本发明涉及特异性结合杀昆虫蛋白并且可用于复合混合物中目的靶蛋白的示差检测或定量的合成非抗体蛋白支架。本发明进一步总体上涉及用于在生物样品(例如含有靶蛋白和非靶蛋白的复合混合物的转基因植物样品)中可靠地确定某些目的靶蛋白的存在和量的诊断方法，并且涉及为所述诊断方法提供基本试剂的测试试剂盒。
背景技术：
转基因作物由越来越复杂的遗传修饰(包括赋予不同性状的多个转基因，也称为“基因堆叠”或“性状堆叠”)组成。例如，目前市场上的许多转基因玉米产品在同一植物内含有用于控制广谱昆虫有害生物的多种杀昆虫蛋白和赋予植物对广谱化学除草剂的耐受性的多种蛋白。许多用于控制昆虫有害生物的转基因蛋白(例如来自苏云金芽孢杆菌的晶体内毒素(称为cry蛋白))可以彼此结构上密切相关并且具有相似的总体氨基酸序列同一性或含有具有显著同一性的基序或结构域。一般而言，cry蛋白例如具有三个结构性结构域：n-末端结构域i，从残基1至约290，由7个α螺旋组成；结构域ii，从约残基291-500，含有三个β片层；以及c-末端结构域iii，从约残基501-644，为β夹层(beta-sandwich)。大多数针对鳞翅目或鞘翅目昆虫有活性的cry蛋白在结晶基体中分别形成为130-140kda或60-70kda的原毒素。在鳞翅目昆虫中，肠的碱性ph溶解这种晶体并且然后肠蛋白酶将130-140kda的原毒素加工成大约60-70kda的毒蛋白。在鞘翅目昆虫中，60-70kda的原毒素被加工成55-67kda的毒素。鳞翅目活性cry蛋白的实例包括cry1a、cry1b、cry1c、cry1d、cry1e、cry1f和cry9。鞘翅目活性cry蛋白的实例包括cry3a、cry3b、cry3c、cry8、二元cry23-cry37以及二元cry34-cry35。已报道将cry蛋白原毒素蛋白水解加工成杀昆虫毒素是通过去除n-末端和c-末端的氨基酸而进行的，其中进行加工的确切部位取决于特异性cry蛋白以及所涉及的特异性昆虫肠液(ogiwara等人,1992,j.invert.pathol.[无脊椎动物病理学杂志]60:121-126)。gry原毒素的这种蛋白水解激活在确定其特异性方面能够发挥重要作用。
文献中已经披露了许多成功的创造杂合cry蛋白的尝试。例如，将来自cry1aa蛋白的蚕蛾(家蚕(bombyxmori))特异性结构域移动至cry1ac蛋白，由此将一种新的杀昆虫活性赋予生成的cry1aa-cry1ac嵌合蛋白(ge等人1989,pnas[美国科学院院刊]86:40374041)。thompson等人，1996和1997(美国专利5,527,883和5,593,881)用cry1ab蛋白的原毒素尾区替换野生型cry1f蛋白和cry1c蛋白的原毒素尾区以制造cry1f-cry1ab杂合cry蛋白和cry1c-cry1ab杂合cry蛋白，它们在某些表达宿主细胞中都具有改进的表达。bosch等人，1998(美国专利5,736,131)通过如下创造了新的鳞翅目活性蛋白：用cry1ca蛋白的结构域iii取代cry1ea蛋白和cry1ab蛋白的结构域iii，从而产生称为g27的cry1e-cry1c杂合cry蛋白和称为h04的cry1ab-cry1c杂合cry蛋白，它们都具有比野生型cry蛋白亲本分子更宽的鳞翅目活性谱。malvar等人，2001(美国专利6,242,241)将cry1ac蛋白的结构域i与cry1f蛋白的结构域ii和iii以及原毒素尾部进行结合以产生比母体野生型cry蛋白具有更广杀昆虫活性的cry1ac-cry1f杂合cry蛋白。bogdanova等人，2011(美国专利8,034,997)将cry1ab蛋白的结构域i和ii与cry1fa蛋白的结构域iii结合，并添加cry1ac蛋白原毒素尾部以产生称为cry1a.105的新的鳞翅目活性杂合cry蛋白。而且，hart等人，2012(美国专利8,309,516)将修饰的cry3a蛋白的结构域i和ii与cry1ab蛋白的结构域iii结合，并添加cry1ab蛋白原毒素尾部的一部分以产生称为fr8a的鞘翅目活性杂合cry蛋白(也称为ecry3.1ab)。迄今为止报道的大多数杂合cry蛋白已经使用了全部或部分相同类型的野生型cry蛋白，如cry1aa、cry1ab、cry1ac、cry1c、cry1f和cry3a。
若干野生型cry蛋白，例如cry1ab、cry1ac、cry1c、cry1f、cry2a、cry2ba、cry3a、cry3b、cry9c和cry34-cry35，以及营养期杀昆虫蛋白，例如vip3a(参见美国专利5,877,012)，已经在转基因作物植物中表达，包括玉米、棉花、稻和大豆，早自1996年以来，其中一些已经在商业上被用于控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。最近，已经在商业上引入了转基因作物产品，例如玉米，所述转基因作物产品含有其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入的工程化的cry蛋白(例如，修饰的cry3a(mcry3a；us专利7,230,167))和杂合cry蛋白(例如上述ecry3.1ab和cry1a.105)。
重组dna技术越来越多地用于产生商业和工业用途的转基因植物，这需要开发分析转基因植物系的诊断方法。需要此类方法来通过连续世代的育种维持转基因植物品种，监测环境中或源自转基因植物的生物样品中的转基因植物或植物部分的存在，以及协助快速产生并且开发具有期望的或最佳的表型的新转基因植物。此外，目前许多国家的监管机构关于转基因植物的安全性评估指导原则需要在dna和蛋白水平的表征，从而获得并且维持监管批准。堆叠到如上所述的转基因植物中的基因和蛋白越来越复杂，使得在复合混合物内检测和定量任何一种靶蛋白的特异性变得困难，特别是在堆叠的转基因蛋白彼此相似、或与环境中的野生型非转基因蛋白相似、或与相对于转基因植物而言内源的非转基因蛋白相似的情况下。
免疫测定是目前农业产业中用于检测和定量通过植物遗传修饰而引入的蛋白的优选方法。免疫测定的关键部分是对靶蛋白(抗原)具有特异性的抗体。免疫测定可以是高度特异性的，并且样品在被分析前通常只需要一个简单的准备。此外，免疫测定可以在很宽的浓度范围内定性或定量地使用。典型地，免疫测定需要针对每种目的蛋白进行单独的测试。抗体可以是在动物中产生的多克隆的或者是由细胞培养物产生的单克隆的抗体。就其性质而言，多克隆抗体的混合物将具有多个识别表位，所述识别表位可以增加敏感性，但是也可能降低特异性，因为序列和结构与其他蛋白具有同源性的可能性随着不同抗体互补位的存在数量而增加。单克隆抗体比多克隆抗体具有一些优点，因为它们对单个表位或抗原决定簇表达均匀的亲和力和特异性，并且可以大量生产。然而，所有抗体中存在固有特性限制其在更高要求的应用(例如复合混合物中的单个转基因蛋白、或相似的转基因蛋白或内源蛋白的示差检测和定量)中的使用。此外，多克隆抗体和单克隆抗体都可能需要进一步纯化步骤来增强灵敏度并降低测定中的背景。
由于它们对在某些条件下的使用具有限制，使用进化的ob折叠蛋白开发了抗体的替代方案(pecorari和alzari,2016.美国专利9,422,548)。ob折叠蛋白是如由murzin(1993,emboj.[欧洲分子生物学组织杂志]12:861-867)和arcus(2002,curr.opin.struct.biol.[结构生物学现行观点]12:794-801)所述的任何具有ob折叠拓扑的蛋白。例如，ob折叠蛋白sac7d(已知以其天然形式结合dna分子，在体外进化，并且由pecorari和alzari(同上)所示出)以高特异性和亲和力结合蛋白。通过将暴露于溶剂的残基随机化而使sac7d的天然结合位点重新工程化，这允许从野生型sac7d蛋白产生所谓的
目前，对含有转基因蛋白的转基因植物产品进行有效的鉴定或定量商业作物产品中的转基因蛋白取决于免疫测定的准确性。成功的免疫测定的发展取决于用于开发抗体所使用的抗原的某些特征，即抗原的大小、疏水性和三级结构以及抗体的品质和准确性。必须仔细检查抗体的特异性以阐明与类似物质的任何交叉反应性，所述类似物质可能导致假阳性结果。目前行业存在的问题在于，可商购的测试试剂盒中的许多抗体不能区分各种产物中的相似转基因蛋白、或区分转基因蛋白与野生型蛋白，这使得差异化的产物鉴定和定量变得困难或不可能。例如，在使用一种或多种相同的野生型cry蛋白(例如cry1ab、cry1ac、cry1f和cry3)的许多目前商业的转基因作物产品的情况下，并且在引入表达杂合cry蛋白(所述杂合cry蛋白由全部或部分的已经在转基因作物产品中的相同野生型cry蛋白组成)的作物的情况下，仍然需要开发新的和改进的诊断方法，以能够当一起处于复合的生物样品(例如来自转基因植物、转基因植物部分或转基因微生物的样品)中时将野生型cry蛋白彼此区分，以及将野生型cry蛋白与含有全部或部分的相同野生型cry蛋白的杂合cry蛋白进行区分。尽管非抗体蛋白支架显示有希望用作生物医学治疗剂的配体，但是尚未弄清在它们在帮助示差检测复合生物基质(如转基因植物或来自转基因植物的样品)中高度相似的转基因杀昆虫蛋白方面是否具有功能效用。
技术实现要素：
本发明通过提供可用于转基因蛋白的特异性检测和区分的组合物，解决了对新的和改进的诊断方法的需求。更特别地，本发明提供了组合物、方法、测定和试剂盒，所述组合物、方法、测定和试剂盒用于在包含野生型蛋白和杂合蛋白两者的复合生物样品中(例如在转基因植物、转基因植物部分、或转基因细菌中)，特异性检测野生型杀昆虫蛋白，并且将野生型杀昆虫蛋白彼此特异性区分以及与包含野生型蛋白氨基酸序列的全部或部分的工程化杂合蛋白特异性区分。
根据一些方面，本发明提供了结合杀昆虫蛋白的合成非抗体蛋白支架(synnaps)、或其抗原结合片段。当靶转基因杀昆虫蛋白处于一种或多种非靶转基因杀昆虫蛋白存在下时，此类synnaps可用于所述靶蛋白的示差和特异性的检测或定量。
在其他方面，本发明提供了当靶转基因杀昆虫蛋白处于一种或多种非靶转基因杀昆虫蛋白存在下时对所述靶蛋白具有示差结合亲和力的合成非抗体蛋白支架(synnaps)或其抗原结合片段，其中所述靶蛋白a)跨越其整个长度，与所述非靶蛋白中的一种或多种具有至少70％到至少95％序列同一性；或b)包含与所述非靶蛋白中的一种或多种的区域具有至少25％到至少95％序列同一性的区域。
在其他方面，本发明的synnaps结合、或示差检测或定量具有包含seqidno:1-7中任一项的氨基酸序列的杀昆虫蛋白。在其他方面，synnaps具有包含seqidno:10-17、19、21、24-31、33或35中任一项的氨基酸序列。
在本发明的仍其他的方面，本发明的synnaps的氨基酸序列与seqidno:10、seqidno:17或seqidno:21具有至少80％到至少99％序列同一性，并且其中(a)与seqidno:10具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于seqidno:10的位置22的位置处或在seqidno:10的位置22处具有tro(w)、在对应于seqidno:10的位置29的位置处或在seqidno:10的位置29处具有ser(s)、在对应于seqidno:10的位置31的位置处或在seqidno:10的位置31处具有tyr(y)、和在对应于seqidno:10的位置44的位置处或在seqidno:10的位置44处具有arg(r)；或(b)与seqidno:17具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于seqidno:17的位置29的位置处或在seqidno:17的位置29处具有ile(i)、和在对应于seqidno:17的位置42的位置处或在seqidno:17的位置42处具有phe(f)；或(c)与seqidno:21具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于seqidno:21的位置22的位置处或在seqidno:21的位置22处具有his(h)、在对应于seqidno:21的位置31的位置处或在seqidno:21的位置31处具有arg(r)、在对应于seqidno:21的位置40的位置处或在seqidno:21的位置40处具有leu(l)、和在对应于seqidno:21的位置44的位置处或在seqidno:21的位置44处具有tyr(y)。在另外的方面，synnaps具有包含seqidno:56-59、61-63、66、67、69-75、77-79、81-86、88-90、92或95中任一项的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供了本发明的synnaps的抗原结合片段。在其他方面，所述抗原结合片段包含seqidno:9-36中任一项的至少约14个到至少约65个氨基酸。在其他方面，所述抗原结合片段包含seqidno:96-98中的任一项。在仍其他的方面，本发明的synnaps的抗原结合片段包含seqidno:42-55中的任一项。
