相关申请的交叉引用本申请根据35u.s.c.§119(c)要求2017年12月04日提交的美国临时申请系列号62/594,342的优先权。本发明涉及用于犬莱姆病的新疫苗。还提供了单独或与其他保护剂组合的疫苗的制备和使用方法。
背景技术：
：犬莱姆病由感染疏螺旋体(borrelia)属种(spp.)的螺旋体引起，主要包括在美国的b.burgdorferi狭义(ss)以及在欧洲的b.burgdorferiss、b.garinii和b.afzelii[baranton等，int.j.sys.bacteriol.42:378-383(1992)；hovius等，j.clin.microbiol.38:2611-2621(2000)]。螺旋体通过吸食血液的感染硬蜱属种(ixodesspp.)蜱虫(ticks)传播，感染在犬中引起从亚滑膜炎到急性关节炎和关节痛的临床体征[jacobson等，semin.vet.med.surg.11:172-182(1996)；summers等，j.comp.path.133:1-13(2005)]。重要的是，犬莱姆病病例的发病率每年持续增加，与人类病例数增加一致[haninkova等，emerg.infect.dis.12:604-610(2006)]。此外，一些犬种(特别是猎犬和伯恩山犬)已发展成严重的肾小球肾炎[dambach等，vetpathol34:85-96(1997)]，并且并已报道了因并发症而死亡的情况[littman等，jvetinternmed.20:422-434(2006)]。对borreliaspp.感染应答产生的抗体具有两种不同功能[schwan,biochem.soc.trans.31:108-112(2003)；tokarz等，infect.immun.72:5419-5432(2004)]。最常见的体液免疫应答是产生非特异性结合/调理(包被)抗体，其“标记”螺旋体以便被吞噬细胞所摄取。因此，这种体液免疫应答导致产生免疫球蛋白(ig)m抗体，其结合并诱导杀死外源性抗原的补体介导的膜攻击复合物。然而，igm抗体应答通常类别转换为结合抗原但不再刺激补体介导的杀伤作用的igg抗体。相反，igg抗体与靶抗原结合，并有效“标记”螺旋体以便被吞噬细胞所摄取。接种疫苗后，这种更为典型的调理性igg抗体应答未能提供有效的保护，这主要是因为诱导免疫应答的蛋白通常是多种其他微生物所共有，并且莱姆病螺旋体可能在血液中更罕见地持续存在[caine等，infectimmun83:3184-3194(2015)]，其中与吞噬细胞的相互作用可能是更有效的。的确，调理抗体是由与其他微生物共有的几种蛋白诱导的(即，41kda蛋白，其包含细菌鞭毛)，这使其在疫苗接种诱导的抗体介导的免疫中的价值充其量是可疑的。另一方面，一些疏螺旋体属种蛋白诱导的抗体应答即使在转换为igg抗体后仍保持固定补体(杀疏螺旋体)的能力。更具体地，杀疏螺旋体抗体与特定蛋白靶标结合并诱导补体，以形成杀死该生物体的膜攻击复合物，但无需被吞噬细胞清除。与调理抗体不同的是，这种杀疏螺旋体应答已形成了最有效的犬莱姆病细菌疫苗(bacterin)的基础。最早的犬莱姆病细菌疫苗通过诱导对b.burgdorferi外表面蛋白(osp)a具有特异性的杀疏螺旋体抗体提供保护作用[chu等，javma201:403-411(1992)；ma等，vaccine14:1366-1374(1996)；wikle等，intern.j.appl.res.vet.med.4:23-28(2006)；和straubinger等，vaccine20:181-193(2002)]。该方法可能是有效的，但现在发现，这种策略具有重大缺陷，可能导致疫苗接种失败。例如，抗体仅识别表达ospa的b.burgdorferiss螺旋体[jobe等，j.clin.microbiol.32:618-622(1994)；lovrich等，infect.immun.63:2113-2119(1995)]，且蜱虫也经常感染不表达ospa的b.burgdorferiss螺旋体[fikrig等，infect.immun.63:1658-1662(1995)；ohnishi等，proc.natl.acad.sci.98:670-675(2001)]。此外，蜱虫还经常感染其他疏螺旋体属种，如b.afzelii或b.garinii[ornstein等，j.clin.microbiol.39:1294-1298(2001)]，其也引起莱姆病，且ospa抗体是基因种特异性的[lovrich等，infect.immun.63:2113-2119(1995)]。此外，提供保护的“机会窗”之所以短暂，是因为在感染的蜱虫进食后不久，ospa的表达即被关闭[schwan等，proc.natl.acad.sci.usa92:2909-2913(1995)]，ospa的表达介导附着至蜱虫中肠[pal等，jclininvest106:561-569(2000)]。与基于ospa的犬莱姆病疫苗的开发一致，研究人员发现b.burgdorferissospc蛋白也诱导保护性杀疏螺旋体抗体[rousselle等，j.infect.dis.178:733-741(1998)；ikushima等，femsimmunol.med.microbiol.29:15-21(2000)]，但是认为该应答对于有效的莱姆病疫苗是没有用的，因为即使在同一地理区域收集的b.burgdorferiss分离物中，ospc的异质性也极高[ing-nang等，genetics151:15-30(1999)；buckles等，clin.vacc.immunol.13:1162-1165(2006)]。因此，研究人员推测，ospc杀疏螺旋体抗体只能针对少量莱姆病螺旋体提供抗体介导的免疫。一致地，callister等[u.s.6,210,676和u.s.6,464,985]建议使用特异性针对osp羧基(c)末端的ospc免疫原性多肽片段，将其单独或与ospa多肽联合用于疫苗中，以保护人和其他哺乳动物免于罹患莱姆病。具体而言，该策略诱导与ospc羧基(c)末端内的7个氨基酸表位特异性结合的杀疏螺旋体抗体[jobe等，clin.diagn.lab.immuno.10:573-578(2003)；lovrich等，clin.diagn.lab.immunol.12:746-751(2005)]，因为该表位在迄今已鉴定的所有b.burgdorferiss菌株中均是保守的，并且在其他病原性疏螺旋体属种中也是保守的(如在blast检索中找到的)。因此，无论ospc基因的系统(phyletic)特征如何，预期诱导针对保守表位的ospc杀疏螺旋体抗体的疫苗将针对每种b.burgdorferiss“菌株”提供保护作用，还能够针对其他犬莱姆病病原体(如b.garinii或b.afzelii)提供保护作用。livey等[u.s.6,872,550]还提出了一种由重组ospa、ospb和osp蛋白的组合制备的用于针对莱姆病的免疫的疫苗。根据这一策略，默克动物健康公司的全细胞细菌疫苗lyme于2009年获得usda的批准，其包含分别在外膜表面上表达ospa或ospc的两个单独b.burgdorferi分离株的混合物[u.s.8,137,678b2；u.s.8,414,901b2]。最重要的是，默克动物健康公司的方法利用其lyme疫苗提供了针对犬类莱姆病更全面保护的能力已得到充分验证。例如，研究人员证实了该疫苗可诱导ospa和ospc杀疏螺旋体抗体两者，还证明了ospc抗体应答包括相当一部分对c末端保守表位具有特异性的杀疏螺旋体抗体[lafleur等，clinvaccineimmunol16:253-259(2009)]。此外，研究人员证实，疫苗在接种后的一年内可靠地保护了受体犬[lafleur等，clinvaccimmunol17:870-874(2010)]，并且还发现表达ospc的螺旋体为高水平保护做出重要贡献[lafleur等，clinvaccimmunol22:836-839(2015)]。