与非刺激ck-p25小鼠中的下调(down)基因关联。

图4c显示了与deg关联的选择的go术语。顶部：与非刺激ck-p25小鼠相比，go术语与genusck-p25小鼠中的上调(up)基因关联。底部：与非刺激ck-p25小鼠相比，go术语与genusck-p25小鼠中的下调(down)基因关联。

图4d提供了显示来自视觉皮层的小神经胶质标记物iba1(绿色)和cd40(红色)免疫染色的代表性图像。比例尺50μm。n＝7只纯种ck小鼠，非刺激组和genus组各6只小鼠。箭头和箭头分别指示杆状分支过程和小神经胶质过程的分支体积。

图4e显示了与纯种ck小鼠相比，非刺激ck-p25小鼠表现出更高数量的iba1阳性细胞，慢性genus显著降低了ck-p25小鼠中的iba1细胞密度。方差分析f(2,16)＝17.79，p<0.0001。

在图4f，我们使用imaris进行了小神经胶质的三维渲染，并量化了体细胞的体积和小神经胶质的过程。n＝来自与图4d中相同数量的小鼠的每组73个小神经胶质。小神经胶质体细胞的体积(大小)的频率分布，其在组间未显示出任何统计学显著性(kruskal-wallis检验，h＝0.3529，p＝0.8382)。

图4g显示了非刺激ck-p25小鼠的小神经胶质过程的总体积(不包括杆状小神经胶质)显著低于纯种ck小鼠。与纯种ck小鼠相比，genus刺激的ck-p25小鼠未显示出差异(h＝9.224，p＝0.009)。

图4h示出了小神经胶质之间的最小距离的量化。n＝来自9只纯种ck的68个小神经胶质，来自6只非刺激小鼠的131个小神经胶质和来自6只genusck-p25小鼠的95个小神经胶质。与纯种ck小鼠相比，非刺激ck-p25小鼠中的小神经胶质聚集在一起，而genus显著降低了小神经胶质聚集(h＝100.1，p<0.0001)。

4i示出了杆状小神经胶质的径向初级过程的量化。n＝来自9只纯种ck的16个小神经胶质，来自6只小鼠的每组19个小神经胶质，每只来自非刺激和genusck-p25组。与非刺激ck-p25小鼠相比，genus后ck-p25小鼠中的杆状小神经胶质过程的总体积显著减少。方差分析f(2,51)＝16.27，p<0.0001。

图4j显示了与纯种ck小鼠相比，非刺激ck-p25小鼠表现出更高的干扰素应答蛋白cd40的信号强度，而慢性genus显著降低了ck-p25小鼠中的cd40信号。方差分析f(2,16)＝36.84，p<0.0001。

图4k提供了来自视觉皮层的代表性图像，显示iba1为绿色，核染hoechst为蓝色。比例尺50μm。箭头表明小神经胶质过程的复杂性。

图4l示出了p301stau小鼠显示出iba1阳性细胞总数增加的趋势，但与野生型小鼠相比没有统计学意义。n＝7只野生型纯种，8只非刺激p301s小鼠和7只genus小鼠。方差分析f(2,19)＝2.401，p＝0.1190。

图4m是显示小神经胶质体细胞大小的频率分布图。n＝7只野生型纯种，8只非刺激p301s小鼠和7只genus小鼠。每组总共分析了58个小神经胶质。组间小神经胶质体细胞的总体积没有差异。kruskalwallis检验h＝0.04269，p＝0.9789。

图4n显示了与野生型小鼠相比，p301stau小鼠中的小神经胶质过程的体积较小，而genus刺激的p301s小鼠显示出与野生型小鼠类似的过程长度。kruskalwallis检验h＝7.895，p＝0.0193。

图4o提供了显示从视觉皮层免疫染色的c1q(经典补体途径模拟蛋白)的代表性图像。比例尺50μm。顶部：n＝7只纯种ck小鼠，6只小鼠各自为非刺激和genus刺激的组。底部：n＝7只野生型纯种，8只非刺激p301s小鼠和7只genus小鼠。

图4p显示了与纯种ck小鼠相比，非刺激ck-p25小鼠表现出更高的c1q信号强度，而慢性genus刺激的ck-p25小鼠显示出显著降低的c1q强度。方差分析f(2,16)＝13.39，p＝0.0004。

图4q显示了与野生型纯种小鼠相比，非刺激p301s小鼠表现出更高的c1q信号强度，慢性genus在任何组之间均无差异。方差分析f(2,19)＝6.887，p＝0.005。用bonferroni的校正在e、i、j、l、p方面进行事后多重比较，q****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05，n.s-不显著。

图5a至图5i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改变了神经元中的突触功能和细胞内转运。

在图5a中，ck-p25小鼠经受无刺激或genus，每天1小时，持续42天。使用facs从视觉皮层分离neun阳性神经元核(100,000个)，然后进行rna提取和测序。deg的热图。在热图中指出了每组小鼠的数量。左上：纯种ck和非刺激ck-p25小鼠之间的deg。左下：非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间的deg，右侧指出了基因数量。右：图表显示了与纯种ck小鼠相比，非刺激ck-p25小鼠中与下调的基因关联的生物学过程，以及在genus后的ck-p25小鼠中，与上调的基因关联的相同生物学过程的重叠。

在图5b中，p301s小鼠经受无刺激或genus刺激，每天1小时，持续22天。使用facs从视觉皮层分离neun阳性神经元核(100,000个)，然后进行rna提取和测序。差异化表达基因的热图。在热图中指出了每组小鼠的数量。左上：野生型纯种和非刺激p301stau小鼠之间的deg。左下：非刺激和genus刺激的p301stau小鼠之间的deg，右侧指出了基因数量。右：图表显示了与纯种ck小鼠相比，非刺激p301s小鼠中与下调的基因关联的生物学过程，以及在genus刺激后的p301s小鼠中，与上调的基因关联的相同生物学过程的重叠。

在图5c中，ck-p25小鼠经受无刺激或genus42天。使用tmt10-plex试剂盒和质谱法在视觉皮层组织上进行总蛋白表达和s/t磷酸化蛋白分析。n＝3只纯种ck，3只非刺激ck-p25和4只genus刺激的ck-p25小鼠。顶部：维恩图显示了从神经元特异性rna序列(上述图5b)中识别出的总rna与从lc-ms/ms中识别出的总蛋白的重叠。发现识别出的92.73％的蛋白质在神经元中表达。底部：与对照同窝仔(左)和genus(右)相比，ck-p25小鼠中差异化s/t磷酸化蛋白的火山图。

在图5d中，p301stau小鼠经受无刺激或genus刺激22天。使用串联质谱标签(tmt)10-plex试剂盒(参见方法)和质谱法(lc-ms/ms)在视觉皮层组织上进行总蛋白表达和s/t磷酸化蛋白分析。n＝3只野生型纯种，3只非刺激p301s和4只genus刺激的p301s小鼠。顶部：维恩图显示了从神经元特异性rna序列(上述图5a)中识别出的总rna与从lc-ms/ms中识别出的总蛋白的重叠。发现识别出的91.95％的蛋白质在神经元中表达。底部：与对照同窝仔(左)和genus(右)相比，p301stau小鼠中差异化s/t磷酸化蛋白的火山图。倍数变化为±0.2且调整后的p值<0.05的磷酸化蛋白被认为具有统计学意义。

图5e显示了慢性genus后ck-p25和p301stau小鼠中差异化s/t磷酸化蛋白的go术语。

图5f显示了代表性图像，其示出了神经丝重链(nfh，主要在轴突中表达的神经元标记物)和来自视觉皮层的ser774磷酸化的dynamin1免疫染色。nfh用于标记神经元过程。比例尺10μm。n＝7只纯种ck小鼠，6只小鼠各自为非刺激和genus刺激的组。中间：与纯种ck相比，ck-p25小鼠表现出显著更高水平的ps774-dnm1信号强度，而genus显著降低了ck-p25小鼠的这种异常磷酸化。f(2,16)＝38.551，p<0.0001。bonferroni的多重比较测试，***p<0.001，**p<0.01。右：与野生型纯种小鼠相比，非刺激p301stau小鼠表现出显著更高水平的ps774-dnm1信号强度，而genus显著降低了p301s小鼠的这种异常磷酸化。n＝7只野生型纯种，8只非刺激p301s小鼠和7只genus小鼠。方差分析f(2,19)＝18.69，p<0.0001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，**p<0.01，n.s-不显著。