在本发明的上述方面的某些实施例中，靶蛋白是cry1a蛋白、mcry3a蛋白、ecry3.1ab蛋白或包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白。
在上述方面的其他实施例中，一种或多种非靶蛋白选自由以下组成的组：cry1a蛋白、cry1b蛋白、cry1f蛋白、cry1i蛋白、cry1j蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白、包含cry1f蛋白的结构域iii的杂合cry蛋白、修饰的cry3a蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域iii的杂合cry3蛋白、和vip3蛋白。
在本发明的上述方面的其他实施例中，靶蛋白是cry1a蛋白、mcry3a蛋白、ecry3.1ab蛋白、或包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白，并且一种或多种非靶蛋白选自由以下组成的组：cry1a蛋白、cry1b蛋白、cry1f蛋白、cry1i蛋白、cry1j蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白、包含cry1f蛋白的结构域iii的杂合cry蛋白、修饰的cry3a蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域iii的杂合cry3蛋白、和vip3蛋白。在一些实施例中，cry1a蛋白是cry1aa、cry1ab或cry1ai。在其他实施例中，杂合cry蛋白是cry1ab.1ca蛋白或cry1a.105蛋白。
在上述方面的仍其他的实施例中，靶蛋白是a)cry1ab，并且非靶蛋白包括mcry3a或ecry3.1ab；或b)mcry3a，并且非靶蛋白包括cry1ab或ecry3.1ab；或c)ecry3.1ab，并且非靶蛋白包括cry1ab或mcry3a；或d)cry1ab或cry1ab.1ca，并且非靶蛋白包括cry1aa或cry1ai；或e)cry1ab或cry1ai蛋白，并且非靶蛋白包括cry1aa或cry1ab.1c；或f)cry1ab、cry1ai或cry1ab.cry1c蛋白，并且非靶蛋白是cry1aa；或g)cry1ab蛋白或cry1ab.cry1c蛋白，并且非靶蛋白包括cry1aa或cry1ai蛋白；或h)cry1aa或cry1ai蛋白，并且非靶蛋白包括cry1ab蛋白或cry1ab.1ca蛋白。
在本发明的上述方面的仍其他的实施例中，其中cry1ab蛋白包含由seqidno:1表示的氨基酸序列，mcry3a蛋白包含由seqidno:2表示的氨基酸序列，ecry3.1ab蛋白包含由seqidno:3表示的氨基酸序列，cry1aa蛋白包含由seqidno:4表示的氨基酸序列，cry1ai蛋白包含由seqidno:5表示的氨基酸序列，cry1ab.1ca蛋白包含由seqidno:6表示的氨基酸序列或cry1a.105蛋白包含由seqidno:7表示的氨基酸序列。
在上述方面的另一个实施例中，在mcry3a或ecry3.1ab存在下特异性结合cry1ab的synnaps包含seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12或seqidno:13。在另一个实施例中，在cry1ab和ecry3.1ab存在下特异性结合mcry3a蛋白的synnaps包含seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16或seqidno:17。在另一个实施例中，在cry1ab和mcry3a存在下特异性结合ecry3.1ab的synnaps包含seqidno:21。在另一个实施例中，在cry1aa或cry1ai存在下结合cry1ab或cry1ab.1ca的synnaps包含seqidno:13。在另一个实施例中，在cry1ab存在下结合ecry3.1ab或mcry3a或cry1ai或cry1aa的synnaps包含seqidno:19。
在上述方面的其他实施例中，靶蛋白和非靶蛋白在来自转基因植物或转基因微生物的生物样品中。在这个实施例的一个方面中，转基因植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、低芥酸菜籽植物、小麦植物或稻植物。在另一个方面，转基因微生物是细菌、酵母或病毒。在仍另一个方面，转基因细菌是大肠杆菌、假单胞菌属物种或芽孢杆菌属物种。
在另一个方面，本发明提供了编码本发明的synnaps的核酸分子。在这个方面的一些实施例中，本发明进一步提供了包含所述核酸分子的转基因生物。在一些实施例中，转基因生物是转基因植物或转基因微生物。在其他实施例中，转基因植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、低芥酸菜籽植物、小麦植物或稻植物。在这个方面的仍其他的实施例中，微生物是细菌、酵母或病毒。在其他实施例中，细菌是大肠杆菌、假单胞菌属物种或芽孢杆菌属物种。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的第一synnaps和第二配体的组合物，其中所述synnaps和所述第二配体在包含靶蛋白和非靶蛋白的生物样品的免疫测定中共同起作用以示差检测或定量靶蛋白。在其他方面，非靶蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了用于在包含靶杀昆虫蛋白和非靶杀昆虫蛋白的复合生物基质中示差检测所述靶杀昆虫蛋白的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含本发明的第一synnaps和不同于所述第一synnaps的第二配体，所述第一synnaps和所述第二配体在免疫测定中共同起作用以示差检测或定量所述靶杀昆虫蛋白。在其他方面，非靶蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。
根据本发明的其他方面，提供了用于在包含靶杀昆虫蛋白和非靶杀昆虫蛋白的生物样品中示差检测或定量靶蛋白的方法，所述方法包括(a)获得包含所述靶杀昆虫蛋白和所述非靶杀昆虫蛋白的生物样品；(b)对所述生物样品进行免疫测定，其中所述免疫测定包括使用本发明的第一synnaps和不同于所述第一synnaps的第二配体在所述免疫测定中共同起作用，以示差检测或定量所述靶杀昆虫蛋白而不是所述非靶杀昆虫蛋白，这导致所述靶杀昆虫蛋白的示差检测或定量。在其他方面，非靶蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。在其他方面，第二配体是抗体或本发明的synnaps。
根据另一个方面，本发明提供了用于在包含靶杀昆虫蛋白和非靶杀昆虫蛋白的生物样品中示差检测或定量靶蛋白的免疫测定方法，所述方法包括：(a)用结合所述靶蛋白但不结合所述非靶蛋白的本发明的第一synnaps涂覆第一固体表面，并且用结合所述非靶蛋白的第二结合蛋白涂覆第二固体表面；(b)在有效允许形成靶蛋白-synnaps复合物但不允许形成非靶蛋白-synnaps复合物的条件下，使所述生物样品与所述synnaps接触，生成靶蛋白耗尽的生物样品；(c)去除所述靶蛋白耗尽的生物样品，并且在有效允许形成非靶蛋白-第二结合蛋白复合物的条件下，使所述靶蛋白耗尽的生物样品与所述第二结合蛋白接触；(d)检测或定量所述第一固体表面上的靶蛋白复合物；以及(e)检测或定量所述第二固体表面上的非靶蛋白。在其他方面，非靶蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。
在上述方面的一些实施例中，免疫测定是酶联免疫吸附测定(elisa)、蛋白质印迹、免疫色谱法或免疫定位。在这个实施例的一个方面中，在固体表面上进行免疫测定。在另一个方面，固体表面是微量滴定盘。在这个实施例的另一个方面，第二配体是抗体或不同于第一synnaps的第二synnaps。在这个实施例的另一个方面，将第一synnaps用作涂覆配体(coatingligand)，并且将第二配体用作检测配体。在这个实施例的另一个方面，将第一synnaps用作检测配体，并且将第二配体用作涂覆配体。
在本发明的上述方面的一些实施例中，所述生物样品是转基因植物样品。在这个实施例的一些方面，转基因植物是转基因玉米植物。在其他方面，转基因玉米植物包含选自由以下组成的组的转基因玉米事件：事件bt11、事件mir604、事件5307、事件mon89034和事件mon810。在其他方面，转基因玉米植物包含事件bt11、mir604、事件5307和任选地事件mon89034。在其他方面，生物样品包含来自事件bt11的cry1ab蛋白、来自mir604的mcry3a、和来自事件5307的ecry3.1ab杂合cry蛋白。在仍其他的方面，cry1ab包含seqidno:1，ecry3.1ab包含seqidno:2，并且mcry3a包含seqidno:3。在其他方面，生物样品进一步包含来自事件mon89034的cry1a.105杂合cry蛋白。在仍其他的方面，cry1a.105包含seqidno:7。
序列表中的序列简述
seqidno:1是cry1ab杀昆虫蛋白的氨基酸序列。
seqidno:2是ecry3.1ab杂合杀昆虫蛋白的氨基酸序列。
seqidno:3是mcry3a杀昆虫蛋白的氨基酸序列。
seqidno:4是cry1aa杀昆虫蛋白的氨基酸序列。
seqidno:5是cry1ai杀昆虫蛋白的氨基酸序列。
seqidno:6是cry1ab.1ca杀昆虫蛋白的氨基酸序列。
seqidno:7是cry1a.105杀昆虫蛋白的氨基酸序列。
seqidno:8是sac7d野生型配体的氨基酸序列。
seqidno:9是synnaps-1配体的氨基酸序列。
seqidno:10是synnaps-2配体的氨基酸序列。
seqidno:11是synnaps-3配体的氨基酸序列。
seqidno:12是synnaps-4配体的氨基酸序列。
seqidno:13是synnaps-5配体的氨基酸序列。
seqidno:14是synnaps-6配体的氨基酸序列。
seqidno:15是synnaps-7配体的氨基酸序列。
seqidno:16是synnaps-8配体的氨基酸序列。
seqidno:17是synnaps-9配体的氨基酸序列。
seqidno:18是synnaps-10配体的氨基酸序列。
seqidno:19是synnaps-11配体的氨基酸序列。