但是，尽管有这种改进，仍持续存在对更加全面和长期保护的需求，尤其是在引起莱姆病的螺旋体遗传多样性不断扩大的情况下。最近，研究人员采用另一种策略来克服ospc的异质性，从而提供更全面的保护。这种策略是对很多种b.burgdorferiss分离株的ospc进行系统发生分析，以鉴定在多个生物体之间同源的基因序列中的区域[earnhardt等，clinvaccineimmunol14:628-634(2007)]。然后，研究人员设计了一种含有多个同源区域的“人工”基因，并使用该人工基因产生嵌合蛋白。之后，可以将该嵌合蛋白用于疫苗中，以推测地诱导可结合每个整合入区域的ospc杀疏螺旋体抗体，从而提供更全面的保护[rhodes等，vetj198:doi:10.1016/j.tvjl.2013.07.019(2013)]。该结果导致usda于2016年批准了一种商业化的犬莱姆病疫苗(crlyme)，其包含重组(r)ospa和人工产生的含有来自7种“类型”ospc的表位的嵌合蛋白[zoetis技术公告–sab-00233]。然而，现有技术尚不知晓如何制备基于ospc亚基抗原的可诱导杀疏螺旋体抗体的疫苗。多年来，已在疫苗中使用多种载体策略，包括使用α病毒衍生的复制子rna颗粒(rp)[frolov等，pnas93:11371-11377(1996)；vanderveen等，animhealthresrev.13(1):1-9.(2012)doi:10.1017/s1466252312000011；kamrud等，jgenvirol.91(pt7):1723-1727(2010)]，其是由几种不同α病毒开发而成，包括委内瑞拉马脑炎病毒(vee)[pushko等，virology239:389-401(1997)]、辛德毕斯(sindbis)(sin)[bredenbeek等，journalofvirology67:6439-6446(1993)]和塞姆利基森林病毒(sfv)[liljestrom和garoff,biotechnology(ny)9:1356-1361(1991)]。rp疫苗可将繁殖缺陷的α病毒rna复制子递送到宿主细胞中，并在体内表达一种或多种期望的抗原转基因[pushko等，virology239(2):389-401(1997)]。当与一些传统疫苗制剂比较时，rp具有有吸引力的安全性和有效性性质[vanderveen等，animhealthresrev.13(1):1-9.(2012)]。已将rp平台用于编码致病性抗原，并且是几种usda许可的猪和家禽疫苗的基础。此外，gipson等[vaccine.21(25-26):3875-84.(2003)]已在小鼠模型疫苗接种试验中将rp平台用于编码opsa抗原，但是没有报道在犬中进行过类似的试验。因此，尽管lyme疫苗提供了增强的有效性，并且过去有许多推测的死角和/或失败，但是仍存在对进一步改进的莱姆病疫苗的长期需要，以更好地保护哺乳动物(特别是犬)免受这种使其衰弱的疾病的侵害。不应将本文引用的任何参考文献解释为承认该参考文献可作为本申请的“现有技术”。技术实现要素：因此，本发明提供了编码一个或多个伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)抗原的载体。可以将这样的载体用于包含这些载体的免疫原性组合物中。可以将本发明的免疫原性组合物用于疫苗中。在本发明的一个方面中，疫苗有助于保护疫苗接种对象(例如，哺乳动物)免受莱姆病的侵害。在这种类型的一个特定实施方式中，疫苗接种对象是犬。在另一个实施方式中，疫苗接种对象是家猫。其他家养哺乳动物可以通过本发明的疫苗和/或方法来保护，如马(例如，马)和/或牛。本发明还提供了用于激发针对莱姆病和其他疾病(例如，其他犬或马感染性疾病)的保护性免疫的组合疫苗。还提供了制备和使用本发明的免疫原性组合物和疫苗的方法。在特定实施方式中，载体是α病毒rna复制子颗粒，其包含编码伯氏疏螺旋体抗原的核酸构建体。在更具体的实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎(vee)α病毒rna复制子颗粒。在另外更特异的实施方式中，veeα病毒rna复制子颗粒是tc-83veeα病毒rna复制子颗粒。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是辛德毕斯(sin)rna复制子颗粒。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)(sfv)α病毒rna复制子颗粒。在替代的实施方式中，裸dna载体包含编码伯氏疏螺旋体抗原的核酸构建体。在另外其他替代实施方式中，裸dna表达载体包含其本身编码伯氏疏螺旋体抗原的α病毒复制子序列。本发明包括本发明的所有核酸构建体，包括合成的信使rna、rna复制子，以及本发明的所有α病毒rna复制子颗粒，裸dna载体和免疫原性组合物和/或疫苗，其包含本发明的核酸构建体(例如，合成的信使rna、rna复制子)、α病毒rna复制子颗粒和/或裸dna载体。在某些实施方式中，本发明的核酸构建体编码一个或多个伯氏疏螺旋体抗原。在一个此类实施方式中，伯氏疏螺旋体抗原是外表面蛋白a(ospa)或其抗原性片段。在另一个实施方式中，伯氏疏螺旋体抗原是外表面蛋白c(ospc)或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，核酸构建体编码两个至四个伯氏疏螺旋体抗原或其抗原性片段。在这种类型的某些实施方式中，核酸构建体编码一个或多个ospa或一个或多个其抗原性片段和一个或多个ospc或其抗原性片段。特别地，核酸构建体编码ospa或其抗原性片段和ospc或其抗原性片段，其中ospa或其抗原性片段由位于编码ospc或其抗原性片段的核酸序列上游的核酸序列编码。在另一个特定的实施方式中，核酸构建体编码ospc或其抗原性片段和ospa或其抗原性片段，其中ospc或其抗原性片段由位于编码ospa或其抗原性片段的核酸序列上游的核酸序列编码。在其他实施方式中，编码ospa或其抗原性片段的核酸构建体来源于两个或多个伯氏疏螺旋体菌株。在另外其他实施方式中，编码ospc或其抗原性片段的核酸构建体来源于两个或多个伯氏疏螺旋体菌株。本发明还提供了包含任何这些核酸构建体的α病毒rna复制子颗粒。在替代的实施方式中，载体是裸dna，其包含一种或多种这些核酸构建体。在特定实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒rna复制子颗粒，其包含编码一个或多个伯氏疏螺旋体抗原或其抗原性片段的核酸构建体。在相关实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒rna复制子颗粒，其包含编码两个至四个伯氏疏螺旋体抗原或其抗原性片段的核酸构建体。在特定实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒rna复制子颗粒，其包含本发明的核酸构建体。在这种类型的特定实施方式中，α病毒rna复制子颗粒包含编码ospa的核酸构建体。在相关实施方式中，α病毒rna复制子颗粒包含编码ospa的抗原性片段的核酸构建体。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒包含编码来自两个或更多个不同伯氏疏螺旋体菌株的ospa或其抗原性片段的核酸构建体。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒包含编码ospc的核酸构建体。在相关实施方式中，α病毒rna复制子颗粒包含编码ospc的抗原性片段的核酸构建体。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒包含编码来自两个或更多个不同伯氏疏螺旋体菌株的ospc或其抗原性片段的核酸构建体。