图5g显示了从纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠的视觉皮层对囊泡谷氨酸转运蛋白1(vglut1)免疫染色的代表性脑切片。比例尺表示10μm。

图5h显示，尽管在非刺激ck-p25小鼠中vglut1点的表达显著降低，但是在v1、ss1、ca1、cc中，与非刺激ck-p25小鼠相比，genus刺激的ck-p25小鼠表现出更高水平的vglut1点。n＝9只纯种ck小鼠，以及各自来自非刺激和genusck-p25组的6只小鼠。组间双向方差分析效应f(2,72)＝42.06，p<0.0001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05。

图5i显示了与野生型纯种小鼠相比，p301s中突触点vglut1的表达显著降低，genus挽救了p301s的v1、ca1和cc中vglut1的表达。n＝7只野生型纯种，以及8只非刺激p301s小鼠和7只genus小鼠。组间双向方差分析效应f(2,76)＝23.67，p<0.0001。用bonferroni的校正进行事后多重比较，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图6a至图6i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改变了阿尔茨海默氏病的多个受试者模型中的行为。

在图6a中，在两组ck-p25小鼠中诱导p25表达，持续42天，其中仅一组接受1小时的每日genus(在上午9点至下午12点之间进行刺激)。在第40天(of)和第41天(or)下午(下午3点至下午7点)对小鼠进行旷场(of)和新颖对象识别(or)测试。f和n分别表示熟悉的对象和新颖的对象。显示了来自of和or阶段的代表性占用热图。色彩级别映射到舞台或对象中位置频率的范围：暖色表示在指定位置中较高的时间和频率，而冷色表示较少的时间。

图6b显示慢性视觉genus不影响ck-p25小鼠中的焦虑水平。在纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间，在of舞台中心花费的时间没有差异。组间方差分析效应f(2,49)＝1.198，p＝0.3104。

然而，图6c显示了纯种ck和genus刺激的ck-p25小鼠对新颖的对象的偏好显著高于熟悉的对象；非刺激ck-p25小鼠未显示出偏好。熟悉的对象与新颖的对象之间的双向方差分析效应f(1,70)＝7.742，p＝0.0069。t检验；纯种ck，t＝4.421，p＝0.0001；ck-p25+无刺激，t＝1.108，p＝0.0946；ck-p25+genus，t＝3.306，p＝0.0017。

图6d显示了p25诱导的ck-p25小鼠在有或没有42天的genus的情况下的morris水迷宫性能(mwm；p25诱导的第36天至第41天之间)。顶部：与非刺激ck-p25小鼠相比，慢性genus减少了在ck-p25小鼠训练中寻找平台的潜伏期。组间双向方差分析效应f(2,252)＝18.64，p<0.0001。底部：与非刺激ck-p25小鼠相比，在genus刺激的组中，在最后训练阶段后24小时进行的探针测试中的平台交叉次数显著更高(左：组间效应f(2,42)＝5.277，p＝0.0090)。与纯种ck小鼠相比，非刺激ck-p25小鼠在目标象限中花费的时间(右；组间效应f(2,42)＝6.35，p＝0.0039)显著更低。

图6e涉及p301stau小鼠，其暴露于无刺激或genus，每天1小时，持续22天(上午9点至下午12点)，然后在of(第20天；下午3点至下午7点)和or(第21天)测试中进行评估。显示了来自of和or阶段的代表性占用热图。

图6f显示了genus不影响p301s小鼠中的焦虑水平。非刺激、genus刺激的p301s和野生型纯种组在of中心花费的时间没有差异(方差分析f(2,36)＝1.189，p＝0.3163)。

图6g显示了野生型、非刺激和genus刺激的p301s小鼠都表现出对新颖的对象的更高偏好。熟悉的对象和新颖的对象之间的双向方差分析效应f(1,80)＝88.61，p<0.0001。t检验；野生型纯种，t＝6.525，p<0.00001；p301s+无刺激，t＝2.602，p＝0.0054；p301s+genus，t＝10.65，p<0.00001。

图6h显示了野生型纯种、非刺激或genus刺激的p301stau小鼠的mwm性能。顶部：与非刺激p301s小鼠相比，慢性genus减少了在p301s小鼠训练期间寻找平台的潜伏期。组间双向方差分析效应f(2,225)＝3.782，p＝0.0242。底部：探针测试中平台交叉的次数(左：f(2,45)＝2.872，p＝0.067)和探针测试中目标象限中的时间(右：f(2,45)＝3.115，p＝0.054。

在图6i中，测试5xfad小鼠在有或没有genus(每天1小时，持续22天)的情况下的mwm性能。左：在训练期间寻找平台的潜伏期。组间双向方差分析效应f(2,273)＝16.97，p<0.0001。在非刺激ck-p25小鼠中，探针测试中平台交叉的次数(中间：组间效应f(2,39)＝4.702，p＝0.0148)和在目标象限中花费的时间(右：组间效应f(2,39)＝7.289，p＝0.0020)显著更低。

图7a至图7i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激在神经退行性变的小鼠模型中夹带γ振荡超出视觉皮层。

图7a显示了电解损伤，以验证用于主图1c、图1d后记录的小鼠中的记录位点。代表性图像显示了v1、ss1、ca1和pfc的记录位点。

如图7b所示，在ck-p25小鼠中诱导cdk5激活剂p25持续6周，随后进行微型驱动器植入和lfp记录。

在图7c中，与年龄匹配的野生型小鼠相比，ck-p25小鼠在v1、ca1和pfc中的区域功率(35-45hz)显著更低(所有区域p<0.01)。在40hz灯闪烁曝光期间，40hz视觉刺激在6周诱导的ck-p25小鼠的v1(wilcoxon-ranksum；p＝0.0022)、ca1(p＝0.001)和pfc(p＝0.002)中增加了40hz功率。

在图7d中，将微型驱动器植入8个月大的p301stau小鼠中。

图7e显示了在v1(p＝6.01e-05)和pfc(p＝4.11e-05)中进行40hz光刺激期间，观察到功率显著增加(35-45hz)。

图7f涉及c57bl6/j小鼠，其经受无刺激或genus1小时/天，持续42天。右：在40hz视觉刺激期间，在v1(wilcoxon-ranksum测试；p＝1.54e-06)、ss1(p＝2.88e-04)、ca1(p＝0.04)和pfc(p＝3.39e-06)中观察到35-45hz面积功率显著增加。

在图7g中，c57bl6/j小鼠经受无刺激或genus1小时/天，持续42天。在第43天对小鼠进行40hz视觉刺激，并收集lfp。在genus期间，在v1-ca1(p＝0.002)、v1-ss1(p＝0.008)、ca1-pfc(p＝0.04)和v1-pfc(p＝0.002)之间的30-50hz低γ相干性(以加权相位滞后指数测量)中观察到区域间的显著增加。ca1和ss1之间的低γwpli没有差异(p＝0.18)。

在图7h中，在ck-p25小鼠中诱导p25持续6周。(从第43天起)对六周诱导的ck-p25小鼠进行无刺激或genus，1小时/天，持续42天。右：在ck-p25小鼠中研究的所有脑区中，观察到低γ面积功率(35-45hz)的显著增加[v1，p＝0.0017)、ca1(p＝0.0379)、pfc(p＝0.0030)](在第85天测量)。

图7i显示了v1-ca1(p<0.01)、ca1-pfc(p<0.01)、v1-pfc(p<0.01)之间的低γ相干性也显著增加。

图8a至图8i示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激减少了5xfad小鼠中超出视觉皮层的与ad关联的病变。

图8a是示出了视觉闪烁刺激装置的示意图。发光二极管(led)的阵列存在于笼的开口侧，并使用arduino系统以方波电流模式驱动其以40hz的频率闪烁。由于小鼠在笼里自由移动(总面积为83平方英寸)，因此它们接收到的光强度为～1500至300lux。

在图8b中，10个月大的5xfad小鼠经受无刺激或genus，每天1小时，持续22天。代表性图像显示来自含有海马体和躯体感觉皮层的切片的红色淀粉样斑和蓝色核染色hoechst。比例尺1000μm。与主图2c至图2d有关。