seqidno:20是synnaps-12配体的氨基酸序列。
seqidno:21是synnaps-13配体的氨基酸序列。
seqidno:22是synnaps-14配体的氨基酸序列。
seqidno:23是synnaps-1标签配体的氨基酸序列。
seqidno:24是synnaps-2标签配体的氨基酸序列。
seqidno:25是synnaps-3标签配体的氨基酸序列。
seqidno:26是synnaps-4标签配体的氨基酸序列。
seqidno:27是synnaps-5标签配体的氨基酸序列。
seqidno:28是synnaps-6标签配体的氨基酸序列。
seqidno:29是synnaps-7标签配体的氨基酸序列。
seqidno:30是synnaps-8标签配体的氨基酸序列。
seqidno:31是synnaps-9标签配体的氨基酸序列。
seqidno:32是synnaps-10标签配体的氨基酸序列。
seqidno:33是synnaps-11标签配体的氨基酸序列。
seqidno:34是synnaps-12标签配体的氨基酸序列。
seqidno:35是synnaps-13标签配体的氨基酸序列。
seqidno:36是synnaps-14标签配体的氨基酸序列。
seqidno:37是本发明的his标签的氨基酸序列。
seqidno:38是本发明抗生物素蛋白标签的氨基酸序列。
seqidno:39是编码seqidno:24的核苷酸序列。
seqidno:40是编码seqidno:31的核苷酸序列。
seqidno:41是编码seqidno:35的核苷酸序列。
seqidno:42是synnaps1的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:43是synnaps2的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:44是synnaps3的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:45是synnaps4的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:46是synnaps5的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:47是synnaps6的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:48是synnaps7的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:49是synnaps8的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:50是synnaps9的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:51是synnaps10的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:52是synnaps11的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:53是synnaps12的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:54是synnaps13的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:55是synnaps14的抗原结合片段的氨基酸序列。
seqidno:56-69是synnaps2变体的氨基酸序列。
seqidno:70-82是synnaps9变体的氨基酸序列。
seqidno:83-95是synnaps13变体的氨基酸序列。
seqidno:96是synnaps2抗原结合片段的共有序列。
seqidno:97是synnaps9抗原结合片段的共有序列。
seqidno:98是synnaps13抗原结合片段的共有序列。
具体实施方式
本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文陈述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，本文建议的不同实施例的众多变化以及附加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，在本发明的说明书和所附权利要求中所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的发明的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
本文提供的核苷酸序列以5’至3’方向从左至右表示，并且使用代表核苷酸碱基的标准代码表示，如37cfr§§1.821-1.825和世界知识产权组织(wipo)标准st.25中所述，例如：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、以及鸟嘌呤(g)。
氨基酸同样是使用wipo标准st.25来指示，例如：丙氨酸(ala；a)、精氨酸(arg；r)、天冬酰胺(asn；n)、天冬氨酸(asp；d)、半胱氨酸(cys；c)、谷氨酰胺(gln；q)、谷氨酸(glu；e)、甘氨酸(gly；g)、组氨酸(his；h)、异亮氨酸(ile；1)、亮氨酸(leu；l)、赖氨酸(lys；k)、甲硫氨酸(met；m)、苯丙氨酸(phe；f)、脯氨酸(pro；p)、丝氨酸(ser；s)、苏氨酸(thr；t)、色氨酸(trp；w)、酪氨酸(tyr；y)、以及缬氨酸(val；v)。
定义
如本文使用的，单数形式“一个/一种”以及“所述”包括多个指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物等。如本文使用的，词语“或”意指特定清单的任何一个成员并且还包括这个清单的成员的任何组合(即，还包括“和”)。
术语“约”本文用于意指大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。一般而言，术语“约”本文用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，精确值(即，无“约”)是优选的。
如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含四条多肽链(两条重(h)链和两条轻(l)链)的任何免疫球蛋白(ig)分子，或其保留ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此类突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。
如本文使用的，术语“抗原”意指包含可以由配体(例如本发明的synnaps或抗体)识别并且结合的表位的蛋白。
如本文使用的，术语“抗原结合位点”或“互补位”是指结合靶蛋白抗原的全部或一部分以及与其互补的本发明的配体的一个或多个部分。在synnaps肽中，它被称为synnaps抗原结合位点，并且包含结合靶蛋白抗原的全部或一部分以及与其互补的synnaps的部分。在靶蛋白很大的情况下，本发明的synnaps可以仅结合靶蛋白的特定部分，所述部分称为表位。
术语“包含(comprises或comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、或其组的存在或添加。
如本文使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。
术语“接触”是指使本发明的配体与生物样品接触的联合动作，并且更特别是指以使存在于生物样品中的配体与转基因蛋白之间发生结合相互作用的方式，使配体与本发明的转基因蛋白接触的联合动作。
术语“交叉反应性”是指配体结合多种蛋白的能力。此类蛋白可以是靶蛋白和非靶蛋白。
如本文使用的，术语“cry蛋白”是指在芽孢杆菌属物种(例如苏云金芽孢杆菌)生长周期的孢子形成阶段期间，在天然条件下以结晶形式积聚为原毒素的呈球状蛋白质分子的杀昆虫蛋白。术语“cry毒素”以及“δ-内毒素”可以与术语“cry蛋白”互换地使用。对于cry蛋白和编码cry蛋白的基因的当前命名法基于氨基酸序列同源性(crickmore等人,(1998),microbiol.mol.biol.rev.[微生物分子生物学评论],62:807-813)。在本领域公认的分类中，每种cry蛋白被指定唯一的名称，所述名称合并了初级等级(阿拉伯数字)、二级等级(大写字母)、三级等级(小写字母)、以及四级等级(另一个阿拉伯数字)。例如，根据crickmoe等人，具有<45％同源性的两个cry蛋白将被指定唯一的初级等级，例如cry1和cry2。具有>45％但<70％同源性的两个cry蛋白将接受相同的初级等级，但是将被指定不同的二级等级，例如cry1a和cry1b。具有70％至95％同源性的两个cry蛋白将被指定相同的初级等级和二级等级，但是将被指定不同的三级等级，例如cry1aa和cry1ab。并且具有>95％但<100％同源性的两个cry蛋白将被指定相同的初级等级、二级等级和三级等级，但是将被指定不同的四级等级，例如cry1ab1和cry1ab2。
如本文使用的，“cry1ab蛋白”意指源自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫晶体蛋白，其(无论是天然存在的还是合成的)包含与全型cry1ab氨基酸序列(根据crickmore等人(同上))具有至少96％同一性的氨基酸序列并且在因特网站“lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt”上披露为登录号aaa22330)。cry1ab(具有登录号)的实例包括但不限于cry1ab1(aaa22330)、cry1ab2(aaa22613)、cry1ab3(aaa22561)、cry1ab4(baa00071)、cry1ab5(caa28405)、cry1ab6(aaa22420)、cry1ab7(caa31620)、cry1ab8(aaa22551)、cry1ab9(caa38701)、cry1ab10(a29125)、cry1ab11(i12419)、cry1ab12(aac64003)、cry1ab13(aan76494)、cry1ab14(aag16877)、cry1ab15(aao13302)、cry1ab16(aak55546)、cry1ab17(aat46415)、cry1ab18(aaq88259)、cry1ab19(aaw31761)、cry1ab20(abb72460)、cry1ab21(abs18384)、cry1ab22(abw87320)、cry1ab23(hq439777)、cry1ab24(hq439778)、cry1ab25(hq685122)、cry1ab26(hq847729)、cry1ab27(jn135249)、cry1ab28(jn135250)、cry1ab29(jn135251)、cry1ab30(jn135252)、cry1ab31(jn135253)、cry1ab32(jn135254)、cry1ab33(aas93798)、cry1ab34(kc156668)、cry1ab35(kt692985)、和cry1ab36(ky440260)。