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒rna复制子颗粒，其包含编码两个或更多个下述伯氏疏螺旋体抗原的组合的核酸构建体：来自一个或多个菌株的ospa、来自一个或多个菌株的ospc和/或任何这些蛋白的抗原性片段。在特定实施方式中，免疫原性组合物包含均为委内瑞拉马脑炎病毒(vee)α病毒rna复制子颗粒的α病毒rna复制子颗粒。在相关实施方式中，免疫原性组合物包含两组或更多组α病毒rna复制子颗粒。在这种类型的特定实施方式中，一组α病毒rna复制子颗粒包含第一核酸构建体，而另一组α病毒rna复制子颗粒包含第二核酸构建体。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含一组病毒rna复制子颗粒、另一组α病毒rna复制子颗粒和第三组α病毒rna复制子颗粒，所述一组病毒rna复制子颗粒包含第一核酸构建体，所述另一组α病毒rna复制子颗粒包含第二核酸构建体，和所述第三组α病毒rna复制子颗粒包含第三核酸构建体。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含一组病毒rna复制子颗粒、另一组α病毒rna复制子颗粒、第三组α病毒rna复制子颗粒和第四组α病毒rna复制子颗粒，所述一组病毒rna复制子颗粒包含第一核酸构建体，所述另一组α病毒rna复制子颗粒包含第二核酸构建体，所述第三组α病毒rna复制子颗粒包含第三核酸构建体，和所述第四组α病毒rna复制子颗粒包含第四核酸构建体。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含一组病毒rna复制子颗粒、另一组α病毒rna复制子颗粒、第三组α病毒rna复制子颗粒、第四组α病毒rna复制子颗粒、和第五组α病毒rna复制子颗粒，所述一组病毒rna复制子颗粒包含第一核酸构建体，所述另一组α病毒rna复制子颗粒包含第二核酸构建体，所述第三组α病毒rna复制子颗粒包含第三核酸构建体，所述第四组α病毒rna复制子颗粒包含第四核酸构建体，和所述第五组α病毒rna复制子颗粒包含第五核酸构建体。在此类实施方式中，第一核酸构建体、第二核酸构建体、第三核酸构建体、第四核酸构建体和第五核酸构建体的核苷酸序列均是不同的。因此，本发明提供了包含两种或更多种α病毒rna复制子颗粒的免疫原性组合物，每种各自编码一个或多个伯氏疏螺旋体抗原。在这种类型的特定实施方式中，一种α病毒rna复制子颗粒编码伯氏疏螺旋体外表面蛋白a(ospa)或其抗原性片段。在某些实施方式中，一种α病毒rna复制子颗粒编码伯氏疏螺旋体外表面蛋白c(ospc)或其抗原性片段。在另外另一个实施方式中，一种α病毒rna复制子颗粒编码伯氏疏螺旋体ospa或其抗原性片段，第二α病毒rna复制子颗粒编码伯氏疏螺旋体ospc或其抗原性片段。在相关实施方式中，免疫原性组合物还包含α病毒rna复制子颗粒，其包含编码两个或更多个伯氏疏螺旋体抗原或其抗原性片段的核酸构建体。特别地，本发明提供了包含第一和第二α病毒rna复制子颗粒的免疫原性组合物，每种各自编码ospa或其抗原性片段和ospc或其抗原性片段(双构建体)，其中第一rna复制子颗粒包含位于编码ospc或其抗原性片段的核酸序列上游的编码ospa或其抗原性片段的核酸序列，和第二rna复制子颗粒包含位于编码ospa或其抗原性片段的核酸序列上游的编码ospc或其抗原性片段的核酸序列。在特定实施方式中，核酸构建体编码来源于b.burgdorferi菌株297的ospa或其抗原性片段。在这种类型的特定实施方式中，ospa包含与seqidno:2的氨基酸序列具有95％或更高同一性的氨基酸序列。在更具体的实施方式中，ospa包含seqidno:2的氨基酸序列。在甚至更具体的实施方式中，ospa由seqidno:1的核苷酸序列编码。在一个相关的实施方式中，核酸构建体编码来源于b.burgdorferi菌株50772(atccno.pta-439)的ospc或其抗原性片段。在这种类型的特定实施方式中，ospc包含与seqidno:24的氨基酸序列具有95％或更高同一性的氨基酸序列。在更具体的实施方式中，ospc包含seqidno:4的氨基酸序列。在甚至更具体的实施方式中，ospc由seqidno:3的核苷酸序列编码。在另外其他实施方式中，核酸构建体编码来源于b.burgdorferi菌株297的ospa和来源于b.burgdorferi菌株50772的ospc。本发明包括包含本发明的免疫原性组合物的疫苗，更具体地疫苗是非佐剂疫苗。在特定实施方式中，疫苗有助于预防b.burgdorferi引起的疾病。在特定实施方式中，由b.burgdorferi引起的疾病是莱姆病。在更具体的实施方式中，莱姆病是犬莱姆病。在特定实施方式中，本发明的疫苗可有效接种6-8周龄的健康犬免受犬莱姆病。在这种类型的特定实施方式中，本发明的疫苗可有效接种7周龄的健康犬免受犬莱姆病。在某些实施方式中，当使用疫苗免疫犬时，在犬中诱导抗体。在特定实施方式中，抗体为调理igg。在其他实施方式中，诱导的抗体是杀疏螺旋体的。在另外其他实施方式中，诱导调理igg和杀疏螺旋体抗体两者。在更具体的实施方式中，诱导的ospa抗体是杀疏螺旋体和调理igg，和诱导的ospc是杀疏螺旋体和调理igg。在某些实施方式中，本发明的疫苗还包含用于激发对非疏螺旋体病原体的保护性免疫的至少一种非疏螺旋体免疫原。在特定实施方式中，本发明的疫苗还包含α病毒rna复制子颗粒，所述α病毒rna复制子颗粒编码来自非疏螺旋体免疫原的至少一种蛋白抗原，以激发针对非疏螺旋体病原体的保护性免疫。在某些实施方式中，非疏螺旋体免疫原来自下述非疏螺旋体病原体，如犬瘟热病毒(caninedistempervirus)、犬腺病毒(canineadenovirus)、犬细小病毒(canineparvovirus)、犬副流感病毒(canineparainfluenza)、犬冠状病毒(caninecoronavirus)、犬流感病毒(canineinfluenzavirus)、钩端螺旋体血清型(leptospiraserovar)、利什曼原虫生物体(leishmaniaorganism)、支气管败血波氏杆菌(bordetellabronchiseptica)、支原体属种(mycoplasmaspecies)、狂犬病毒(rabiesvirus)、犬埃立克体(ehrlichiacanis)、无形体属生物体(anaplasmaorganism)和/或其组合。在特定实施方式中，来自钩端螺旋体血清型的非疏螺旋体免疫原是leptospirakirschneri感冒伤寒型血清型(leptospirakirschneriserovargrippotyphosa)。在其他实施方式中，来自钩端螺旋体血清型的免疫原是leptospirainterrogans犬型血清型(leptospirainterrogansserovarcanicola)。在另外其他实施方式中，来自钩端螺旋体血清型的免疫原是leptospirainterrogans黄疸出血型血清型(leptospirainterrogansserovaricterohaemorrhagiae)。在另外其他实施方式中，来自钩端螺旋体血清型的免疫原是leptospirainterrogans波摩那型血清型(leptospirainterrogansserovarpomona)。在另外其他实施方式中，疫苗包含来自多个钩端螺旋体血清型的免疫原。在特定实施方式中，来自支原体属种的非疏螺旋体免疫原是犬支原体(mycoplasmacynos)。本发明还提供了针对病原性疏螺旋体基因种免疫哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用免疫有效量的本发明的疫苗。在特定实施方式中，通过皮下注射施用疫苗。在替代的实施方式中，通过肌内注射施用疫苗。