在图8c中，10个月大的5xfad小鼠经受无刺激或genus，每天1小时，持续22天。代表性图像显示来自扣带回皮层的红色淀粉样斑、绿色神经元标记物neun和蓝色核染色hoechst。比例尺50μm。与主图2c至图2d有关。

图8d显示了在v1、ss1、ca1和cc中，genus刺激的5xfad小鼠中的斑块数量显著低于非刺激5xfad小鼠。与主图2c至图2d有关。n＝每个条件6只小鼠。组间双向方差分析效应f(1,40)＝30.01，p<0.0001。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

在图8e中，与年龄匹配的野生型同窝仔相比，显示9个月大的非刺激5xfad小鼠的ca1和cc中的神经元密度显著降低。genus显著减少了5xfad小鼠的cc中的神经元损失。n＝9只野生型纯种，6只5xfad+无刺激和6只5xfad+genus小鼠。组间双向方差分析效应f(2,72)＝14.93，p<0.0001。bonferroni的多重比较测试，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

在图8f中，10个月大的5xfad小鼠经受无刺激或genus，每天1小时，持续22天。代表性图像显示了突触标记物bassoon。比例尺10μm。

在图8g中，5xfad小鼠表现出ca1和cc中的突触标记物bassoon染色的显著降低，其在40hzgenus时显著降低。n＝9只野生型纯种，6只5xfad+无刺激和6只5xfad+genus小鼠。组间双向方差分析效应f(2,72)＝16.18，p<0.0001。bonferroni的多重比较测试，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图8h提供了全长免疫印迹，显示了全长app蛋白的表达水平和内源性gapdh对照。n＝5只野生型纯种小鼠，3只非刺激5xfad小鼠和4只genus刺激的5xfad小鼠。

图8i显示了与野生型纯种对照相比，app蛋白表达在5xfad小鼠中显著更高。在非刺激和genus刺激的5xfad小鼠之间，两者没有差异。请注意，我们没有测量app蛋白的c/n片段。c端特异性app抗体，单向方差分析f(2,9)＝4.436，p＝0.046。n端特异性app抗体，单向方差分析f(2,9)＝13.194，p＝0.002。bonferroni的多重比较测试，**p<0.01。

图9a至图9g示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改善了p301s和ck-p25小鼠的与ad关联的病变。

图9a提供了全长免疫印迹，其显示了来自非刺激、genus刺激的p301stau小鼠和年龄匹配的野生型纯种同窝仔的视觉皮层的总tau蛋白和gapdh的表达水平。右：然而，与野生型纯种小鼠相比，p301stau小鼠的总tau表达增加；非刺激和genus刺激的p301s小鼠之间tau水平没有差异。n＝3只野生型纯种，3只非刺激和4只genus刺激的p301s小鼠。方差分析f(2,7)＝173.275，p<0.0001。bonferroni的多重比较测试，***p<0.001。

图9b显示了在野生型纯种、非刺激p301s和genus刺激的p301s小鼠中，脑重量没有差异。与野生型纯种小鼠相比，在p301stau小鼠中存在侧脑室异常扩张的趋势。方差分析f(2,19)＝2.761，p＝0.079。

图9c提供了全长免疫印迹，其显示了来自纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠的视觉皮层的p25+gfp(融合蛋白)、p25、p35和gapdh的表达水平。右：然而，与年龄相匹配的纯种ck小鼠相比，在ck-p25小鼠中存在p25+gfp蛋白的显著增加(单向方差分析，f(2,12)＝13.065，p＝0.002)；非刺激和genus刺激的ck-p25在p25+gfp表达中没有差异。类似地，ck-p25小鼠的p25表达水平显著高于纯种ck小鼠，但非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间没有差异(单向方差分析，f(2,12)＝3.581，p＝0.025)。bonferroni的多重比较测试，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图9d提供了显示纯种ck、非刺激ck-p25和genus刺激的ck-p25的小鼠中的视觉皮层的厚度的代表性图像。核染色hoechst显示为蓝色，神经元标记物neun显示为红色。右：条形图显示了各组之间视觉皮层厚度的差异。组间双向方差分析效应f(2,36)＝12.93，p<0.0001。bonferroni的多重比较测试，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图9e提供了代表性图像，其显示了纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间的定性差异，详述了海马体积、皮层厚度和脑室大小的变化。与主图3f至图3h有关。

图9f显示了与非刺激ck-p25小鼠相比，genus并未改变p25+gfp融合蛋白表达水平(p25数量：gfp表达神经元)，在所有测试的脑区中，组间的独立样品t检验，p>0.05。

图9g提供了代表性图像，其显示了来自纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠中的ca1的dna双链断裂标记物γh2ax的表达。在纯种ck小鼠中没有明显的γh2ax阳性核，因此在非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间进行比较。n＝每个条件6只小鼠。比例尺100μm。右：genus显著减少了v1(独立样品t检验；t＝4.418，p＝0.0006)、ss1(t＝2.944，p＝0.013)、ca1(t＝2.664，p＝0.0143)和cc(t＝1.883，p＝0.055)中的γh2ax阳性核。

图10a至图10n示出了根据公开的发明概念的慢性视觉刺激改变了小神经胶质，改善了神经元中的细胞内转运和突触传递。

图10a显示了来自代表性纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠的facs中的小神经胶质分离概况。与主图4a、图4c有关。

图10b显示了来自代表性野生型纯种、非刺激和genus刺激的p301stau小鼠的facs中的小神经胶质分离概况。

在图10c中，差异化表达的基因(deg)在火山图中示出。组比较显示在右侧。顶部：野生型纯种和非刺激p301s之间的deg，n＝每组5只小鼠。中上方：非刺激和genus刺激的p301s小鼠之间的deg，n＝每组5只小鼠。

图10d显示了与所识别的deg关联的生物过程的前7个处理过的基因本体论(go)术语。组比较显示在顶部。

图10e提供了代表性图像，其以绿色示出iba1并以红色示出cd40。为了清楚起见，分离出主图4d中呈现的合并图像。

图10f显示了来自代表性纯种、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠的facs中的神经元核分离概况。与总细胞核相比，％neun的组平均值和sem：纯种ck，50±1.48；非刺激ck-p25，40.98±0.719；genus刺激的ck-p25小鼠，45.08±1.691。方差分析f(2,12)＝11.55，p＝0.0016。bonferroni的事后测试，纯种ckvs非刺激ck-p25，p＝0.001'，纯种ckvsgenus刺激的ck-p25，p＝0.0609。genus减少了ck-p25小鼠的神经元核损失。

图10g显示了来自代表性野生型纯种、非刺激p301s和genus刺激的p301s小鼠的facs中的神经元核分离概况。与总hoechst阳性核相比，发现的neun阳性核百分比的组平均值和平均值的标准误差(sem)：野生型纯种，52.45±2.03；非刺激p301s，45.17±1.18；genus刺激的p301s，50.38±2.09。方差分析f(2,18)＝4.97，p＝0.0191。bonferroni的事后测试，野生型纯种vs非刺激p301s，p＝0.028；野生型纯种vsgenus刺激的p301s小鼠，p＝0.99。genus减少了p301stau小鼠的神经元核损失。

图10h提供了条形图，其显示了总神经元(neun)阳性核与总核相比的百分比，如图10f和图10g所示。顶部：条形图比较了野生型纯种、非刺激和genus刺激的p301s小鼠。n＝每组7只小鼠。方差分析f(2,18)＝4.971，p＝0.0191。底部：条形图比较了纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠。n＝每组5只小鼠。方差分析f(2,12)＝7.72，p＝0.0070。

在图10i中，基于神经递质转运和囊泡介导的60个基因簇，选择慢性genus后p301stau小鼠和ck-p25小鼠中的上调基因。请注意，与非刺激小鼠相比，这些基因仅在genus后的ck-p25、p301s中或两只小鼠中被上调(通过metascape分析)。蛋白质-蛋白质相互作用网络图(用cytoscapev3.6.1，然后用strings分析；富集p值，6.66e-15)与紧密联系的其他功能富集go术语一起显示。