如本文使用的，术语“cry3”是指与分类为cry3的先前描述的序列(根据crickmore等人(同上))共享高度序列同一性或相似性的杀昆虫蛋白，其实例披露在因特网站“lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/”上并且包括(具有登录号)cry3aa1(aaa22336)、cry3aa2(aaa22541)、cry3aa3(caa68482)、cry3aa4(aaa22542)、cry3aa5(aaa50255)、cry3aa6(aac43266)、cry3aa7(cab41411)、cry3aa8(aas79487)、cry3aa9(aaw05659)、cry3aa10(aau29411)、cry3aa11(aaw82872)、cry3aa12(aby49136)、cry3ba1(caa34983)、cry3ba2(caa00645)、cry3ba3(jq397327)、cry3bb1(aaa22334)、cry3bb2(aaa74198)、cry3bb3(i15475)、和cry3ca1(caa42469)。已经通过插入、取代或缺失氨基酸而工程化的cry3蛋白在本文称为“修饰的cry3蛋白”或“mcry3蛋白”。与从其衍生出“修饰的cry3蛋白”的野生型cry3蛋白相比，此类“修饰的cry3蛋白”典型地具有针对某些昆虫有害生物(例如玉米根虫(根萤叶甲属物种))的增强的活性。“修饰的cry3蛋白”的实例是由seqidno:3的氨基酸序列表示的“mcry3a”。“修饰的cry3”蛋白的其他实例包括但不限于披露于美国专利8,247,369中的“mcry3a蛋白”、披露于美国专利9,109,231中的“mcry3a蛋白”、和披露于美国专利6,060,594中的“mcry3b蛋白”。
术语“ecry3.1ab”是指工程化的杂合杀昆虫蛋白，其在n-末端至c-末端方向包含融合至如描述于美国专利8,309,516中的cry1aa或cry1ab蛋白的c-末端区域的cry3a的n-末端区域。“ecry3.1ab蛋白”的实例由seqidno:2的氨基酸序列表示。
如本文使用的，术语“示差结合亲和力”是指配体(例如本发明的synnaps)的结合特性，其中当靶转基因蛋白处于一种或多种非靶转基因蛋白存在下时，所述配体结合所述靶转基因蛋白且不结合所述一种或多种非靶转基因蛋白。例如，当cry1ab转基因蛋白处于一种或多种非靶转基因蛋白(包括ecry3.1ab杀昆虫蛋白或mcry3a杀昆虫蛋白)存在下时，本发明的synnaps配体可以示差结合靶cry1ab转基因杀昆虫蛋白。或者，对于另一个实例，当ecry3.1ab转基因蛋白处于一种或多种非靶转基因蛋白(包括cry1ab或mcry3a)存在下时，本发明的不同synnaps配体可以示差结合靶ecry3.1ab转基因蛋白。
如本文使用的，术语转基因“事件”是指通过用异源dna(例如，包括目的基因的表达盒)转化和再生单个植物细胞而产生的重组植物。术语“事件”是指包括异源dna的原始转化体和/或所述转化体的子代。术语事件也指通过转化体和另一种植物系(无论是转基因的还是非转基因的)之间进行有性远交(outcross)而产生的子代。即使在重复回交至一个轮回亲本后，来自所述转化的亲本的插入dna和侧翼dna存在于在所述杂交子代的同样的染色体位置。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个上述事件代表dna构建体插入至植物细胞的基因组中的不同位置中。基于转基因或其他期望的特征的表达，选择特定的事件。此类转基因事件的非限制性实例包括“事件bt11”(也为bt11事件或仅bt11)、“事件5307”(也为5307事件或仅5307)、“事件mir162”(也为mir162事件或仅mir162)、“事件mir604”(也为mir604事件或仅mir604)、“事件mon810”(也为mon810事件或者仅mon810)以及“事件mon89034”(也为mon89034事件或仅mon89034)。因此，例如，如本文使用的术语“事件bt11”、“bt11事件”或“bt11”意指原始bt11转化体和/或bt11转化体的子代，包括由其衍生的任何植物。
如本文使用的，术语“杂合cry蛋白”是天然不存在的工程化杀昆虫蛋白，并且其包含一部分第一cry蛋白、和另一部分不同于所述第一cry蛋白的第二cry部分。典型地，“杂合cry蛋白”将至少包含连续27％的亲本cry蛋白的氨基酸序列(第一cry蛋白或第二cry蛋白)。所述27％数量是通过将杂合cry蛋白中的连续的亲本cry蛋白氨基酸数量除以杂合cry蛋白中的氨基酸总数来计算的。例如，杂合cry蛋白ecry3.1ab(seqidno:2)具有174个cry1ab氨基酸(位置480-653)和总共653个氨基酸。因此，ecry3a.1ab具有至少一个27％连续的cry1ab蛋白的氨基酸序列。根据本发明的杂合cry蛋白的其他实例由seqidno:6和seqidno:7代表。
术语“分离的”核酸分子、多核苷酸或多肽是不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或多肽。本发明的分离的核酸分子、多核苷酸或多肽可以按照纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌细胞或转基因植物中。因此，“分离的多肽”涵盖在转基因植物内表达的多肽。
“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文使用的，“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由所述定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
如本文使用的，“高度相关的杀昆虫蛋白”是指具有至少95％总体序列同一性的蛋白，或具有存在至少80％序列同一性的共同基序的蛋白。“高度相关的”杀昆虫蛋白的实例包括cry1ab(seqidno:1)和ecry3.1ab(seqidno:3)(它们具有存在至少80％序列同一性的共同基序)，以及ecry3.1ab(seqidno:3)和mcry3a(seqidno:2)(它们具有存在至少80％序列同一性的共同基序)。
术语“基因堆叠”或“蛋白堆叠”是指将两种或更多种基因引入生物的基因组或者在转基因生物中存在两种或更多种转基因蛋白。例如，可能期望在玉米植物中堆叠若干基因，例如cry1ab、vip3、mcry3a和ecry3.1ab，使得由于产生堆叠的蛋白而保护转基因玉米植物免受广谱昆虫有害生物侵害。
在两个核酸或蛋白质序列的上下文中，术语“相同的”或“基本上相同的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少60％、优选80％、更优选90％、甚至更优选95％、并且最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。优选地，基本上的同一性存在于序列的整个长度为至少约50个残基的区域中，更优选地在整个至少约100个残基的区域中，并且最优选地序列在至少约150个残基中是基本上相同的。在尤其优选的实施例中，在整个编码区域长度中的序列是基本上相同的。此外，基本上相同的核酸或蛋白质序列基本上执行相同的功能。
对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，所述序列比较算法基于所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过smith和waterman,adv.appl.math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过needleman和wunsch,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源比对算法、通过pearson和lipman,proc.nat'l.acadsci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，遗传学计算机组(geneticscomputergroup),科学街575号(575sciencedr.),麦迪逊,威斯康星州)，或通过目测检查(总体上参见ausubel等人,下文)。
适合于确定序列同一性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是blast算法，其描述于以下文献中：altschul等人,j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)。执行blast分析的软件是通过国家生物技术信息中心(thenationalcenterforbiotechnologyinformation，美国国家医学图书馆(u.s.nationallibraryofmedicine)，洛克维尔大道8600号(8600rockvillepike)，贝塞斯达，马里兰州20894美国)可供公众使用的。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度w的短字码而鉴定得分高的序列对(hsp)，所述得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分t。t被称为邻近字码得分阈(altschul等人,1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的hsp。然后，将所述字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数m(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和n(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量x；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止所述字码命中在每个方向上的延伸。blast算法的参数w、t、以及x决定了比对的灵敏度与速度。blastn程序(对核苷酸序列来说)使用字长(w)为11、期望值(e)为10、截止值(cutoff)为100、m＝5、n＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，blastp程序使用字长(w)为3、期望值(e)为10、以及blosum62评分矩阵作为默认值(参见henikoff和henikoff,proc.natl.acadsci.usa[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比之外，blast算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见例如，karlin和altschul,proc.nat'l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。由blast算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(p(n))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则所述测试核酸序列被认为是与所述参考序列相似的。
两个核酸序列基本上相同的另一个指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指分子在严格条件下仅与特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在所述序列存在于复合混合物(例如，总细胞的)dna或rna中时进行的。“基本上结合”是指在探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，所述错配可以通过降低杂交介质的严格来容纳，以实现靶核酸序列的所希望的检测。