在其他实施方式中，通过静脉内注射施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过皮内注射施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过口服给药施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过鼻内给药施用疫苗。在特定实施方式中，哺乳动物是犬。在其他实施方式中，哺乳动物是马(例如，马)。本发明的疫苗可以作为初免疫苗和/或作为加强疫苗施用。在某些实施方式中，在施用初免疫苗和加强疫苗两者的情况下，可以以相同途径施用初免疫苗和加强疫苗。在这种类型的某些实施方式中，初免疫苗和加强疫苗两者均通过皮下注射施用。在替代的实施方式中，在施用初免疫苗和加强疫苗两者的情况下，初免疫苗的施用可以通过一种途径进行和加强疫苗可以通过另一种途径施用。在这种类型的某些实施方式中，可以通过皮下注射施用初免疫苗和可以通过口服施用加强疫苗。本发明的疫苗组合物还可以包含免疫有效量的来自病原性疏螺旋体基因种的一个或多个另外的菌株(在本文中可以统称为第二菌株)的灭活生物体。在特定实施方式中，第二菌株显示ospa和ospb抗原。适宜第二菌株的实例包括下述中的一种或多种：b.burgdorferisss-1-10(atccno.pta-1680)、b.burgdorferissb-31(atccno.35210)、b.afzelii(例如，可以以atccno.51567获得)、b.garinii(例如，可以以atccno.51383和51991获得)、b.burgdorferissdk7、b.burgdorferiss61bv3、b.burgdorferisszs7、b.burgdorferisspka、b.burgdorferissip1，ip2，ip3、b.burgdorferisshii、b.burgdorferissp1f、b.burgdorferissmil、b.burgdorferiss20006、b.burgdorferiss212、b.burgdorferissesp1、b.burgdorferissne-56、b.burgdorferissz136、b.burgdorferissia和/或其任何组合。本发明还提供了一种针对病原性疏螺旋体种(特别是b.burgdorferiss)免疫哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物注射免疫有效量的上述发明疫苗。在特定实施方式中，例如，疫苗可以包含约1x104至约1x1010或更多的rp。在更特定的实施方式中，疫苗可以包含约1x105至约1x109rp。在甚至更特定的实施方式中，疫苗可以包含约1x106至约1x108rp。在特定实施方式中，接种后，免疫的哺乳动物产生杀疏螺旋体抗体。在特定实施方式中，哺乳动物是犬。在其他实施方式中，哺乳动物是马(例如，马)。在某些实施方式中，本发明的疫苗以0.05ml至3ml剂量施用。在更特定的实施方式中，以0.1ml至2ml剂量施用。在甚至更特定的实施方式中，以0.2ml至1.5ml剂量施用。在甚至更特定的实施方式中，以0.3ml至1.0ml剂量施用。在甚至更特定的实施方式中，以0.4ml至0.8ml剂量施用。本发明还提供了组合疫苗，其进一步包含编码来自其他犬病原体的一种或多种免疫原的载体(例如，α病毒rna复制子颗粒)，包括例如用于激发针对下述的免疫的免疫原：犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬流感病毒和/或钩端螺旋体血清型，例如，leptospirakirschneri感冒伤寒型血清型、leptospirainterrogans犬型血清型、leptospirainterrogans黄疸出血型血清型和/或leptospirainterrogans波摩那型血清型。可以加入本发明的组合疫苗的另外的犬病原体包括利什曼原虫生物体(如硕大利什曼原虫(leishmaniamajor)和婴儿利什曼原虫(leishmaniainfantum))、支气管败血波氏杆菌(bordetellabronchiseptica)、支原体属种(mycoplasmaspecies)(例如，犬支原体(mycoplasmacynos))、狂犬病毒、无形体属种(如嗜吞噬细胞无形体(anaplasmaphagocytophilum)和血小板无形体(anaplasmaplatys))；和犬埃立克体(ehrlichiacanis)。在特定实施方式中，本发明的疫苗还包含α病毒rna复制子颗粒，其编码来自一种或多种这样的免疫原的至少一个或多个抗原。通过参考下述具体实施方式，将更好地理解本发明的这些和其他方面。具体实施方式本发明提供了免疫原性组合物和/或疫苗，其包含免疫有效量的编码伯氏疏螺旋体外表面蛋白a(ospa)或其抗原性片段和编码伯氏疏螺旋体外表面蛋白c(ospc)或其抗原性片段的α病毒rna复制子颗粒，免疫有效量的两种或多种载体，其具有至少一种编码伯氏疏螺旋体外表面蛋白a(ospa)或其抗原性片段的α病毒rna复制子颗粒和至少另一种编码伯氏疏螺旋体外表面蛋白c(ospc)或其抗原性片段的α病毒rna复制子颗粒，或编码ospa或其抗原性片段和ospb或其抗原性片段两者的α病毒rna复制子颗粒与编码ospa或其抗原性片段和/或编码ospc或其抗原性片段的α病毒rna复制子颗粒的组合。所有这些免疫原性组合物均可用于哺乳动物疫苗。在本发明的一个方面中，所述疫苗有助于保护接种对象(例如，哺乳动物)免受莱姆病的侵害。在这种类型的一个特定实施方式中，接种对象是犬。因此，本发明提供了一种新的免疫原性组合物，其通过(i)通过消除用来自细菌的无关抗原的接种显著降低了不良副作用的可能性，并且(ii)仍提供了全面的保护，从而提高了预防犬莱姆病疫苗接种的可靠性。本发明的莱姆病疫苗制剂还应该通过诱导有效的抗体再生(anamnestic)记忆应答来显著延长“有效性窗口”。为了更充分地理解本发明，提供了以下定义。为了便于描述所使用的单数形式的术语并非旨在是限制性的。因此，例如，提及组合物包含“一种多肽”时包括提及一种或多种此类多肽。另外，除非另有说明，提及“生物体”包括提及多种此类生物体。如在本文中所使用的，术语“约(approximately)”与“约(about)”可以互换使用，表示在所示值百分之五十以内的值，即每毫升含有“约”1x108个α病毒rna复制子颗粒的组合物含有每毫升5x107至1.5x108个α病毒rna复制子颗粒。如在本文中所使用的，除非另有说明，否则术语“犬”包括所有家犬、犬(canislupusfamiliaris)或家犬(canisfamiliaris)。术语“基因种”首先由baranton等，1992,internationalj.ofsystematicbacteriology42:378-383使用和定义，在本文中以与术语“种”描述非疏螺旋体生物体的分类相同的方式使用。术语“非疏螺旋体”用于修饰诸如生物体、病原体和/或抗原(或免疫原)的术语，以表示相应的生物体、病原体和/或抗原(或免疫原)分别不是疏螺旋体生物体、不是疏螺旋体病原体和/或不是疏螺旋体抗原(或免疫原)，以及非疏螺旋体蛋白抗原(或免疫原)不是来源于疏螺旋体生物体。针对给定蛋白抗原和天然编码其的病原体或该病原体的毒株(strain)，术语“来源于(originatefrom/originatesfrom/originatingfrom)”可以互换使用，并且如在本文中所使用的，表示给定蛋白抗原的未经修饰和/或截短的氨基酸序列由该病原体或该病原体的毒株编码。在本发明核酸构建体中的来源于病原体的蛋白抗原的编码序列可以被基因操纵，以产生相对于作为其来源的病原体或病原体毒株(包括自然减毒株)中蛋白抗原的相应序列，在所表达的蛋白抗原的氨基酸序列中的修饰和/或截短。用于培养疏螺旋体基因种的“标准生长条件”要求在约33℃至约35℃范围的温度下、在bsk(barbourstoennerkelly)培养基中生长。