在图10j中，对来自非刺激p301stau-tg小鼠和每天1小时genus刺激，持续22天的视觉皮层进行s/t磷酸化蛋白质组学分析。热图显示了非刺激和genus刺激的p301s小鼠之间的差异化磷酸化蛋白，这些蛋白涉及突触传递和细胞内转运。

在图10k中，热图显示了涉及非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间的突触传递(化学突触传递、跨突触信号传导)的差异化磷酸化蛋白。显示了基因(相应的蛋白质)名称和特定的磷酸位点。

在图10l中，p301stau小鼠经受无刺激或genus刺激持续22天。使用串联质谱标签(tmt)10-plex试剂盒(参见方法)和质谱法(lc-ms/ms)在视觉皮层组织上进行总蛋白表达和s/t磷酸化蛋白分析。n＝3只野生型纯种，3只非刺激p301s和4只genus刺激的p301s小鼠。倍数变化为±0.2且调整后的p值<0.05的磷酸化蛋白被认为具有统计学意义。与它们各自的对照小鼠相比，ck-p25和p301stau小鼠中与差异化s/t磷酸化蛋白关联的生物学过程的go术语。

图10m-顶部：蛋白质印迹显示来自纯种ck、非刺激和40hzgenus刺激的ck-p25小鼠的ps774dnm-1、dnm-1、dnm-3和gapdh。ck-p25小鼠的ps774dnm-1水平显著高于纯种ck小鼠，而40hzgenus显著降低ck-p25小鼠的ps774dnm-1。n＝4只纯种ck小鼠，5只非刺激ck-p25小鼠和4只40hzgenus刺激的ck-p25小鼠(方差分析f(2,12)＝5.836，p＝0.021)。底部：条形图显示组差异。请注意，这是一个独立的验证。与主图5f有关。

fig10n-顶部：蛋白质印迹显示来自野生型纯种、非刺激和40hzgenus刺激的p301s小鼠的ps774dnm-1、总dnm-1、dnm-3和gapdh。请注意，这是一个独立的验证。*p<0.05。与主图5f有关。

图11a至图11j示出了根据公开的发明概念的急性和慢性视觉刺激对受试者的影响的行为表征。

图11a-顶部：显示了在有或没有genus的情况下，c57bl6/j小鼠在10分钟仓内的占用情况的热图。在刺激前10分钟的基线期间，探索行为没有明显差异。n＝每组6只小鼠。t检验，t＝0.3173，p＝0.7576。类似地，当与无刺激组相比时，在整个40hz刺激期间内均未检测到速度的系统变化。底部：曲线显示了30分钟内每分钟的速度。双向重复测量方差分析：在30分钟的时间内进行探索，f(29,290)＝6.747，p<0.0001；非刺激和genus刺激的野生型小鼠之间的相互作用，f(29,290)＝0.9354，p＝0.5652。

在图11b中，对c57bl6/j小鼠(4个月大)进行无刺激或40hz光闪烁刺激持续1小时，然后立即注射印防己毒素并将其置于of中。左：注射印防己毒素后行进的距离表明genus组和非刺激组之间没有差异。n＝每组4只小鼠。重复测量方差分析f＝0.527，p＝0.717。右：拉辛评分。评分0，行为正常；评分1，不动和僵硬；评分2，头部摆动；评分3，前肢阵挛和饲养；评分4，连续饲养和下落；评分5，强直阵挛癫痫发作；评分6，死亡。在非刺激组和genus组之间，癫痫发作易感性没有明显差异。重复测量方差分析f＝0.429，p＝0.994。

在图11c中，在适应新颖的对象3天后，测试了野生型小鼠的nor。左：在30分钟持续时间内每分钟花费在探索熟悉的和新颖的对象的时间。叠加了新颖的对象辨别百分比。中间：直方图显示了对熟悉的和新颖的对象的累计(整个30分钟)探索。与熟悉的对象相比，非刺激和genus刺激的小鼠都花费显著更多的时间来探索新颖的对象。组间没有差异，表明急性40hz灯闪烁曝光不会影响小鼠辨别新颖的对象的能力。n＝每组6只小鼠。与熟悉的对象相比，新颖的对象的累计偏好：无刺激，t(6)＝-13.055，p＝0.00004；genust(5)＝-20.818，p＝0.000004。组间的新颖的对象偏好，t检验t＝-0.314，p＝0.760。右：行进的总距离的直方图，显示genus不改变野生型小鼠的运动行为。移动的总距离，t检验t＝0.5096，p＝0.6214。

在图11d中，c57bl6/j小鼠经受无刺激或genus，每天1小时，持续7天。在刺激范例前1小时，每天测量小鼠体重，持续7天以及刺激方案后1天。n＝14只非刺激小鼠和12只genus刺激的小鼠。条形图显示了7天的体重。然而，两组的全部天数内的体重总体增加(f(6,144)＝2.889，p＝0.011)；非刺激组和genus刺激组之间的体重没有差异(f(6,144)＝1.327，p＝0.249)。

然而，图11e显示，野生型纯种小鼠和p301stau小鼠之间的体重存在显著差异(组间双向方差分析效应f(2,72)＝8.947，p＝0.0003)；与非刺激p301stau小鼠相比，慢性genus(1小时/天，持续22天)不影响p301s的体重。n＝13只野生型纯种，14只非刺激和12只genus刺激的p301s小鼠。

图11f显示，与非刺激ck-p25小鼠相比，慢性genus不影响ck-p25小鼠的体重(组间双向方差分析效应f(2,122)＝2.487，p＝0.0874)。n＝25只纯种ck，21只非刺激和18只genus刺激的ck-p25小鼠。

图11g与主图6f有关。n＝与图6f相同。组间在旷场试验中行进的总距离很显著。方差分析f(2,36)＝10.27，p＝0.0003。然而，与非刺激p301s相比，genus刺激的p301s小鼠没有差异(p>0.99)。

图11h与主图6b有关。n＝与图6b相同。显示了在旷场试验中行进的总距离。在非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠的旷场试验过程中，行进的总距离没有差异。方差分析f(2,49)＝0.01552，p＝0.9846。

图11i-左：在非刺激和7天的genus刺激的野生型小鼠之间，血浆皮质酮水平没有差异。n＝每组12只小鼠。t＝1.17，p＝0.255。中间：在ck-p25小鼠中诱导p25的同时，小鼠经受无刺激或genus，每天1小时，持续42天。图表中指出了每组小鼠的数量。纯种ck、非刺激和genus刺激的ck-p25小鼠之间血浆皮质酮水平没有差异(f(2,35)＝0.4871，p＝0.6185)。右：在野生型纯种、非刺激p301s和22天的genus刺激的p301s小鼠之间，p301stau小鼠(刺激22天)的血浆皮质酮水平也相当(f(2,35)＝0.6874，p＝0.5096)。相应地在图中给出了每组中的小鼠数量。

图11j与主图7有关。所有实验中，小鼠在morris水迷宫测试中游动的平均速度。左：在ck-p25小鼠的全部6天的训练中，任何组之间没有明显差异(图7d)。组间双向方差分析效应f(2,252)＝0.3832，p＝0.6821。中间：在p301stau小鼠的全部5天的训练中，各组之间没有差异(图7h)。组间双向方差分析效应f(2,225)＝0.5726，p＝0.5651。右：5xfad小鼠组的游动速度存在显著差异(图7i)。组间双向方差分析效应f(2,273)＝24.24，p<0.0001。与bonferroni的更正进行多次比较。从第1天到第4天没有差异。第5天：野生型纯种vs.5xfad+无刺激，p>0.9999。野生型纯种vs.5xfad+40hzgenus，p＝0.0022。5xfad+无刺激vs.5xfad+40hzgenus，p＝0.0483。第6天：野生型纯种vs.5xfad+无刺激，p＝0.0005。野生型纯种vs.5xfad+40hzgenus，p＝0.0037。5xfad+无刺激vs.5xfad+40hzgenus，p>0.9999。第7天：野生型纯种vs.5xfad+无刺激，p<0.0001。野生型纯种vs.5xfad+40hzgenus，p＝0.0043。5xfad+无刺激vs.5xfad+40hzgenus，p＝0.5716。