在核酸杂交实验(如dna杂交和rna杂交)的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第i部分“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]”elsevier[爱思唯尔集团],纽约。通常，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和ph下被选定为比特定序列的热熔点(tm)低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与它的靶子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
tm是50％的靶序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和ph下)。非常严格条件被选定为等于特定探针的tm。对于互补核酸(它们在dna或rna印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的实例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将杂交进行过夜。高严格洗涤条件的实例是0.15mnacl在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是0.2×ssc洗涤在65℃下持续15分钟(参见，sambrook，下文，对于ssc缓冲液的说明)。通常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格洗涤的实例是1×ssc在45℃下持续15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是4-6×ssc在40℃下持续15分钟。对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0m的na离子的盐浓度，典型地在ph7.0-8.3下约0.01至1.0m的na离子浓度(或其他盐类)，并且所述温度典型地是至少约30℃。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。一般而言，相比于不相关的探针，在特定的杂交测定中观察到高出2倍(或更高)的信噪比就表明检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码允许的最大程度的密码子简并而创建核酸的拷贝时，则发生这种情况。
以下是可以用来克隆同源核苷酸序列(所述序列与本发明的参考核苷酸序列基本上相同)的杂交/洗涤条件的设置的实例：参考核苷酸序列在以下条件下优选地与所述参考核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃，并且在2×ssc、0.1％sds中在50℃洗涤；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃，并且在1×ssc、0.1％sds中在50℃洗涤；仍更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃，并且在0.5×ssc、0.1％sds中在50℃洗涤；优选地在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃，并且在0.1×ssc、0.1％sds中在50℃洗涤；更优选地在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃，并且在0.1×ssc、0.1％sds中在65℃洗涤。
“合成非抗体蛋白支架”或“synnaps”，是
如本文使用的，“变体synnaps”或“突变体synnaps”包括但不限于在synnaps的氨基酸序列中含有缺失、添加和/或取代的synnaps。一类取代是保守的氨基酸取代，其中synnaps多肽中的给定氨基酸被具有类似特征的另一种氨基酸取代。典型的保守取代是在脂肪族氨基酸ala、val、leu、和ile中一种替换另一种；羟基残基ser和thr的互换；酸性残基asp和glu的交换；酰胺残基asn和gln之间的取代；碱性残基lys和arg的交换；以及芳香族残基phe和tyr的替换。关于哪些氨基酸变化可能表型上沉默的指导可见于例如bowie等人，science[科学]247:1306-1310(1990)。本发明的“变体synnaps”可以是全功能的或可以在一种或多种活性(例如，结合另一分子的能力)方面缺少功能。全功能变体典型地仅含有保守变化，或非关键残基或非关键区域中的变化。功能变体还可以含有导致功能上没有变化或没有显著变化的相似氨基酸的取代。可替代地，此类取代可以在一定程度上正面或负面影响功能。非功能变体典型地含有一个或多个非保守的氨基酸取代、缺失、插入、倒位、截短或延伸，或关键残基的或关键区域中的取代、插入、倒位、或缺失。可用于鉴定可能是结合杀昆虫蛋白抗原所需的本发明的synnaps的残基或区域的方法(例如，定点诱变或单个顺序氨基酸取代诱变)是本领域已知的。可以在证明对最初取代具有功能敏感性的氨基酸位置处引入另外的取代。可替代地，或另外地，抗原-synnaps复合物的晶体结构用来鉴定synnaps和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为取代候选物而被靶向或消除。可以筛选变体从而确定它们是否含有所希望的特性。
在某些实施例中，改变本文提供的synnaps从而增加或减少synnaps结合靶杀昆虫蛋白的程度，或从而扩大synnaps的结合谱。可以通过在synnaps肽中，特别是在synnaps肽的结合区中添加、缺失和/或取代氨基酸来完成此类结合调节。
如本文使用的，“靶蛋白”意指当靶蛋白处于复合生物基质中时，旨在由特定配体(例如由本发明的synnaps)选择性检测和结合的蛋白，典型地是转基因蛋白。
如本文使用的，术语“转基因蛋白”意指在非天然形式、位置、生物等中产生的蛋白或肽。因此，“转基因蛋白”可以是与天然存在的蛋白具有相同的氨基酸序列的蛋白，或它可以是具有非天然存在的氨基酸序列的蛋白。例如，当在转基因植物或细菌中产生时，与来自苏云金芽孢杆菌(产生天然存在的cry1ab的生物)的野生型cry1ab蛋白具有相同氨基酸序列的cry1ab蛋白是“转基因蛋白”。
“野生型cry1ab蛋白”意指天然存在的cry1ab蛋白或对天然存在的cry1ab氨基酸序列具有最小氨基酸添加或取代并且与天然存在的cry1ab蛋白具有相同或相似的杀昆虫活性或杀昆虫谱的cry1ab蛋白。“野生型cry1ab蛋白”可以是全长蛋白质或其截短的毒素部分。例如但不限于，根据本发明的野生型cry1ab蛋白包括seqidno:1的cry1ab蛋白。
本发明涵盖组合物、方法、测定和试剂盒，所述组合物、方法、测定和试剂盒可用于在包含靶蛋白和一种或多种非靶蛋白两者的复合生物样品中(例如在转基因植物或转基因细菌中)，特异性示差检测转基因靶蛋白(例如转基因杀昆虫蛋白，它可以是野生型蛋白如杀昆虫cry蛋白，或转基因工程化的杂合蛋白如杂合杀昆虫cry蛋白(其可以包含野生型蛋白氨基酸序列的全部或一部分))。可以使用本发明的组合物和方法分析经由转基因表达技术引入植物的任何蛋白。根据本发明的适用于多重分析的蛋白可以赋予使得转基因植物优于其非转基因对应物的任何输出性状。可以被赋予的期望的性状的非限制性实例包括除草剂耐受性、对昆虫有害生物的耐受性或抗性、对环境胁迫的抗性、增强的产量、改进的营养价值、改进的保存限期、改变的油含量、改变的油组成、改变的糖含量、改变的淀粉含量、生产基于植物的药物、生产工业产品(例如，聚羟基脂肪酸：对于替换石油衍生塑料而言被认为是理想的大分子聚酯)和生物除污的潜力。此外，可以使用本披露的组合物和方法分析单个植物物种内的一种或多种转基因蛋白的表达。对单个目的物种中进行两个或多个基因或所希望的性状的添加或调节被称为基因堆叠。此外，可以在本披露的多重分析中同时分析一种或多种转基因蛋白的表达。
技术人员可自行选择针对待分析的特定靶蛋白的偏好。此类蛋白可以是但不限于来自植物、动物、细菌、酵母等的那些，并且可以是见于非转化的细胞或见于转化的细胞的蛋白。在转基因植物中表达的特别适合的蛋白是赋予对除草剂、昆虫、或病毒的耐受性的那些，以及提供改进的营养价值、增加的产量、耐旱性、氮利用、生产有用的工业化合物、加工植物特征、或生物除污的潜力的基因。有用的蛋白的实例包括来自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫cry蛋白和vip蛋白，或从其衍生的工程化蛋白(用于赋予昆虫抗性)，和5'-烯醇丙酮酰-3'-磷酸莽草酸合成酶(epsps)基因及其任何变体(用于赋予对草甘膦除草剂的耐受性)。如本领域技术人员容易理解的，赋予所希望的性状的任何蛋白可以使用重组dna技术在植物细胞中表达，并且因此可以是根据本发明的靶蛋白。
更特别地，本发明涉及称为synnaps(合成非抗体蛋白支架)的小肽亲和配体，其可用于在复合生物基质(例如来自转基因植物或转基因微生物的样品)中检测、捕获、鉴定或定量转基因杀昆虫蛋白。本发明的synnaps具有可变结合区，所述可变结合区具有特异性结合靶向蛋白的独特倾向。synnaps在识别和结合靶蛋白的特定表位的能力方面与抗体具有相似特性，然而，当用于特定应用时，它们与具有巨大优势的抗体相比小约20倍。例如，因为它们的大小导致更小的位阻，所以对于结合靶蛋白具有更大灵活性，并且它们对于温度和ph条件的改变具有更高耐受性，并且它们可以含有用于化学修饰的多特异性标签。此外，已经鉴定synnaps可以在靶蛋白处于包含靶蛋白和非靶蛋白两者的复合生物基质中时示差结合高度相关的靶杀昆虫蛋白。不能产生具有此示差特异性的抗体。将synnaps配体成功用于免疫检测系统(例如elisa和蛋白质印迹)，和用于下游加工系统(例如亲和柱)，以检测和定量靶杀昆虫蛋白。
本发明提供了可用于进行诊断方法的synnaps、组合物、诊断方法和试剂盒，所述方法允许在包含转基因杀昆虫蛋白的复合生物样品中特异性示差检测高度相似的转基因杀昆虫蛋白，例如cry1ab、mcry3a和ecry3.1ab。当前的现有技术是这样的，可商购的基于抗体的免疫测定不能用于从使用大量的cry1ab蛋白的氨基酸序列工程化的杂合cry蛋白(当这两种蛋白在同一生物样品中时)示差检测cry1ab蛋白，这是因为在这两种类型的蛋白之间存在抗体的高度交叉反应性。例如，针对用于cry1ab检测免疫测定中的野生型cry1ab而产生的抗体与具有源自野生型cry1ab蛋白的少至27％的其氨基酸的杂合cry蛋白(当这两种蛋白在同一生物样品中时)交叉反应。因此，例如，在这种复合生物样品中对野生型cry1ab的定量可能由于存在一种或多种非靶野生型cry蛋白或非靶杂合cry蛋白而混淆。此外，由于抗体对转基因植物产品中的cry1ab蛋白和杂合cry蛋白的交叉反应性，使用所表达的蛋白质的检测用于包含野生型cry1ab和一种或多种本发明的杂合cry蛋白的商品化转基因植物产品的身份保存是困难的。本文披露的方法和组合物提供了这些问题的解决方案，并且依赖于单独的或者与其他synnaps或与抗体组合的synnaps配体的示差结合。例如，本发明的第一synnaps配体可以用作捕获配体，来结合并且分离靶杀昆虫蛋白。然后用第二配体(它可以是融合至可检测标记的第二synnaps或抗体)检测结合的synnaps-靶蛋白复合物。