根据callister等[detectionofborreliacidalantibodiesbyflowcytometry,sections11.5.1-11.5.12,currentprotocolsincytometry,johnwileyandsons,inc.supplement26,(2003)，其全部内容通过引用并入本文]制备本文中所述的bsk培养基。(bsk培养基也是可以购买获得的，例如从sigma,st.louis,mo)。如在本文中所使用的，“ospc7”是位于ospc的c-末端50个氨基酸内的7个氨基酸区域[lovrich等，clin.diagn.lab.immunol.,12:746-751,(2005)]中的免疫显性的ospc杀疏螺旋体抗体表位，如callister等[u.s.6,210,676b1和u.s.6,464,985b1]所公开的，其在已知的病原性疏螺旋体属种中是保守的。如lovrich等，[clin.diagn.lab.immunol.,12:746-751,(2005)]所描述的，通过blast检索编码7个氨基酸区段的密码子区段可以容易地证实这种保守性。在2006年10月09日进行的此类检索生成了包含上述ospc7-mer表位编码区段的100个疏螺旋体属种的结果列表。在特定实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码包含ospc7的ospc的抗原性片段。如在本文中所使用的，术语“保护”、或“提供对……的保护”、或“激发对……的保护性免疫”、和“辅助产生保护作用”不需要对感染的任何迹象提供全面的保护。例如，“辅助产生保护作用”可以指保护作用是足够的，使得在受到攻击后，至少可以减轻潜在感染的症状，和/或减轻和/或消除引起症状的一种或多种潜在细胞、生理或生化原因或机制。应当理解的是，如在本文中所使用的，“减轻”指相对于感染的状态，包括感染的分子状态，而不仅仅是感染的生理状态。如在本文中所使用的，“疫苗”是适于向动物应用的组合物，例如犬、猫或马(在某些实施方式中，包括人，而在其他实施方式中，特别地不是用于人的)，所述组合物包含通常与药学上可接受的载体(如含有水的液体)组合的一种或多种抗原，在向动物施用后能够诱导足够强的免疫应答，使其至少能够帮助保护动物免受野生型微生物感染引起的疾病的侵害，即强度足以帮助预防疾病和/或预防、改善或治愈疾病。如在本文中所使用的，多价疫苗是包含两种或多种不同抗原的疫苗。在这种类型的一个特定实施方式中，多价疫苗针对两种或多种不同病原体刺激受体的免疫系统。如在本文中所使用的，术语“复制子”指缺少一个或多个元件(例如，结构蛋白的编码序列)的经修饰的rna病毒基因组，如果这些元件存在，其将能够使亲本病毒在细胞培养物或动物宿主中成功繁殖。在适宜细胞环境中，复制子将自身扩增并可以产生一种或多种亚基因组rna种类(species)。如在本文中所使用的，术语“α病毒rna复制子颗粒”(简称为“rp”)是一种包装在结构蛋白(例如，衣壳和糖蛋白)中的α病毒衍生的复制子，所述结构蛋白也来源于α病毒，例如如在pushko等[virology239(2):389-401(1997)]中所描述的。rp无法在细胞培养物或动物宿主中繁殖(无辅助质粒或类似组分的情况下)，因为复制子不编码α病毒结构组分(例如，衣壳和糖蛋白)。编码ospa和/或ospc或其抗原性片段的rnarp中的异源性核酸序列处于α病毒亚基因组(sg)启动子，特别是26ssg启动子，优选veev26ssg启动子的转录控制下。在ospa和ospc编码序列的双rp构建体的情况下，构建体中的每条编码序列可以在单独的亚基因组启动子的转录控制下。在这样的双构建体中，上游编码序列对应于5’启动子位置和下游编码序列对应于3’启动子位置(正义rna；图1和图2)。优选地，上游和下游编码序列是相邻的。如在本文中所使用的，术语“药学上可接受的”作为形容词用于表示所修饰的名词是适用于药品的。例如，当将其用于描述药物疫苗中的赋形剂时，其表征了该赋形剂是与组合物中的其他成分具有相容性，并且对目标受体动物(例如，犬)无不利的有害作用。“胃肠外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输注。如在本文中所使用的，针对特定蛋白(例如，蛋白抗原)的术语“抗原性片段”指该蛋白具有抗原性的片段(包括从全长蛋白中仅缺失一个氨基酸的大片段)，即能够与免疫系统的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或t细胞抗原受体)发生特异性的相互作用。例如，外表面蛋白a(ospa)的抗原性片段是具有抗原性的ospa蛋白的片段。优选地，本发明的抗原性片段对抗体和/或t细胞受体识别具有免疫优势。在特定实施方式中，针对给定蛋白抗原的抗原性片段是保留全长蛋白抗原性的至少25％的该蛋白的片段。在优选的实施方式中，抗原性片段保留了全长蛋白抗原性的至少50％。在更优选的实施方式中，抗原性片段保留了全长蛋白抗原性的至少75％。抗原性片段可以小至7-20个氨基酸(如上所述)，或者在另一个极端，其是全长蛋白中仅缺失一个氨基酸的大片段。在特定实施方式中，抗原性片段包含25至150个氨基酸残基。在其他实施方式中，抗原性片段包含50至250个氨基酸残基。“ospc特异性杀疏螺旋体抗体”是一种例如从使用b.burgdorferiss50772(atccno.pta-439)免疫接种动物的血清中发现的抗体和选择性地与ospc抗原的任何表位结合的抗体，并且其依赖于或不依赖于补体杀死螺旋体。“ospc7特异性杀疏螺旋体抗体”是一种例如从使用b.burgdorferiss50772(atccno.pta-439)免疫接种动物的血清中发现的抗体和选择性地与ospc的7个c-末端氨基酸结合的抗体，如lovrich等[clin.diagn.lab.immunol.,12:746-751,(2005)]所描述的，并且其杀死螺旋体(通常通过诱导补体介导的膜攻击复合物)。ospc杀疏螺旋体抗体的特异性已经得到了公认。例如，ospc杀疏螺旋体抗体通常在莱姆病血清中通过测量b.burgdorferiss50772在杀疏螺旋体抗体测试中的敏感性来检测。来自患有密切相关疾病的人类患者的血清中很少(占2％)包含也杀死菌株50772的交叉反应性抗体[callister等，clinicalanddiagnosticlaboratoryimmunology3(4):399-4021(1996)进行了详细描述]。此外，使用ospc杀疏螺旋体表位的肽elisa准确地捕获莱姆病血清中的杀疏螺旋体抗体，来自患有密切相关疾病患者的血清中仅很少(<2％)包含也与ospc肽结合的交叉反应性抗体。当疫苗诱导的血清中“显著比例”的ospc特异性杀疏螺旋体抗体对保守的表位ospc7具有特异性时，这意味着用ospc7吸收血清后血清中ospc-特异性杀疏螺旋体抗体显著降低。优选地，将其定义为用ospc7吸收血清后，通过使用b.burgdorferiss50772检测到血清中杀疏螺旋体抗体滴度降低至少2倍，更优选地2至4倍，或血清中杀疏螺旋体抗体滴度降低更多。“补体特异性反应”是指需要存在血清补体以使得一种或多种疏螺旋体属种生物体被杀疏螺旋体抗体杀死的抗体反应。如在本文中所使用的，术语“灭活的”微生物可以与术语“杀死的”微生物互换使用。为了本发明的目的，“灭活的”伯氏疏螺旋体ss生物体是能够在动物中激发免疫应答，但不能感染动物的生物体。可以通过选自下述的试剂将伯氏疏螺旋体ss分离株灭活：二乙烯亚胺、福尔马林、β-丙内酯、硫柳汞或加热。在一个特定的实施方式中，使用二乙烯亚胺将伯氏疏螺旋体ss分离株灭活。如在本文中所使用的，“无佐剂疫苗”是不含佐剂的疫苗或多价疫苗。