图12a至图12c示出了根据公开的发明概念的80hz的慢性视觉刺激不影响5xfad小鼠的morris水迷宫。

图12a显示了5xfad小鼠暴露于80hz刺激每天1小时，持续22天的mwm性能。折线图例中指出了每组小鼠的数量。然而，在训练期间寻找平台的潜伏期，在非刺激和80hz刺激的5xfad组之间没有差异(双向方差分析f(2,180)＝13.33，p<0.0001)；与野生型纯种小鼠相比，这两个组都需要更多的时间来寻找平台。

图12b指示在探针测试期间平台交叉的次数。f(2,30)＝3.622，p＝0.0390。与bonferroni的更正进行多次比较。*p<0.05。

图12c显示了与野生型纯种小鼠相比，在探针测试期间非刺激和80hz刺激的5xfad小鼠在目标象限中花费的时间显著更少。f(2,30)＝5.643，p＝0.0083。与野生型纯种小鼠相比，经bonferroni校正的多次比较，经刺激的p＝0.014，80hz-p＝0.0371。*p<0.05。

实验和分析细节

开始方法

动物模型

所有实验均得到麻省理工学院比较医学系动物保护委员会的批准。c57bl6、tg(camk2a-tta)、tg(appswfllon，psen1*m146l*l286v)、tg(prnp-mapt*p301s)ps19和fos-tm1.1(cre/ert2)从jackson实验室获得。tg(teto-cdk5r1/gfp)在我们的实验室中产生。所有转基因小鼠均在我们的动物设施中进行繁殖和饲养。

使用的c57bl/6j小鼠为3、10或17个月大。用含强力霉素的食物饲养ck-对照和ck-p25(与teto-cdk5r1/gfp杂交的camk2a-tta)小鼠。给予正常的啮齿动物饮食以诱导p25-gfp转基因表达。通常，诱导p25表达持续6周。在实验开始时，p301stau小鼠的年龄为7个月，而5xfad小鼠为9或11个月。除植入微型驱动器的小鼠外，所有小鼠均分组饲养(每笼2-5只小鼠)。所有实验均使用年龄匹配的同窝仔进行。使用小鼠进行两次免疫染色和电生理学实验，达到图例中限定的总数。本文所述的所有行为实验(除了幼年和老年野生型小鼠和taup301s小鼠的morris水迷宫)均使用图例中限定的动物总数进行了一次。没有使用统计方法来预先确定样品大小，相反，我们选择使用来自我们实验室设置的类似的先前发布的研究的组大小(iaccarino等人，2016年；nott等人，2016年)来确保组间差异保持最小化。图1中的方框图表示中位数，四分位数范围的上限(75％)和下限(25％)。除非另有说明，否则图2至图6中所有带有误差线的图均以平均值±sem表示，并且所有样品均以小鼠的数量(n)表示。

40hz灯闪烁刺激

如前所述，递送灯闪烁刺激(iaccarino等人，2016年)。将小鼠从储藏室转运到位于同一建筑物相邻楼层上的闪烁处理室。在实验开始前，在昏暗的光线下适应1小时后，将小鼠引入测试笼(类似于家用笼，不同的是没有卧具，并且其三面都覆盖有黑色薄片)。允许小鼠在笼内自由移动，但在1小时的灯闪烁过程中没有食物或水。发光二极管(led)的阵列存在于笼的开口侧，并使用arduino系统以方波电流模式驱动其以40hz的频率闪烁。在40hz的灯闪烁曝光下1小时后，将小鼠放回他们的家笼中，并允许其再休息30分钟，然后再转运回储藏室。然而，正常室内光线对照小鼠被暴露在具有类似食物和水限制的类似笼中；他们只经历了普通的室内光线。

组织准备

免疫组织化学用40ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs)和40mlpbs中的4％低聚甲醛对小鼠进行心内膜灌注。取出脑并在4℃下在4％pfa中固定过夜，然后在切片之前转移至pbs。

蛋白质印迹：解剖视觉皮层并在液氮中速冻，并储存在-80℃的冰箱中直至加工。使用具有ripa(50mmtrishclph8.0、150mmnacl，1％np-40、0.5％脱氧胆酸钠，0.1％sds)缓冲液的玻璃均化器匀化样品。使用bio-rad蛋白质测定法量化样品中蛋白质的浓度。制备等浓度的蛋白质，并加入sds-样品缓冲液。

免疫组织化学

使用强力胶将脑固定在振动切片台上(leicavt1000s)，并准备40μm切片。随后将切片用pbs洗涤，并在室温下用在含0.3％triton-x100(pbst)的pbs中制备的5％正常驴血清封闭2小时。抽出封闭缓冲液，并将切片与合适的一级抗体(在新鲜封闭缓冲液中制备)在摇动器上以4℃孵育过夜。然后将切片用封闭缓冲液洗涤三次(每次10分钟)，然后与alexafluor488、555、594或647偶联的二级抗体在室温下孵育2小时。然后用封闭缓冲液洗涤三次(每次15分钟)并用pbs进行最后一次洗涤(10分钟)，将切片用fluromount-g(电子显微科学)固定。

使用了以下二级抗体的组合：(1)alexafluor488、594和647，(2)alexafluor555和647，以及(3)alexafluor594和647。

成像与量化

使用具有5倍、10倍、20倍、40倍或63倍物镜的lsm710或lsm880共焦显微镜(zeiss)在所有条件下以相同的设置获取图像。使用imagej1.42q或imarisx648.1.2(bitplane，瑞士苏黎世)对图像进行量化。对于每种实验条件，使用指定数量的动物的两个冠状切片。每只小鼠的两个图像的平均值进一步用于量化。尽可能由不了解基因型和治疗条件的实验人员进行量化。

neun、c-fos和gfp阳性细胞计数：所有图像均在z叠堆—每张图像10个中获取并进行量化。使用imagej计算每两个的平均值和所有计数的总和。p301stau-tg和5xfad的neun计数由不了解治疗条件的实验人员完成。

γh2ax阳性细胞计数：imagej中的多点工具用于对细胞进行计数。

vglut1，bassoon点：具有63倍物镜和3倍变焦的lsm880用于获取图像。视觉和躯体感觉皮层的深层(主要是4和5)、ca1层放射线和腹侧扣带回皮层的第5层都是靶向的。获取单个平面图像。imagej中的粒子计数插件用于量化vglut1点的数量。

ps202/t205tau强度：使用具有40倍物镜的lsm710获取z叠堆的整个切片厚度40μm(每场40张图像)。所有图像均被压缩/折叠，并在imagej中测量信号强度。

ps774-dnm1强度：使用具有63倍物镜和3倍变焦的lsm880获取z叠堆的整个切片厚度40μm(每场40张图像)。所有图像均被压缩/折叠，并在imagej中测量点的信号强度。

斑块：d54d2抗体染色总斑块强度，并由不了解基因型和治疗条件的实验人员来量化斑块的数量。以0.5μm的间隔对整个40μm切片进行z叠堆成像，然后将它们合并，并使用imagej测量信号强度。使用imagej中的颗粒分析工具以5μm²的阈值对斑块进行计数。所有斑块强度和斑块数量计数均由不了解治疗条件的实验人员进行。

c1q强度：使用具有40倍物镜的lsm710获取z叠堆的整个切片厚度40μm(每场40张图像)。所有图像均被压缩/折叠，并在imagej中测量信号强度。

cd40：使用具有63倍物镜的lsm880获取z叠堆的整个切片厚度40μm(每场40张图像)。所有图像均被压缩/折叠，并在imagej中测量信号强度。

侧脑室：使用具有5倍物镜的lsm710显微镜在-2.0前卤点(头侧至尾侧)对完整冠状切片进行成像。使用imagej的徒手选择工具绘制覆盖侧脑室整个区域的轮廓，并测量lv的面积。

小神经胶质：iba1免疫反应性细胞被认为是小神经胶质。使用具有40倍物镜的lsm710获取z叠堆的整个切片厚度40μm(每场40张图像)。imaris用于图像的3d渲染，以量化体细胞和过程小神经胶质的总体积。iba1聚合分析是在imagej3d渲染插件中执行的。从图像中为每个小神经胶质计算出iba1之间的最小距离。所有图像均被压缩/折叠，并使用imagej量化iba1阳性细胞的总数量。