本发明的诊断测定能以许多不同的形式进行，所述免疫测定的实例包括酶联免疫吸附测定(elisa)和试纸条(dipstick)形式(其也被称为横向流动棒)。在elisa中，蛋白抗原-配体反应发生在固相上，典型地在微量滴定板上的孔中。抗原和该第一配体(也称为涂覆配体)进行反应并产生稳定的复合物，其可以通过添加与酶连接的第二配体(也称为检测配体)而可视化。第一和第二配体可以是synnaps、或synnaps和抗体的组合。添加该酶的底物导致颜色形成，所述颜色可以通过光度法测量或通过眼睛识别。
试纸条形式(横向流动棒)典型地使用纸带或塑料桨作为捕获配体的支持物，并且然后是反应位点。将带/桨浸入含有不同生物样品的小瓶中。每次浸渍之后都是冲洗步骤。最终的反应包括小瓶中的颜色变化，在所述小瓶中放置了所述带/桨。试纸条形式的最新发展已经导致横向流动技术，其中反应物通过毛细作用力被输送通过膜的通道。一个单独的步骤就足以进行所述测定，并且包括针对试剂性能的对照。将对外源蛋白具有特异性的配体与显色试剂进行偶联并掺入横向流动带中。当横向流动带被置于含有转基因蛋白的少量生物样品(例如来自植物组织的提取物)中时，在偶联的配体与所述转基因蛋白之间发生结合。与偶联于显色试剂的一些(但不是全部)配体形成夹层。所述膜含有两个捕获区域，一个捕获结合的转基因蛋白，并且另一个捕获显色试剂。当所述夹层和/或未反应的显色试剂被捕获在膜上的特定区域中时，这些捕获区域显示微红的颜色。在膜上单线(对照线)的存在表示阴性样品，并且两条线的存在表示阳性样品。
本发明的synnaps配体或抗体配体可以具有可检测标记或标签。适用于本发明的检测配体的可检测标记包括具有可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的部分的任何化合物或组合物。此类标记包括例如酶、寡核苷酸、纳米颗粒化学发光体、荧光团、荧光淬灭剂、化学发光淬灭剂或生物素。因此，例如，在采用光学信号的免疫测定中，光学信号被测量为化学发光、荧光、磷光、电化学发光、紫外线吸收、可见光吸收、红外线吸收、折射、表面等离子体共振的分析物浓度依赖性变化。在采用电信号的免疫测定中，电信号被测量为电流、电阻、电势、质荷比或离子计数的分析物浓度依赖性变化。在采用改变状态信号的免疫测定中，状态信号的变化被测量为尺寸、溶解度、质量或共振的分析物浓度依赖性变化。
根据本披露的有用标记包括磁珠(例如，dynabeads)，荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白)等(参见，例如，molecularprobes[分子探针]，尤金市，俄勒冈州，美国)，化学发光化合物如吖啶鎓(例如，吖啶鎓-9-甲酰胺)、菲啶鎓、二氧杂环丁烷、鲁米诺等，放射性标记(例如3h、125i、35s、14c或32p)，催化剂如酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶以及通常用于elisa中的其他酶)，以及比色标记如胶体金(例如，在40-80nm直径尺寸范围内高效散射绿光的金颗粒)，或者有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。教导使用此类标记的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；以及4,366,241。
所述标记可以在与生物样品接触之前、或之中或之后附接到每个配体。所谓的“直接标记”是在测定中使用之前直接附接或掺入到检测配体中的可检测标记。可以通过本领域技术人员熟知的多种方法中的任一种将直接标记附接或掺入到配体中。相比之下，所谓的“间接标记”典型地在测定过程中的某个点与每个配体结合。通常，所述间接标记在使用之前与附接至或掺入到检测剂中的部分进行结合。因此，例如，每个配体可以在测定中使用之前被生物素化。在测定过程中，抗生物素蛋白缀合的荧光团可以结合带有生物素的检测剂，以提供容易检测的标记。可以用抗生物素蛋白标签(它然后与用生物素标记的第二配体相互作用)给配体之一加标记或“加标签”。
在间接标记的另一个实例中，能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的多肽(如多肽a或多肽g)还可以用作检测配体的标记。这些多肽是链球菌细菌细胞壁的正常成分。它们与来自多种物种的免疫球蛋白恒定区表现出强烈的非免疫原性反应性(通常参见，kronval等人(1973)j.immunol.[免疫学杂志]，111:1401-1406，以及akerstrom(1985)j.immunol.[免疫学杂志],135:2589-2542)。此类多肽因此可以被标记并添加到测定混合物中，其中它们将结合每种配体以及自身抗体，标记全部并提供可归因于样品中存在的分析物和自身抗体的复合信号。
在本披露中有用的一些标记可能需要使用另外的一种或多种试剂以产生可检测的信号。例如，在elisa中，酶标记(例如β-半乳糖苷酶)将需要添加底物(例如x-gal)以产生可检测的信号。在使用吖啶鎓化合物作为直接标记的免疫测定中，添加碱性溶液和过氧化氢源。
根据一些实施例，本发明涵盖了结合杀昆虫蛋白并且任选地包含氨基酸标签的合成非抗体蛋白支架(synnaps)、或其抗原结合片段。在其他实施例中，杀昆虫蛋白包含seqidno:1-7中任一项的氨基酸序列或seqidno:1-7中任一项的配体结合片段。在其他实施例中，synnaps包含seqidno:9-36中的任一项。在仍其他的实施例中，synnaps包含seqidno:10-17、19、21、24-31、33或35中任一项。
在其他实施例中，本发明涵盖了包含氨基酸序列的synnaps，所述氨基酸序列与seqidno:10、seqidno:17或seqidno:21具有至少80％到至少99％序列同一性，并且其中(a)与seqidno:10具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于seqidno:10的位置22的位置处或在seqidno:10的位置22处具有tro(w)、在对应于seqidno:10的位置29的位置处或在seqidno:10的位置29处具有ser(s)、在对应于seqidno:10的位置31的位置处或在seqidno:10的位置31处具有tyr(y)、和在对应于seqidno:10的位置44的位置处或在seqidno:10的位置44处具有arg(r)；或(b)与seqidno:17具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于seqidno:17的位置29的位置处或在seqidno:17的位置29处具有ile(i)、和在对应于seqidno:17的位置42的位置处或在seqidno:17的位置42处具有phe(f)；或(c)与seqidno:21具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于seqidno:21的位置22的位置处或在seqidno:21的位置22处具有his(h)、在对应于seqidno:21的位置31的位置处或在seqidno:21的位置31处具有arg(r)、在对应于seqidno:21的位置40的位置处或在seqidno:21的位置40处具有leu(l)、和在对应于seqidno:21的位置44的位置处或在seqidno:21的位置44处具有tyr(y)。在另外的方面，synnaps具有包含seqidno:56-59、61-63、66、67、69-75、77-79、81-86、88-90、92或95中任一项的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涵盖了本发明的synnaps的抗原结合片段。在仍其他的实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:9-36中任一项的至少约14个到至少约65个氨基酸。在其他实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:42-55中的任一项。在仍其他的实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:96-98中的任一项。
在一些实施例中，本发明涵盖了包含本发明的抗原结合片段的synnaps。在其他实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:42-55中的任一项。在仍其他的实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:96-98中的任一项。
在一些实施例中，当靶转基因杀昆虫蛋白处于一种或多种非靶转基因杀昆虫蛋白存在下时，本发明的synnaps、或其抗原结合片段对靶蛋白具有示差结合亲和力。在其他实施例中，靶蛋白a)跨越其整个长度，与非靶蛋白中的一种或多种具有至少70％到至少95％序列同一性；或b)包含与非靶蛋白中的一种或多种的区域具有至少25％到至少95％序列同一性的区域。在其他实施例中，靶蛋白包含与非靶蛋白中的一种或多种的区域具有至少27％序列同一性的区域。在其他实施例中，靶蛋白包含与非靶蛋白中的一种或多种的区域具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的区域。
在本发明的上述实施例的某些方面中，靶蛋白是cry1a蛋白、mcry3a蛋白、ecry3.1ab蛋白、或包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白。
在上述实施例的其他方面中，一种或多种非靶蛋白选自由以下组成的组：cry1a蛋白、cry1b蛋白、cry1f蛋白、cry1i蛋白、cry1j蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白、包含cry1f蛋白的结构域iii的杂合cry蛋白、修饰的cry3a蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域iii的杂合cry3蛋白、和vip3蛋白。
在本发明的上述实施例的其他方面中，靶蛋白是cry1a蛋白、mcry3a蛋白、ecry3.1ab蛋白、或包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白，并且一种或多种非靶蛋白选自由以下组成的组：cry1a蛋白、cry1b蛋白、cry1f蛋白、cry1i蛋白、cry1j蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域i和结构域ii的杂合cry蛋白、包含cry1f蛋白的结构域iii的杂合cry蛋白、修饰的cry3a蛋白、包含cry1ab蛋白的结构域iii的杂合cry3蛋白、和vip3蛋白。在一些实施例中，cry1a蛋白是cry1aa、cry1ab或cry1ai。在其他实施例中，杂合cry蛋白是cry1ab.1ca蛋白或cry1a.105蛋白。
在上述实施例的仍其他的方面中，靶蛋白是a)cry1ab，并且非靶蛋白包括mcry3a或ecry3.1ab；或b)mcry3a，并且非靶蛋白包括cry1ab或ecry3.1ab；或c)ecry3.1ab，并且非靶蛋白包括cry1ab或mcry3a；或d)cry1ab或cry1ab.1ca，并且非靶蛋白包括cry1aa或cry1ai；或e)cry1ab或cry1ai蛋白，并且非靶蛋白包括cry1aa或cry1ab.1c；或f)cry1ab、cry1ai或cry1ab.cry1c蛋白，并且非靶蛋白是cry1aa；或g)cry1ab蛋白或cry1ab.cry1c蛋白，并且非靶蛋白包括cry1aa或cry1ai蛋白；或h)cry1aa或cry1ai蛋白，并且非靶蛋白包括cry1ab蛋白或cry1ab.1ca蛋白。