u.s.6,210,676中所述的b.burgdorferiss50772(atccno.pta-439)和u.s.6,316,005中所述的b.burgdorferisss-1-10(atccno.pta-1680)分别于1999年07月30日和2000年04月11日保藏在美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)，10801universityboulevardmanassas(va)20110。如在本文中所使用的，当两条序列的氨基酸残基相同时，一条氨基酸序列与另一条氨基酸序列是100％“相同的”或具有100％“同一性”。因此，当两条氨基酸序列50％的氨基酸残基相同时，一条氨基酸序列与另一条氨基酸序列是50％“相同的”。序列比较是在由给定蛋白(例如，所比较的蛋白或多肽的一部分)包含的氨基酸残基的连续嵌段上进行的。在一个特定的实施方式中，考虑了可能改变两条氨基酸序列之间对应性的选定的缺失或插入。如在本文中所使用的，可以使用c,macvector(macvector,inc.cary,nc27519)、vectornti(informax,inc.md)、oxfordmoleculargroupplc(1996)和clustalw算法，利用默认比对参数和针对同一性的默认参数确定核苷酸和氨基酸序列的同一性百分比。还可以使用相同或相似的默认参数，将这些可购买获得的程序用于确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级blast检索，例如使用默认参数的gcg(geneticscomputergroup，gcg软件包程序手册，第7版，madison,wisconsin)累积程序。还应理解的是，本发明不限于本文公开的特定构造、工艺步骤和材料，因为此类构造、工艺步骤和材料可以有所变化。还应理解的是，本文所采用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而并非旨在限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附权利要求及其等同方案限制。替代ospa菌株提供ospa抗原的菌株可以是常规的病原实验室b.burgdorferiss分离株[barbour等，j.clin.microbiol.52:478-484(1985)]，如b.burgdorferissb-31(atccno.35210)。特定的第二生物体是示例性b.burgdorferisss-1-10菌株(atccno.pta-1680)。适用于针对北美以外地区优化疫苗组合物的第二生物体的另外的菌株包括，例如，菌株：b.burgdorferissb-31(atccno.35210)、b.afzelii(例如，可以作为atccno.51567获得)和b.garinii(例如，可以作为atccno.51383和51991获得)，以及下表1中列出的那些。表11lagal等，j.clin.microbiol.41:5059-5065(2003)2heikkila等，j.clin.microbiol.40:1174-1180(2002)疫苗组合物可以通过任何标准途径容易地施用，包括静脉内、肌内、皮下、口服、鼻内、皮内和/或腹膜内接种。本领域技术人员将意识到，疫苗组合物优选地针对每种类型的受体动物和施用途径适当地配制。因此，本发明还提供了针对b.burgdorferiss和其他疏螺旋体属种免疫犬的方法。一种这样的方法包括向犬注射免疫有效量的本发明的疫苗，以使得犬产生适当的ospa和/或ospc。在特定实施方式中，抗体是杀疏螺旋体抗体。实施例下列实施例用于提供对本发明的进一步理解，但并非旨在以任何方式限制本发明的有效范围。实施例1由α病毒rna复制子颗粒递送的ospa和ospc疫苗的构建rna病毒已经作为载体-载剂用于引入已经基因工程化到其基因组中的疫苗抗原。然而，迄今为止，其用途主要限于将病毒抗原整合入rna病毒中，然后将病毒引入受体宿主中。结果是针对整合入的病毒抗原诱导保护性抗体。例如，α病毒复制子载体已用于通过分别表达c.botulinum神经毒素hc或b.anthracis保护性抗原来保护小鼠免受肉毒菌(botulinum)神经毒素和炭疽的侵害[lee等，vaccine24(47-48)6886-6892(2006)]。已将α病毒rna复制子颗粒用于编码致病抗原。已由几种不同α病毒开发了这样的α病毒复制子平台，包括委内瑞拉马脑炎病毒(vee)[pushko等，virology239:389-401(1997)]、辛德毕斯(sindbis)(sin)[bredenbeek等，journalofvirology67:6439-6446(1993)，其全部内容通过引用并入本文]和塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)(sfv)[liljestrom和garoff,biotechnology(ny)9:1356-1361(1991)，其全部内容通过引用并入本文]。此外，α病毒rna复制子颗粒是几种usda许可的猪和家禽疫苗的基础。这些包括：猪流行性腹泻疫苗，rna颗粒(产品代码19u5.p1)、猪流感疫苗，rna(产品代码19a5.d0)、禽流感疫苗，rna(产品代码19o5.d0)和处方产品，rna颗粒(产品代码9pp0.00)。如下所述，已经检验了α病毒rna复制子载体系统诱导犬产生针对ospa、ospc和dbpa具有特异的杀疏螺旋体(borreliacidal)抗体的能力。将ospa或ospc的编码序列整合入α病毒复制子中：将ospa(菌株297)和ospc(菌株50772)的氨基酸序列用于通过计算机产生密码子优化(使用灰狼(canislupus)密码子)的核苷酸序列。由商业供应商(atum,newark,ca)以合成dna形式制备优化序列。根据此前的描述[参见u.s.9,441,247b2，其全部内容通过引用并入本文]构建被设计为表达ospa或ospc的vee复制子载体，该载体具有下述修饰。使用限制性内切酶asci和paci消化来源于tc-83的复制子载体“pvek”[在u.s.9,441,247b2中公开和描述]。使用限制性内切酶asci和paci同样地消化dna质粒，所述dna质粒含有具有5’侧翼序列(5’-ggcgcgccgcacc-3’)[seqidno：5]和3’侧翼序列(5’-ttaattaa-3’)的ospa或ospc密码子优化的开放阅读框序列。然后，将合成的基因盒连接至经消化的pvek载体，并将所得到的克隆重新命名为“pvhv-ospa”和“pvhv-ospc”。根据此前描述的方法[u.s.9,441,247b2和u.s.8,460,913b2；其内容通过引用并入本文]制备tc-83rna复制子颗粒(rp)。简言之，在使用megascriptt7rna聚合酶和帽类似物(promega,madison,wi)进行体外转录之前，用noti限制性内切酶将pvhv复制子载体dna和辅助dna质粒线性化。重要的是，如此前所述[kamrud等，jgenvirol.91(pt7):1723-1727(2010)]，在制备中使用的辅助rna缺乏vee亚基因组启动子序列。将复制子和辅助组分的纯化rna合并并与vero细胞悬液混合，在4mm比色杯中电穿孔，然后再将其放入来自thermofisher,walthamma的以名称optipro销售的无血清细胞培养基中。孵育过夜后，通过使悬液通过zetaplusbiocap深层过滤器(3m,maplewood,mn)，使用含5％蔗糖(w/v)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，最终使用400mmnacl缓冲液洗脱保留的rp，从细胞和培养基中纯化α病毒rna复制子颗粒。将洗脱的rp配制成终浓度5％的蔗糖溶液(w/v)，通过0.22微米的膜过滤器，并于分装后保存。在感染的vero细胞单层上使用免疫荧光测定法确定功能性rp的滴度。根据由包装的复制子编码的基因鉴定rp批次：rp-ospa或rp-ospc。