皮层厚度：使用具有5倍物镜的lsm710显微镜对完整的皮层柱进行成像。使用imagej测量皮层外边界与胼胝体的皮层侧之间的距离。

脑重量测量：小鼠先后用pbs和4％pfa进行心内膜灌注，然后将脑在4％pfa中固定过夜。用pbs清洗脑，除去多余的部分，然后用湿实验室的高精度秤(mettlertoledo，精确到1mg)称重。处死另一组小鼠，将脑在液氮中速冻并测量脑重量。在这两个独立指标的每个中，将脑重量标准化为纯种ck脑。

蛋白质印迹

将六至八微克的蛋白质加载到6％、8％、10％或15％的聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳。将蛋白质从丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜(bio-rad)，在100v下120分钟。使用稀释在含有0.1％tween-20(pbstw)的pbs中的乳(5％w/v)封闭膜，然后在第一抗体中以4℃孵育过夜。第二天，将它们用pbstw洗涤三次，并与辣根过氧化物酶连接的第二抗体(gehealthcare)在室温下孵育60分钟。用pbstw洗涤三遍后，用化学发光底物处理膜并显影膜。使用imagej1.46q量化信号强度，并标准化为对照蛋白(诸如β-肌动蛋白、gapdh或对应的磷酸化蛋白分析的总蛋白)的值。

微型驱动器植入和体内电生理学

钨丝电极驱动器：使用具有全氟烷氧基涂层的钨丝电极(裸线直径50μm，涂覆直径101.6；a-m系统)和neuralynx电极接口板(eib-36)的3d打印驱动器基座，定制微型驱动器。聚酰亚胺管用于保护电极并减少电噪声。将电极排列到视觉皮层的目标第3层或第4层(相对于前卤点的坐标，前-后(ap)，-3.0；内-外(ml)，+2.0)、ss1(ap，-2.0；ml，+2.3)，海马体的ca1区(ap，-1.8；ml，+1.5)和前额叶皮层的扣带回区(ap，+1.0；ml，+0.2)。将参比电极放置在小脑中。

四极体驱动器：定制微型驱动器包含四个镍铬合金四极体(14mm；加利福尼亚细线公司)，镀金(neuralynx)，阻抗为200至250ku，排成一排(沿背侧海马体的ca3至ca1轴运行)植入背侧ca1(ap,-1.8)。将参比电极放置在海马体上方的纤维束中。

手术：用阿维丁麻醉小鼠，将其约束在立体定向仪中，并进行开颅手术，以暴露视觉皮层、躯体感觉皮层和前额叶皮层。植入微型驱动器并缓慢降低至目标深度。允许小鼠恢复4天。

体内电生理学：经过2-3天的居住期后，开始记录，允许动物在小的旷场中自由移动。记录阶段由10-15分钟组成，其中led以40hz的频率闪烁，但被黑色的丙烯酸聚丙烯薄片完全封闭，随后立即再移走10分钟，将薄片移开，并使动物暴露于闪烁的led下。使用neuralynxsx系统(neuralynx，bozeman，mt，美国)获取数据，并以32,556hz对信号采样。使用固定到微型驱动器的红色发光二极管跟踪动物的位置。在实验结束时，对小鼠进行了终末麻醉，并通过用50μa电流分别通过每个电极10s对脑组织进行电解损伤来标记电极位置，以确认它们的解剖位置。

尖峰：通过在记录的尖峰的3d投影周围绘制簇边界来手动隔离单个单元，该尖峰在spikesort3d软件(neuralynx)中呈现。如果平均尖峰宽度超过200μs，且复杂尖峰指数(csi)≥5，则认为细胞是锥体神经元。

数据分析：首先将lfp过滤至目标采样率的奈奎斯特频率，然后下采样20倍(至1628hz)。使用matlab中的pwelch函数，使用500ms时间窗口(重叠率为50％)进行功率谱分析，分析中仅包括动物速度保持>4cm/s的lfp数据片段。如前所述(vinck等人，2011年)，使用了加权相滞后指数(wpli)(更适合小型啮齿动物大脑的相干性度量)，以消除体积传导信号对相干性的任何潜在污染。仅在动物速度>4cm/s的时间段内，计算解剖学上不同区域中的成对电极的wpli。所有分析均使用matlab进行。

锥体细胞40hz调制：如前所述(middleton和mchugh，2016年)，使用圆形统计工具箱计算了尖峰发射时间与40hzlfp相位之间的关系。简而言之，使用连续小波变换(以40hz为中心的cmor1.5-1小波)对尖峰进行分选并过滤lfp迹线，返回瞬时信号的相位和幅度。尖峰时间被线性内插以确定相位，其中γ的峰和谷分别被定义为0度和180度。对于每个20度间隔，将得到的相位值进行合并以生成发射概率。仅当细胞的分布与均匀分布显著不同时才认为它们是锁相的(p<0.05圆形瑞利检验)，锁相强度计算为平均所得长度。

rna测序

小神经胶质的分离：快速解剖视觉皮层，并将其置于冰冷的汉克斯(hanks)平衡盐溶液(hbss)中(生命技术公司的gibco，目录号14175-095)。根据制造商的规程，使用神经组织解离试剂盒(p)(miltenyibiotec，目录号130-092-628)对组织进行酶消化，并稍作改动。具体而言，将组织在37℃下用酶消化15分钟而不是35分钟，然后将所得细胞悬浮液通过40μm细胞过滤器(falconcellstrainers，sterile，corning，产品352340)而不是70μm的macssmartstrainer。然后，根据制造商(miltenyibiotec)的推荐，使用别藻蓝蛋白(apc)偶联的cd11b小鼠克隆m1/70.15.11.5(miltenyibiotec，130-098-088)和藻红蛋白(pe)偶联的cd45抗体(bdpharmingen，553081)对所得细胞悬浮液进行染色。然后将facs用于纯化cd11b和cd45阳性小神经胶质细胞。使用标准、严格的侧向散射宽度与面积以及前向散射宽度与面积的标准来区分双联体和仅门控单联体。通过用碘化丙啶(pi)染色并仅门控pi阴性细胞来识别活细胞。将cd11b和cd45双阳性细胞分选到1.5ml离心管中，其中装有500μl含1％β-巯基乙醇(sigma-aldrich，目录号m6250)的rna裂解缓冲液(qiagen，目录号74134)。根据制造商的规程，使用rneasyplusminikit(qiagen，目录号74134)提取rna。洗脱rna，然后将其保存在-80℃下直至整个转录组扩增，文库构建和测序。

神经元的分离：将视觉皮层在具有蛋白酶抑制剂的0.5ml冰冷pbs中匀化，并将悬浮液以1600g离心10分钟。将沉淀重悬于5mlnf-1低渗缓冲液中，温育5分钟，然后以30次笔划进行dounce匀浆(杵a)。将5mlnf-1缓冲液添加到该悬浮液中，用10mlnf-1缓冲液洗涤杵，总计合计20ml。将所有溶液收集在50个锥形管中，并用40μm筛网过滤器过滤匀浆。3,000rpm(1,600xg)的成核反应15分钟。重悬于30mlnf-1缓冲液中并充分混合。在4℃下摇匀1小时。用20mlnf-1缓冲液洗涤沉淀一次，以3,000rpm离心15分钟，然后在冰上重悬于2-5mlpbs+1％bsa+蛋白酶抑制剂中20分钟，而不会干扰沉淀。将alexa粉488或alexa粉647偶联的neun抗体(1:500)添加到试管中，并在4℃下孵育20分钟。悬液洗涤未结合的抗体，并用pbs+1％bsa+蛋白酶抑制剂离心。以3,000rpm的速度旋转细胞核15分钟，然后重悬于0.5ml(pbs+蛋白酶抑制剂)中，并用40μm滤网过滤以进行facs分选。加入两滴nucblueliveready探针试剂(thermofischerscientific；目录号r37605)以进行核门控。将neun阳性细胞分选到1.5ml离心管中，其中装有500μl含1％β-巯基乙醇(sigma-aldrich，目录号m6250)的rna裂解缓冲液(qiagen，目录号74134)。根据制造商的规程，使用rneasyplusminikit(qiagen，目录号74134)提取rna。洗脱rna，然后将其保存在-80℃下直至整个转录组扩增，文库构建和测序。

rna文库构建：在文库构建之前，使用高级分析片段分析仪对提取的总rna进行质量控制。smarter链式总rna测序试剂盒-picoinput用于p301s神经元、ck-p25神经元和p301s小神经胶质rna序列。smart测序v4超低输入rna试剂盒用于ck-p25小神经胶质特异性rna测序。按照制造商的说明构建文库，并在mitbiomicro中心的illuminanextseq500平台上进行测序。