在本发明的上述实施例的仍其他的方面中，其中cry1ab蛋白包含由seqidno:1表示的氨基酸序列，mcry3a蛋白包含由seqidno:2表示的氨基酸序列，ecry3.1ab蛋白包含由seqidno:3表示的氨基酸序列，cry1aa蛋白包含由seqidno:4表示的氨基酸序列，cry1ai蛋白包含由seqidno:5表示的氨基酸序列，cry1ab.1ca蛋白包含由seqidno:6表示的氨基酸序列或cry1a.105蛋白包含由seqidno:7表示的氨基酸序列。
在其他实施例中，在mcry3a或ecry3.1ab存在下特异性结合cry1ab的synnaps包含seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12或seqidno:13。在其他实施例中，在cry1ab和ecry3.1ab存在下特异性结合mcry3a蛋白的synnaps包含seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16或seqidno:17。在仍其他的实施例中，在cry1ab和mcry3a存在下特异性结合ecry3.1ab的synnaps包含seqidno:21。在其他实施例中，在cry1aa或cry1ai存在下结合cry1ab或cry1ab.1ca的synnaps包含seqidno:13。在另外的实施例中，在cry1ab存在下结合ecry3.1ab或mcry3a或cry1ai或cry1aa的synnaps包含seqidno:19。
在其他实施例中，靶蛋白和非靶蛋白包含在来自转基因植物或转基因微生物的生物样品中。在其他实施例中，转基因植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、低芥酸菜籽植物、小麦植物或稻植物。在其他实施例中，转基因微生物是细菌、酵母或病毒。在仍其他的实施例中，转基因细菌是大肠杆菌、假单胞菌属物种或芽孢杆菌属物种。
在一些实施例中，本发明涵盖了编码本发明的synnaps的核酸分子。在其他实施例中，synnaps选自由以下组成的组：seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、和seqidno:36。在仍其他的实施例中，本发明的核酸分子编码synnaps，所述synnaps包含seqidno:56-69、或seqidno:70-82或seqidno:83-95中任一项的氨基酸序列。
在仍其他的实施例中，本发明涵盖了编码本发明的synnaps的抗原结合片段的核酸分子。在其他实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:9-36、或seqidno:56-69、或seqidno:70-82或seqidno:83-95中任一项的至少约14个到至少约65个氨基酸。在其他实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:40-53中的任一项。在仍其他的实施例中，所述抗原结合片段包含seqidno:96-98中的任一项。
在一些实施例中，本发明进一步涵盖了包含本发明的核酸分子的转基因生物。在其他实施例中，所述转基因生物是转基因植物或转基因微生物。在其他实施例中，转基因植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、低芥酸菜籽植物、小麦植物或稻植物。在仍其他的实施例中，微生物是细菌、酵母或病毒。在其他实施例中，细菌是大肠杆菌、假单胞菌属物种或芽孢杆菌属物种。
在另一个实施例中，本发明涵盖了包含本发明的第一synnaps和第二配体的组合物，其中所述synnaps和所述第二配体在包含靶蛋白和非靶蛋白的生物样品的免疫测定中共同起作用以示差检测或定量靶蛋白。在其他实施例中，非靶蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涵盖了用于在包含靶杀昆虫蛋白和非靶杀昆虫蛋白的复合生物基质中示差检测所述靶杀昆虫蛋白的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含本发明的第一synnaps和第二配体，所述第一synnaps和所述第二配体在免疫测定中共同起作用以示差检测或定量所述靶杀昆虫蛋白。在其他实施例中，非靶蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。
在上述实施例的一些方面中，免疫测定是酶联免疫吸附测定(elisa)、蛋白质印迹、免疫色谱法或免疫定位。在这个实施例的一个方面中，在固体表面上进行免疫测定。在另一个方面，固体表面是微量滴定盘。在这个实施例的另一个方面，第二配体是抗体或不同于第一synnaps的第二synnaps。在这个实施例的另一个方面，将第一synnaps用作涂覆配体，并且将第二配体用作检测配体。在这个实施例的另一个方面，将第一synnaps用作检测配体，并且将第二配体用作涂覆配体。
在上述实施例的一些方面中，生物样品是转基因植物样品。在这个实施例的其他方面，转基因植物是转基因玉米植物。在其他方面，转基因玉米植物包含选自由以下组成的组的转基因玉米事件：事件bt11、事件mir604、事件5307、事件mon89034和事件mon810。在其他方面，转基因玉米植物包含事件bt11、mir604、事件5307和任选地事件mon89034。在其他方面，生物样品包含来自事件bt11的cry1ab蛋白、来自mir604的mcry3a、和来自事件5307的ecry3.1ab杂合cry蛋白。在仍其他的方面，cry1ab包含seqidno:1，ecry3.1ab包含seqidno:2，并且mcry3a包含seqidno:3。在其他方面，生物样品进一步包含来自事件mon89034的cry1a.105杂合cry蛋白。在仍其他的方面，cry1a.105包含seqidno:7。
在其他实施例中，synnaps选自由以下组成的组：seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、和seqidno:22。
在仍其他的实施例中，以这样一种方式给synnaps加标签，所述方式使其可被酶反应检测到。在一个实施例中，用his标签或抗生物素蛋白标签给synnaps加标签。在另一个实施例中，用his标签和抗生物素蛋白标签两者给synnaps加标记。在另一个实施例中，his标签包含seqidno:40。在其他实施例中，抗生物素蛋白标签包含seqidno:41。在另一个实施例中，加标签的synnaps选自由以下组成的组：seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、和seqidno:36。
在一些实施例中，本发明涵盖了用于在包含靶杀昆虫蛋白和非靶杀昆虫蛋白的生物样品中示差检测或定量靶蛋白的方法，所述方法包括(a)获得包含所述靶杀昆虫蛋白和所述非靶杀昆虫蛋白的生物样品；(b)对所述生物样品进行免疫测定，其中所述免疫测定包括使用本发明的第一synnaps和第二配体在所述免疫测定中共同起作用，以示差检测或定量所述靶杀昆虫蛋白而不是所述非靶杀昆虫蛋白，这导致所述靶杀昆虫蛋白的示差检测或定量。在其他实施例中，非靶蛋白至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。
在其他实施例中，本发明涵盖了用于在包含靶杀昆虫蛋白和非靶杀昆虫蛋白的生物样品中示差检测或定量靶蛋白的免疫测定方法，所述方法包括：(a)用结合所述靶蛋白但不结合所述非靶蛋白的本发明的synnaps涂覆第一固体表面，并且用结合所述非靶蛋白的第二结合蛋白涂覆第二固体表面；(b)在有效允许形成靶蛋白-synnaps复合物但不允许形成非靶蛋白-synnaps复合物的条件下，使所述生物样品与所述synnaps接触，生成靶蛋白耗尽的生物样品；(c)去除所述靶蛋白耗尽的生物样品，并且在有效允许形成非靶蛋白-第二结合蛋白复合物的条件下，使所述靶蛋白耗尽的生物样品与所述第二结合蛋白接触；(d)检测或定量所述第一固体表面上的靶蛋白复合物；以及(e)检测或定量所述第二固体表面上的非靶蛋白。在其他实施例中，非靶蛋白至少具有连续27％的靶蛋白的氨基酸序列。
在其他实施例中，免疫测定是酶联免疫吸附测定(elisa)、蛋白质印迹、免疫色谱法或免疫定位。在这个方面的实施例中，在固体表面上进行免疫测定。在其他实施例中，固体表面是微量滴定盘。在其他实施例中，第二配体是抗体或不同于第一synnaps的第二synnaps。在其他实施例中，将第一synnaps用作涂覆配体，并且将第二配体用作检测配体。在仍其他的实施例中，将第一synnaps用作检测配体，并且将第二配体用作涂覆配体。在其他实施例中，synnaps选自由以下组成的组：seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、和seqidno:22。在其他的实施例中，以这样一种方式给synnaps加标签，所述方式使其可被酶反应检测到。在另一个实施例中，用his标签或抗生物素蛋白标签给synnaps加标签。在另一个实施例中，用his标签和抗生物素蛋白标签两者给synnaps加标记。在另一个实施例中，his标签包含seqidno:40。在另一个实施例中，抗生物素蛋白标签包含seqidno:41。在其他实施例中，加标签的synnaps选自由以下组成的组：seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、和seqidno:36。
在另外的实施例中，在其中示差检测或定量靶杀昆虫蛋白的生物样品是转基因植物样品。在一些实施例中，转基因植物是转基因玉米植物。在其他实施例中，转基因玉米植物包含选自由以下组成的组的转基因玉米事件：事件bt11、事件mir604、事件5307、事件mon89034和事件mon810。在其他实施例中，转基因玉米植物包含事件bt11、mir604、事件5307和任选地事件mon89034。在其他实施例中，生物样品包含来自事件bt11的cry1ab蛋白、来自mir604的mcry3a、和来自事件5307的ecry3.1ab杂合cry蛋白。在仍其他的实施例中，cry1ab包含seqidno:1，ecry3.1ab包含seqidno:2，并且mcry3a包含seqidno:3。在其他实施例中，生物样品进一步包含来自事件mon89034的cry1a.105杂合cry蛋白。在仍其他的实施例中，cry1a.105包含seqidno:7。
本发明的实施例可以通过参考以下实例而被更好地理解。前述的和以下的本发明的实施例以及各种实施例的描述不是旨在限制权利要求书，而是对其具有说明性。因此，应理解的是权利要求书不旨在受限于这些实例的具体细节。本领域技术人员应理解的是本发明的其他实施例可以在不偏离本披露的精神和范围的情况下进行实践，本披露的范围是由所附权利要求书限定的。
实例
实例1：鉴定非抗体配体候选物
本实例描述了筛选配体克隆文库，以对识别并且结合杀昆虫蛋白的非抗体多肽配体进行鉴定。杀昆虫蛋白cry1ab(seqidno:1)、ecry3.1ab(seqidno:2)和mcry3a(seqidno:3)是天然和工程化的蛋白，分别由btcry蛋白的三个典型结构域组成。这三种蛋白的氨基酸序列中某部分是相同的。特别地，ecry3.1ab(seqidno:2)包含mcry3a(seqidno:3)的结构域i和ii以及cry1ab(seqidno:1)的结构域iii。因此，cry1ab(seqidno:1的氨基酸475-615)和ecry3.1ab(seqidno:2的氨基酸480-620)具有存在100％同一性的区域。mcry3a和ecry3.1ab还共享具有100％同一性的区域，所述区域是mcry3a(seqidno:3)的氨基酸10-468和ecry3.1ab(seqidno:2)的氨基酸23-481。由于这些区域具有高度同一性，尝试产生能示差结合三种靶杀昆虫蛋白中的每一种的单个抗体尚未取得成功。