实施例2具有rp-ospa构建体的疫苗材料和方法构建体：如上文所述使用编码包含外表面蛋白a的免疫原性表位的抗原的核苷酸序列产生rp-ospa构建体。动物：将5月龄比格犬(marshallbioresources)共同饲养在养犬场中，自由摄食和饮水。制备rp-ospa疫苗：将osparna与辅助rna一起电穿孔进入vero细胞。在共电穿孔过程之后，将ospa包装到rp中，产生rp-ospa。然后，将rp-ospa与稳定剂(蔗糖、n-z胺、明胶)、0.9％盐水、两性霉素b和庆大霉素混合，以使1.0ml剂量含有目标浓度1.0x108个复制子颗粒/ml。之后，将疫苗冻干。接种和收集血清：用1ml剂量的rp-ospa疫苗在犬的颈部皮下接种疫苗，并在21天后再用1ml剂量加强免疫。在研究的第7、14、20、29、35和42天通过颈静脉的静脉穿刺采集全血。离心分离血清，并储存在-10℃或更低温度下直至进行检测。检测ospa杀疏螺旋体抗体：使用流式细胞术程序和b.burgdorferisss-1-10检测ospa杀疏螺旋体抗体[callister等，arch.intern.med.154:1625-1632(1994)]。检测ospaigg抗体：通过elisa检测ospaigg调理抗体。结果在加强免疫后2周，使用rp-ospa疫苗接种可靠地诱导高水平igg抗体，并且抗体应答包括大量的杀疏螺旋体ospa抗体。表2使用rp-ospa接种后的平均抗体滴度(n＝5)抗体类型第-1天第35天iggnda7610杀疏螺旋体nda3044and＝未检测到实施例3具有rp-ospc构建体的疫苗材料和方法构建体：如上文所述使用编码包含外表面蛋白c的免疫原性表位的抗原的核苷酸序列产生rp-ospc构建体。动物：将5月龄比格犬(marshallbioresources)共同饲养在养犬场中，自由摄食和饮水。制备rp-ospc疫苗：将ospcrna与辅助rna一起电穿孔进入vero细胞。在共电穿孔过程之后，将ospc包装到rp中，产生rp-ospc。然后，将rp-ospc与稳定剂(蔗糖、n-z胺、明胶)、0.9％盐水、两性霉素b和庆大霉素混合，以使1.0ml剂量含有目标浓度1.0x108个复制子颗粒/ml。之后，将疫苗冻干。接种和收集血清：用1ml剂量的rp-ospc疫苗在犬的颈部皮下接种疫苗，并在21天后再用1ml剂量加强免疫。在研究的第7、14、20、29、35和42天通过颈静脉的静脉穿刺采集全血。离心分离血清，并储存在-10℃或更低温度下直至进行检测。检测ospc杀疏螺旋体抗体：使用流式细胞术程序和b.burgdorferiss50772检测ospc杀疏螺旋体抗体[callister等，arch.intern.med.154:1625-1632(1994)]。检测ospcigg抗体：通过elisa检测ospcigg抗体。结果在加强免疫后2周，使用rp-ospc疫苗接种可靠地诱导高水平igg抗体，并且抗体应答包括大量的杀疏螺旋体ospc抗体。表3使用rp-ospc接种后的平均抗体滴度(n＝5)抗体类型第-1天第35天iggnda696杀疏螺旋体nda1940and＝未检测到结果表明包含rp-ospc的疫苗能够诱导显著水平的ospc杀疏螺旋体抗体。实施例4具有rp-ospa和rp-ospc的组合疫苗材料和方法构建体：如上文所述产生rp-ospa和rp-ospc构建体。动物：将5月龄比格犬(marshallbioresources)共同饲养在养犬场中，自由摄食和饮水。制备rp-ospa和rp-ospc组合疫苗：将rp-ospa和rp-ospc抗原与稳定剂(蔗糖、n-z胺、明胶)、0.9％盐水、两性霉素b和庆大霉素混合，以使1.0ml剂量含有每个构建体目标浓度1.0x108个复制子颗粒/ml。之后，将疫苗冻干。接种和收集血清：用1ml剂量的组合疫苗在犬的颈部皮下接种疫苗，并在21天后再用1ml剂量加强免疫。在研究的第7、14、20、29、35和42天通过颈静脉的静脉穿刺采集全血。离心分离血清，并储存在-10℃或更低温度下直至进行检测。检测杀疏螺旋体抗体：分别使用流式细胞术程序以及b.burgdorferisss-1-10或b.burgdorferiss50772检测ospa和ospc杀疏螺旋体抗体[callister等，arch.intern.med.154:1625-1632(1994)]。检测igg抗体：通过elisa检测ospa和ospc抗体。结果在加强免疫后2周，使用组合疫苗接种可靠地诱导高水平igg和杀疏螺旋体ospa和ospc抗体。结果表明包含rp-ospa和rp-ospc的组合疫苗能够诱导高水平ospa和ospc杀疏螺旋体抗体以及诱导高水平rp-ospc调理igg抗体。实施例5具有rp-ospa和rp-ospc的组合疫苗构建体：如上文所述产生rp-ospa和rp-ospc构建体。动物：将3月龄比格犬(ridglanfarms)共同饲养在养犬场中，自由摄食和饮水。制备rp-ospa和rp-ospc组合疫苗：治疗组a接受菌株s-1-10和50772的bei灭活细菌疫苗的组合(与5％的emulsigen佐剂溶液-mvplaboratoriesinc.,omaha,us混合)。将rp-ospa和rp-ospc抗原与稳定剂(蔗糖、n-z胺、明胶)、0.9％盐水、两性霉素b和庆大霉素混合，以使1.0ml剂量含有每个构建体目标浓度5.0x107个(治疗组b)、5.0x106个(治疗组c)或5.0x105个(治疗组d)复制子颗粒/ml。将疫苗冻干。接种和注射部位反应：用1ml剂量的组合疫苗在犬的颈部皮下接种疫苗，并在21天后再用1ml剂量加强免疫。在首次接种后的研究第3天和第4天和在第二次接种后的研究第24天和第25天对犬进行注射部位反应监测，直至感觉不到反应为止(表4)。基于类型和尺寸评价注射部位反应。根据是否可见、增厚、软、硬或触痛(tender)对反应评分，并以s1＝<1.0cm、s2＝1.0-2.0cm或s3＝>2.0cm对反应尺寸评分。结果表4注射部位反应s1＝<1.0cm；s2＝1.0–2.0cm；s3＝>2.0cm；t＝增厚；s＝软；h＝硬；v＝可见o＝无反应实施例6具有双插入rp-ospa/c构建体的组合疫苗材料和方法将ospa和ospc的编码序列整合入α病毒复制子中：如实施例1中所述制备asci和paci消化的来源于tc-83的复制子载体“pvek”。使用限制性内切酶asci和paci同样地消化两个dna质粒，所述dna质粒含有具有5’侧翼序列(5’-ggcgcgccgcacc-3’)[seqidno：5]和3’侧翼序列(5’-ttaattaa-3’)的ospa和ospc密码子优化的开放阅读框序列。合成的基因表达盒的设计整合一个开放阅读框(ospa或ospc)、含有α病毒亚基因组启动子和侧翼序列的非编码序列，以及然后另一个期望的开放阅读框(ospa或ospc)。α病毒亚基因组启动子和侧翼序列是5’-gtttaaactgtaaaacgacggccagtagtcgtcatagctgtttcctggctacctgagaggggcccctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaagatatcttcagcaccggtggcacc-3’[seqidno:6]。此设计复制了3’nsp4开放阅读框的短部分，天然α病毒亚基因组启动子和天然亚基因组序列的5’非翻译部分。还整合了限制性酶识别位点、非编码随机序列、引物结合位点和与第二个开放阅读框在5’紧邻的kozak共有序列。然后，将合成的基因表达盒连接至经消化的pvek载体，将所得到的克隆重新命名为“pvdg-ospa-ospc”或“pvdg-ospc-ospa”，名称的顺序表示表达盒中的相对5’和3’位置。如实施例1中所述产生rp。动物：将7-8周龄比格犬(ridglanfarms)共同饲养在养犬场中，自由摄食和饮水。制备rp-ospa/ospc或rp-ospc/ospa疫苗：将每个构建体的复制子rna与辅助rna(来源于vee衣壳辅助和糖蛋白序列)一起电穿孔进入vero细胞。