使用star2.4将40bp配对末端测序读数的原始fastq数据与小鼠mm9参考基因组进行比对。读取总数和比对的读数百分比如下：ck-p25神经元-总读数为18094674.857±827050.464；比对的百分比为85.323±0.414。p301s神经元-总读数为22792713.18±6308817.636；比对的百分比为84.45±0.548。ck-p25小神经胶质-总读数28694964.5±435841.6674；比对的百分比为89.43±0.25。[p301s小神经胶质-总读数为18990369.2±1667316.196；比对的百分比为27.243±4.04。由于映射率非常低，因此需要进一步考虑该实验]。映射的读数由cufflinks2.2(trapnell等人，2012年)使用mm9参考基因注释进行处理，以估计文库类型为fr-secondstrand的转录本丰度(用于滞留神经元数据)。组间的基因差异表达测试使用cuffdiff模块进行，其中p值<0.05(用于神经元数据)。选择几何方法作为cuffdiff的库归一化方法。对于小神经胶质数据，使用featurecounts工具从非链rna测序数据中量化基因外显子计数，并使用deseq2计算统计学显著性。使用颜色编码的散点图来可视化差异化表达基因和其他基因的fpkm组值。

差异化表达基因的重复表达fpkm值的z评分在不同样品组的热图中可见。小神经胶质特异性deg的基因本体论是使用metascape工具进行的，而神经元特异性deg的基因本体论是使用toppgene进行的

蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学

样品制备，还原，烷基化和胰蛋白酶消化：解剖视皮层并在液氮中速冻，并储存在-80℃的冰箱中直至进一步使用。随后使用塑料手持式马达驱动的匀化器将样品与新鲜制备的8m尿素溶液匀化。使用bio-rad蛋白质测定法量化样品中蛋白质的浓度。制备每1ml含1mg蛋白质的样品，分装后保存在-80℃的冰箱中直至进一步使用。蛋白质在56℃下用10mm二硫苏糖醇(dtt)还原1小时，在室温(rt)下用50mm碘乙酰胺烷基化1小时，并用ph为8.9的100mm乙酸铵稀释至小于1m尿素。使用测序级胰蛋白酶(promega；每50μg蛋白质1μg胰蛋白酶)在室温下消化蛋白质过夜。通过用乙酸酸化样品来淬灭酶活性。将肽混合物脱盐并在c18sep-pakplus柱(waters)上浓缩，并用50％乙腈、0.1％甲酸和0.1％乙酸洗脱。在speedvac真空离心机中蒸发溶剂。将每个样品的400μg等分试样等分并在液氮中冷冻5分钟，冻干并在-80℃下储存。

tmt标记：tmt标记和磷酸肽富集：用tmt-10-plex质量标签标记试剂盒(thermo)标记冻干肽。对于每个tmt多重分析，均包括由野生型、非刺激性和40hz夹带的神经退行性小鼠模型的等量肽组成的混合样品，允许相对量化归一化通道。为了进行tmt标记，将来自9只小鼠肽等份和一个标准通道(每个通道400μg肽)的九个样品重悬于重悬于100μl70％(体积/体积)的乙醇、30％(体积/体积)的0.5mph为8.5的三乙基-碳酸氢铵中，并与tmt试剂一起孵育，在室温下重悬于40μl无水乙腈中1小时。使用speedvac真空离心机将样品浓缩，合并并浓缩至干。

肽分馏：通过高ph反相hplc分离tmt标记的肽沉淀。将肽重悬于100ul缓冲液a(10mmteab,ph8)中，并在4.6mmx250mm300extend-c18，5um色谱柱(agilent)上用缓冲液b(90％mecn,10mmteab,ph8)以1ml/min的流速使用90分钟梯度进行分离。梯度如下：1-5％b(0-10min)，5-35％b(10-70min)，35-70％b(70-80min)，70％b(80-90min)。在75分钟内以10分钟至85分钟的间隔(每1分钟)收集馏分。将这些馏分不连续地分为15个馏分(1+16+31+46+61,2+17+32+47+62等)。然后将馏分进行速度真空(thermoscientificsavant)至几乎干燥。

磷酸肽富集：按照制造商的说明，使用high-selectfe-nta磷酸肽富集试剂盒(thermo)从15个馏分中的每一个中富集磷酸肽。

液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)：使用预色谱柱(自制，6cm的10μmc18色谱柱)和自组装的5μm尖端分析柱(12cm的5μmc18色谱柱，新对象)通过反相hplc(thermoeasynlc1000)分离肽。使用qexactiveplus质谱仪(thermo)在纳米电喷雾之前进行140分钟的梯度洗脱。溶剂a为0.1％的甲酸，溶剂b为80％的mecn/0.1％的甲酸。梯度条件为0-10％b(0-5分钟)，10-30％b(5-105分钟)，30-40％b(105-119分钟)，40-60％b(119-124分钟)，60-100％b(124-126分钟)，100％b(126-136分钟)，100-0％b(136-138分钟)，0％b(138-140分钟)，并且质谱仪以依赖数据的模式进行操作。全扫描ms的参数为：在350-2000m/z范围内分辨率为70,000，agc3e6和最大it为50ms。完整的ms扫描后，进行ms/ms，每个循环中前10个前体离子的nce为34，动态排除时间为30s。使用蛋白质组发现物(thermo)和mascot版本2.4.1(matrixscience)搜索原始质谱数据文件(.raw)。mascot搜索参数为：前体离子的质量公差为10ppm；碎片离子质量公差为15mmu；胰蛋白酶的2次漏切割；固定的修饰是半胱氨酸的氨基甲酰甲基化和赖氨酸和肽n-末端的tmt10plex修饰；可变的修饰是蛋氨酸氧化，酪氨酸磷酸化和丝氨酸/苏氨酸磷酸化。使用蛋白质组发现物进行tmt量化，并按照制造商的说明进行同位素校正，然后将其标准化为每个tmt通道的平均值。数据分析中仅包括mascot评分大于或等于25且分离干扰小于或等于30的肽。

将洗涤后的预柱与内部填充的分析型毛细管柱串联连接[50μmid×12cm，填充有5μmc18珠(ymc凝胶，odsaq，12nm，s-5μm，aq12s05)]，具有集成的电喷雾尖端(～1μm孔口)。使用0.2m乙酸中的9％至70％乙腈的140分钟(磷酸肽)或90分钟(总肽)梯度以0.2ml/min的流速洗脱多肽，分流率为～10,000:1，得到最终的电喷雾流速为～20nl/min。从每个样品中总共收集了15个馏分。使用thermoqexactivehybridquadrupole-orbitrapplus质谱仪对磷酸肽进行分析，其设置如下：喷雾电压，2kv；无护套或辅助气流，加热的毛细管温度为250℃；s镜射频水平为50％。qexactive在依赖数据的采集模式下运行。全扫描ms光谱[质荷比(m/z)，350至2000；基于先前扫描的预测agc，在3e6目标值处积累离子之后，在orbitrap分析仪中检测到分辨率，在m/z200处为70,000]。对于每个完整扫描，通过高能碰撞离解(hcd)分离15个最强离子(分离宽度为0.4m/z)并破碎(碰撞能(ce)：32％)，最大注入时间为300ms和分辨率35,000。在具有以下设置的ltqorbitrapxl质谱仪上进行总肽分析：喷雾电压，2kv；无护套或辅助气流，加热的毛细管温度为250℃。分析是在依赖数据的采集模式下进行的；在orbitrap分析仪中检测到全扫描质谱图(m/z范围为400-2000，分辨率为60,000)(离子目标值5x105)。对于每次全扫描，在hcd细胞中分离出10个最强离子(分离宽度3da)并通过hcd(ce：75％)片段化，然后在orbitrap(离子目标值1x105)中进行检测以进行itraq标记物离子量化。