在共电穿孔过程之后，将每个复制子包装到rp中，产生rp抗原。然后，将所得的rp收集在0.4mnacl磷酸缓冲液中，用5％(w/v)蔗糖配制，并通过免疫荧光测定法进行定量。将三个单独的疫苗与稳定剂(蔗糖、n-z胺、明胶)和0.9％盐水混合成1ml剂量。治疗组a中的疫苗针对每个单独的rp-ospa和rp-ospc抗原均含有目标剂量5.0x107。治疗组b中的疫苗针对rp-ospa/ospc双构建体抗原含有目标剂量5.0x107。治疗组c中的疫苗针对rp-ospc/ospa双构建体抗原含有目标剂量5.0x107。将疫苗冻干。接种和收集血清：用1ml剂量的疫苗在犬的颈部皮下接种疫苗，并在21天后再用1ml剂量加强免疫。在研究的第-1、28、35、70、92和119天通过颈静脉的静脉穿刺采集全血。离心分离血清，并储存在-10℃或更低温度下直至进行检测。检测ospa和ospc杀疏螺旋体抗体：使用流式细胞术程序和b.burgdorferisss-1-10检测ospa杀疏螺旋体抗体[callister等，arch.intern.med.154:1625-1632(1994)]。使用流式细胞术程序和b.burgdorferiss50772检测ospc杀疏螺旋体抗体[callister等，arch.intern.med.154:1625-1632(1994)]。结果在加强免疫后1周时，含有单独的rp-ospa和rp-ospc抗原的疫苗诱导中度水平的杀疏螺旋体抗体。在加强免疫后1周时，含有rp-ospa/ospc双构建体抗原的疫苗诱导高水平的针对ospc的杀疏螺旋体抗体，但相对低水平的针对ospa的杀疏螺旋体抗体。而相反的是，含有rp-ospc/ospa双构建体抗原的疫苗诱导高水平的针对ospa的杀疏螺旋体抗体，但相对低水平的针对ospc的杀疏螺旋体抗体。数据表明，当该基因位于构建体的下游位置时，诱导出对ospa或ospc更强的杀疏螺旋体抗体应答(表5)。表5杀疏螺旋体数据*将值40用于确定几何平均值使用b.burgdorferi感染的肩突硬蜱蜱虫(ixodesscapularisticks)进行攻击：在第二次接种后约2周使用b.burgdorferi感染的蜱虫进行实验性攻击。简言之，将9只雌性和8只雄性成年蜱虫放在橡胶杯中，用胶带和绷带包扎固定在每只犬的剃毛侧。在犬上饲喂蜱虫7天后将其除去。在攻击后1、2和3个月，使用4mm穿刺装置从每只犬的蜱虫附着部位附近的部位进行皮肤活检，以分离b.burgdorferi。将皮肤活检组织在富含bsa的培养基中孵育，并观察4周b.burgdorferi的生长情况。从肘部、腕骨、后膝关节和踝骨中收集犬左侧或显示出跛行和/或跛的肢体的组织样品，并进行pcr以分析b.burgdorferi(表6)。表6皮肤或关节b.burgdorferi阳性犬的数量序列表序列外表面蛋白a(seqidno:1)atgaaaaagtaccttttgggaatcggactcattctcgccctgatcgcctgcaagcaaaacgtgtcctccctcgacgaaaagaactcagtgtcggtggatctgcccggcgaaatgaaggtgctcgtgtccaaagagaagaacaaggatggaaaatacgacctgattgccaccgtggacaagctggagttgaagggcacctcagacaagaacaacgggtctggagtgctggaaggagtcaaagcggacaagtccaaggtcaagctgactatttcggacgacctgggccagactaccctggaagtgttcaaggaggacggaaagaccctggtgtccaagaaggtcacctccaaggataagtcgagcaccgaagagaagttcaatgagaagggagaagtgtcggagaagatcatcacccgcgccgatggaacccggctggagtacaccgagatcaagtccgatggttcggggaaggctaaggaagtcctgaagggctacgtgcttgagggtactctgactgcggaaaagaccactctggtggtcaaggaaggcaccgtgactctgtcaaagaacatctccaagagcggagaagtcagcgtggaactgaacgacacagattcctccgctgccacgaaaaagaccgccgcctggaacagcgggaccagcactctcaccattaccgtgaacagcaaaaagactaaggacctggtgttcaccaaggagaacacgatcaccgtgcagcagtatgactccaacggtaccaagctcgaagggtccgccgtggagatcactaagctggacgagattaagaatgcactgaagtga外表面蛋白a(seqidno:2)mkkyllgiglilaliackqnvssldeknsvsvdlpgemkvlvskeknkdgkydliatvdklelkgtsdknngsgvlegvkadkskvkltisddlgqttlevfkedgktlvskkvtskdkssteekfnekgevsekiitradgtrleyteiksdgsgkakevlkgyvlegtltaekttlvvkegtvtlsknisksgevsvelndtdssaatkktaawnsgtstltitvnskktkdlvftkentitvqqydsngtklegsaveitkldeiknalk*外表面蛋白cseqidno:3atgaagaagaatactctctccgccattctgatgaccctgttcctgtttatctcctgcaacaactccgggaaggatggcaacacctcggccaactccgccgatgaaagcgtcaagggtcccaacctgactgagatctcgaagaaaatcaccgagtccaacgcggtggtgttggcagtgaaggaggtcgaaactctgctgactagcatcgacgagcttgccaaggccattggaaagaagattaagaacgacgtgtcactggacaacgaagctgaccataacggatctcttatctcgggcgcttacctgatttcgaccctcatcaccaagaagatctccgcgatcaaggacagcggggagctcaaggccgaaattgagaaagcaaagaagtgctccgaagagttcaccgcgaagctcaagggagaacacaccgacctgggaaaggaaggcgtcaccgatgataacgcgaagaaggccatcctcaaaaccaacaacgacaagacaaagggcgccgacgaactggagaagctgttcgagagcgtgaagaatctgtccaaggccgccaaggaaatgttgacgaacagcgtgaaggaactgacctcccctgtggtggccgagtcaccgaaaaagccatga外表面蛋白c(seqidno:4)mkkntlsailmtlflfiscnnsgkdgntsansadesvkgpnlteiskkitesnavvlavkevetlltsidelakaigkkikndvsldneadhngslisgaylistlitkkisaikdsgelkaeiekakkcseeftaklkgehtdlgkegvtddnakkailktnndktkgadeleklfesvknlskaakemltnsvkeltspvvaespkkp*本发明不限于本文所述具体实施方式的范围。实际上，除了本文描述的那些以外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。这样的修改均旨在落入所附权利要求的范围内。还应理解的是，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并提供用于描述。当前第1页12