质谱肽图数据分析：将原始质谱数据文件加载到蛋白质组发现物版本1.4.1.14(dbversion:79)(thermo)中，并使用mascot版本2.4(matrixscience)在鼠标swissprot数据库中进行搜索。提取了tmt报告量化，并在蛋白质组发现物中校正了同位素。串联质谱与前体质量的初始质量公差为10ppm，碎片离子的初始质量公差为15mmu相匹配。搜索半胱氨酸氨基甲酰甲基化、tmt标记的赖氨酸和蛋白质n端作为固定修饰。搜索氧化甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化作为可变的修改。肽的最小长度为七个氨基酸。通过离子分数>20过滤所有肽数据集，以确保对肽鉴定和磷酸化定位的高置信度，并实现肽的(fdr)低于1％。基于从粗肽分析获得的中位数相对肽量化，对磷酸肽量化进行归一化，以校正tmt通道之间样品量的细微变化。对于每种磷酸肽，相对量化表示为来自每个分析样品的tmt离子强度与所包含的归一化通道之间的比率。

生物信息学分析：为了识别比例显著调节的差异化表达和磷酸化肽段，我们选择了±20％差异的任意截止值，调整后的p值<0.05。不受调节的背景库由比例为0.8-1.2的肽组成。因此，随后的生物信息学分析包括相对于被认为分别被下调和上调的标准化通道比率分别为<0.8和>1.2的肽。使用uniprotid映射检索工具将来自蛋白质登录号的蛋白质名称转换为基因列表。通过使用string数据库(版本10.5)获得蛋白质网络。包括除文本挖掘之外的所有主动交互源，并且为了确保高置信度，需要置信度得分超过0.9。首先使用string(http://string-db.org)、toppgene(toppgene.cchmc.org)和metascape(http://metascape.org)生物信息学资源对与生物过程有关的术语进行基因本体论(go)术语富集分析，然后手动过滤以从这三种资源中寻找常用术语。报告了在toppgene中获得的go术语。对于每个单独的小鼠品系(c57bl6/j、ck-p25、p301stau-tg和5xfad)，分析包括从差异化调节的总肽或s/t磷酸肽(上调和下调)的每个库中衍生的基因集。

行为

旷场：将小鼠引入旷场箱(尺寸：长＝460mm，宽＝460mm，高＝400mm；tse系统)，并使用noldus(ethovision)跟踪5分钟，测量花费在场地的中心和周边区域中的时间。

高架十字迷宫(epm)：将小鼠引入epm的中心区域(任何迷宫尺寸：臂长＝35cm，宽度＝5cm)，并使用noldus程序跟踪10分钟。离线计算每个分支和epm中心所花费的时间。

ck-p25和p301stau小鼠的新颖的对象识别：将小鼠引入旷场，并计算在场地中心花费的时间。第二天，将小鼠重新引入同一旷场箱中，该箱现在包含另外两个熟悉的对象(但新颖的物体在下一阶段将很熟悉)，并允许其探索对象10分钟。此后，他们在上次探索后10分钟返回了同一个场地，两个对象中的一个被新对象替换。监测小鼠行为7分钟。使用noldus记录了探索熟悉和新颖的对象所花费的时间，并进行离线计算。

癫痫发作易感性：给小鼠注射印防己毒素(腹膜内注射)，并置于旷场，并使用noldus和侧装式照相机记录30分钟。在noldus中离线计算了行进距离，并手动对癫痫发作严重程度进行评分。

morris水迷宫：mwm是用于评估空间学习的测试。mwm依靠视觉提示从开放式游泳场馆周围的起始位置导航，以找到水下逃生平台。该设备由一个圆形池(直径122cm)组成，其中充满了自来水(22℃-24℃)和加入的无毒白色涂料，使溶液不透明。逃生平台(直径10厘米)带有钝的突出边缘以便在被浸没在水位以下1英寸处时更好地抓握。该池分为四个相等的象限，分别标记为n(北)、e(东)、s(南)和w(西)。在整个试验中，从边缘开始以随机顺序将小鼠引入迷宫，进行60秒的试验。记录了寻找隐藏平台所需的时间(潜伏期)。在最后一次训练试验之后的24小时进行了探针测试，并移除了浸没平台。使用noldus记录所有训练和探针测试试验。

ck-p25、p301s和5xfad小鼠在早晨(直到中午12点)经受genus，并在下午(下午3点至下午7点)在mwm中进行测试，这将行为测试时间限制为每天仅4小时。我们确保在训练期间每天使用至少两次和至多4次试验，允许我们能够在mwm中运行所有组，同时还保持严格的暗/亮周期。尽管训练天数有所不同，但用于mwm的所有ad小鼠的总训练步数均相当。

统计分析

统计分析在spss、matlab或prism中进行。样品大小未预先确定。使用独立样本t检验，wilcoxonrank-sum检验，单向方差分析或双向重复测量方差分析以及bonferroni事后分析和krushkalwallis检验计算统计学显著性。统计学显著性设定为0.05。

结论

本公开的发明方面针对本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、药盒和/或方法。另外，两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、套件和/或方法(如果此类特征、系统、物品、材料、套件和/或方法并非互不一致)的任何组合包含在本公开的发明性范围内。

而且，各种发明概念可以体现为一种或多种方法，已经提供了其实例。作为该方法的一部分执行的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可以构造按不同于所说明的次序执行动作的实施例，其可以包含同时执行一些动作，即使在说明性实施例中展示为依序的动作也是如此。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。

如本文所定义和使用的所有定义应被理解为控制词典定义，通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的普通含义。

如本文所用，术语“约”和“大约”在与数值和/或范围结合使用时，通常是指与所列举的数值和/或范围接近的那些数值和/或范围。在某些情况下，术语“约”和“大约”可以表示在所述值的±10％以内(包括所述值本身)。例如，在某些情况下，“约100[单元]”可以表示在100的±10％之内(例如，从90到110)。在其他情况下，术语“约”和“大约”可以表示在所述值的±5％以内(包括所述值本身)。在其他情况下，术语“约”和“大约”可以表示在所述值的±1％以内(包括所述值本身)。术语“约”和“大约”可以互换使用。

除非明确指出相反的含义，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为表示“至少一个”。

在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应当理解为表示这样结合的元件中的“任一者或两者”，即在一些情况下共同存在而在其他情况下不连续存在的元件。用“和/或”列出的多个元件应以相同的方式解释，即，这样结合的元件中的“一者或多者”。除了由“和/或”子句具体指出的元件之外，还可以任选地存在其他元件，无论与具体指出的那些元件相关还是无关。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言(例如“包括”)使用时，提及“a和/或b”在一个实施例中可以仅指a(任选地包含除b之外的元素)；在另一个实施例中仅指b(任选地包含除a之外的元素)；在又一个实施例中，兼指a和b(任选地包含其他元素)；等等。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应解释为包括的，即包括多个元件或元件列表中的至少一个(还包括一个以上)以及任选地其他未列出的项目。仅明确指出相反的术语，诸如“仅一个”或“恰好一个”，或当在权利要求书中使用时，“由…组成”将参见例如包括多个元件或元件列表中的恰好一个元件。一般地，本文所使用的术语“或”仅应解释为在排他性术语诸如“任一个”、“一个”、“仅一个”或“恰好一个”之前指示排他的替代方式(即“一者或另一者，但并非两者”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由…组成”应具有其在专利法领域中所使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个元件的列表时，短语“至少一个”应理解为指选自该元件列表中的任何一个或多个元件的至少一个元件，但不一定包括元件列表中具体列出的每个元件中的至少一个，并且不排除元件列表中的元件的任何组合。除了短语“至少一个”所指的元件列表中具体指出的元件之外，该定义还允许任选地存在其他元件，无论与具体指出的那些元件相关还是无关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，“a和b中的至少一个”(或，等效地，“a或b中的至少一个”或，等效地“a和/或b中的至少一个”)可以指代至少一个，任选地包含多于一个a，不存在b(并且任选地包含除了b之外的元素)；在另一个实施例中，可以指代至少一个，任选地包含多于一个b，不存在a(并且任选地包含除了a之外的元素)；在又一实施例中，可以指代至少一个，任选地包含多于一个a，和至少一个，任选地包含多于一个b(并且任选地包含其他元素)；等等。

在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡短语，诸如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“涵盖”、“涉及”、“容纳”、“由…组成”等都应理解为开放式的，即指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡短语“由…组成”和“基本上由…组成”才应分别是封闭的或半封闭的过渡短语。