对如描述于美国专利号9,422,548的、源自野生型sac7dob折叠蛋白(seqidno:8)的进化的多肽的组合文库进行筛选，从而鉴定cry1ab、ecry3.1ab和mcry3a的配体候选物。简而言之，方法分为三个步骤：步骤1-发现，步骤2-鉴定，和步骤3-验证。这种示差筛选方法鉴定了结合每种靶蛋白独有的氨基酸序列或由于蛋白的共有区域中独特构象变化而识别靶蛋白的潜在配体候选物。
在步骤1中，对文库中存在的配体进行若干轮筛选和富集，从而鉴定独立地结合靶蛋白(即不存在非靶蛋白)的配体候选物。三种选择(每种靶蛋白进行一种选择)与经由用大肠杆菌配体克隆文库的核糖体展示的四轮选择同步进行(参见例如mouratou等人.2011.在ribosomedisplayandrelatedtechnologies[核糖体展示和相关技术]中,第315-331页,springerlink[施普林格全文数据库])。将elisa用于使用标准程序筛选克隆的细菌提取物。在第1轮中，使用靶蛋白淘选配体文库。在随后的第2至4轮中，将源自第1轮的文库用非靶蛋白重新淘选，并且然后用靶蛋白淘选。例如，为了选择抗cry1ab配体，用cry1ab靶蛋白淘选第1轮，并且将第2至4轮用ecry3.1ab(此cry1ab选择中的非靶蛋白)预淘选并且用cry1ab靶蛋白淘选。在所有轮的每个选择完成后，将具有需要的结合分布的配体克隆进行测序。这个发现步骤产生了结合cry1ab且不结合ecry3.1ab的7个不同序列家族中的37个独特配体序列，对于mcry3a具有结合结果但不具有清楚的结合结果的、结合ecry3.1ab且不结合cry1ab的10个序列家族中的22个独特配体序列。对于mcry3a，由于靶完整性，存在非常低的elisa信号，因此鉴定了结合mcry3a的来自4个不同序列家族的4个独特序列。
对于步骤2，从步骤1选择了12个抗cry1ab克隆、14个抗ecry3.1ab克隆、和4个抗mcry3a克隆。在这个步骤中，使用测量生物分子的相互作用的、本领域公认的生物层干涉量度法(fortebio公司，门洛帕克，加利福尼亚州)(还参见shah和duncan2014.j.vis.exp.[视觉化实验杂志]84:51383)，针对配体与单个靶的结合亲和力以及针对靶之间是否存在交叉反应性，评估纯化的配体。在从约15.6nm至约1μm的一系列靶浓度下，测量配体-靶关联。具体目标是鉴定识别cry1ab但不识别ecry3.1ab的一个或多个配体、识别mcry3a但不识别ecry3.1ab的一个或多个配体、和识别mcry3a但不识别cry1ab或ecry3.1ab的一个或多个配体。这个步骤的结果鉴定了对靶杀昆虫蛋白具有足够的亲和力和特异性的14种配体候选物(本文定义为合成非抗体蛋白支架或“synnaps”)；用cry1ab选择的synnaps-1(seqidno:9)、-2(seqidno:10)、-3(seqidno:11)、-4(seqidno:12)和-5(seqidno:13)，用mcry3a选择的synnaps-6(seqidno:14)、-7(seqidno:15)、-8(seqidno:16)、-9(seqidno:17)，以及用ecry3.1ab选择的synnaps-10(seqidno:18)、-11(seqidno:19)、-12(seqidno:20)、-13(seqidno:21)和-14(seqidno:22)。结合cry1ab、ecry3.1ab和mcry3a的synnaps的比对分别显示在表1、2和3中。
表1.cry1ab选择的synnaps的序列比对。
表2.ecry3.1ab选择的synnaps的序列比对。
表3.mcry3a选择的synnaps的序列比对。
在步骤3中，在验证实验中测试步骤2中鉴定的14种synnaps。因此，构建每种synnaps克隆，使其具有n-末端his标签(seqidno:37)和c-末端抗生物素蛋白标签(seqidno:38)。14种加标签的synnaps披露为seqidno:23-36。在大肠杆菌bira菌株中产生每种加标签的synnap(参见例如chapman-smith和cronan,1999.trendsbiochem.sci.[生物化学的发展趋势]24:359-363)，用于体内生物素化。用25mm硼酸盐、75mmnacl(ph8.5)中的1μg/ml的cry1ab、ecry3.1ab或mcry3a将高结合性96孔板(nuncmaxisorp)(100μl/孔)在4℃涂覆过夜。将板用含有0.05％tween-20的磷酸盐缓冲盐水ph7.3(pbs)(pbst)洗涤三次。将在elisa稀释剂(含有1％牛血清白蛋白的pbst)中的每种配体添加到板中(100μl/孔)，在室温(rt)伴随摇动孵育1hr，并且洗涤五次。对于通过synnaps配体的生物素末端的检测，将在elisa稀释剂中的1μg/ml链霉亲和素-碱性磷酸酶(杰克逊免疫研究实验室(jacksonimmunoresearchlabs)，西格罗夫(westgrove)，宾夕法尼亚州)添加到板中，在rt/摇动下孵育1hr，并且如前进行洗涤。添加底物磷酸对硝基苯酯(surmodics公司，伊登普雷利(edenprairie)，明尼苏达州)(100μl/孔)，并且允许在室温显色30min。使用酶标仪(biotekpowerwavexs2，威努斯基，佛蒙特州)在405nm下测量吸光度。对于使用synnaps配体的his标签末端的检测，将在elisa稀释剂中的1/4000稀释的rgs-hishrp缀合物(凯杰公司(qiagen))添加到板中，在rt/摇动下孵育1hr，并且如前进行洗涤。添加底物四甲基联苯胺(surmodics公司，伊登普雷利(edenprairie)，明尼苏达州)(100μl/孔)，并且允许在室温伴随摇动显色15-30min。使用1nhcl(100μl/孔)将反应终止，并且在450nm下测量吸光度。
基于步骤3验证实验的结果，选择示差结合cry1ab的synnaps-2(seqidno:10)、示差结合mcry3a的synnaps-9(seqidno:17)、和示差结合ecry3.1ab的synnaps-13(seqidno:21)进行使用转基因植物的另外的实验。
实例2.筛选杀昆虫蛋白谱
本实例描述了用来评估synnaps针对广谱杀昆虫蛋白的结合特性的实验。使用上述elisa免疫测定，针对结合野生型的和工程化的杂合杀昆虫蛋白，包括cry1aa、cry1ab、cry1ai、cry1ba、cry1f、cry1i、cry1jc、杂合cry1ab.1ca、杂合ecry3.1ab、杂合cry1gb.cry1ig、杂合cry1gb.1fa、mcry3a和vip3aa蛋白，评估synnaps。将蛋白bsa和链霉亲和素-ap用作阴性对照。简而言之，在500ng/ml的浓度下，用以上列出的杀昆虫蛋白将96孔板涂覆过夜。将与0.1μg/ml链霉亲和素-碱性磷酸酶(sa-ap)混合的10nm的每种加标签的synnaps添加到每个孔中，并且在室温伴随摇动孵育1hr。用pnpp检测synnaps-蛋白复合物，并且在15min后在405nm下读取。结果显示在表4中，这表明与synnaps-2(seqidno:10)具有80％同一性的synnaps结合靶蛋白cry1ab但不结合非靶蛋白ecry3.1ab或mcry3a，并且表明与synnaps-9(seqidno:17)具有至少77％同一性的synnaps结合靶蛋白mcry3a但不结合非靶蛋白cry1ab或ecry3.1ab。结果进一步表明a)synnaps-2的靶蛋白是cry1ab、cry1ai、或具有cry1ab的结构域i和ii的杂合体，例如cry1ab.1ca；并且非靶蛋白包括ecry3.1ab、mcry3a、cry1aa、cry1b、cry1f、cry1i、cry1j、cry1gb.1fa、cry1gb.1ig、和vip3；以及b)synnaps-3的靶蛋白是cry1ab或cry1ai，并且非靶蛋白包括ecry3.1ab、mcry3a、cry1aa、cry1b、cry1f、cry1i、cry1j、具有cry1ab的结构域i和ii的杂合cry蛋白，例如cry1ab.1ca、cry1gb.1fa、cry1gb.1ig、和vip3；以及c)synnaps-4的靶蛋白是cry1ab、cry1ai和cry1ab.1ca，并且非靶蛋白包括ecry3.1ab、mcry3a、cry1aa、cry1b、cry1f、cry1i、cry1j、cry1gb.1fa、cry1gb.1ig、和vip3；以及d)synnaps-5的靶蛋白是cry1ab和cry1ab.1ca，并且非靶蛋白包括ecry3.1ab、mcry3a、cry1aa、cry1ai、cry1b、cry1f、cry1i、cry1j、cry1gb.1fa、cry1gb.1ig、和vip3；以及e)synnaps-6、-7、8、和-9的靶蛋白是mcry3a，并且非靶蛋白包括ecry3.1ab、cry1aa、cry1ab、cry1ai、cry1b、cry1f、cry1i、cry1j、cry1gb.1fa、cry1gb.1ig、和vip3；以及f)synnaps-11的靶蛋白是mcry3a、ecry3.1ab、cry1aa和cry1ai，并且非靶蛋白包括cry1ab、cry1b、cry1f、cry1i、cry1j、cry1ab.1ca、cry1gb.1fa、cry1gb.1ig、和vip3；以及g)synnaps-13的靶蛋白是ecry3.1ab，并且非靶蛋白包括mcry3a、cry1aa、cry1ab、cry1ai、cry1b、cry1f、cry1i、cry1j、cry1ab.1ca、cry1gb.1fa、cry1gb.1ig、和vip3。结果进一步证明没有synnaps结合野生型cry蛋白cry1i、cry1f和cry1ba、杂合cry蛋白cry1gb.1f、或营养期杀昆虫蛋白vip3aa(未显示在表中)。
表4.用杀昆虫蛋白的synnaps结合实验的结果。
实例3.使用synnaps的elisa开发。
本实例描述了使用synnaps和抗体组合在包含靶杀昆虫蛋白和一种或多种非靶杀昆虫蛋白的组合物中检测或定量靶蛋白的elisa方法的开发。在本实例中，对将本发明的synnaps用作涂覆配体并且将抗体用作检测配体的免疫测定、以及将抗体用作涂覆配体并且将synnaps用作检测配体的免疫测定，与将抗体用作涂覆配体和检测配体的elisa方法相比的特异性和敏感性进行了评估。
synnaps-抗体测定
在4℃用含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水ph7.3(pbs)(elisa稀释剂)中的100μl/孔100nmsynnaps-2、synnaps-9或synnaps-13将pierce链霉亲和素高结合性96孔板(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，洛克福德(rockford)，伊利诺伊州)涂覆过夜。将板用含有0.05％tween-20的pbs(pbst)洗涤三次。将在elisa稀释剂中的含cry1ab、ecry3.1ab和mcry3a的样品或者标准品添加到板中(100μl/孔)，在室温(rt)伴随摇动孵育1hr，并且洗涤五次。将在elisa稀释剂(1/10,000稀释)中的100μl/孔的hrp-mab170抗mcry3a抗体或hrp-mab70抗cry1ab抗体添加到板中，在rt/摇动下孵育1hr，并且如前进行洗涤。添加底物四甲基联苯胺(surmodics公司，伊登普雷利(edenprairie)，明尼苏达州)(100μl/孔)，并且允许在室温伴随摇动显色15-30min。使用1nhcl(100μl/孔)将反应终止。使用酶标仪(biotekpowerwavexs2，威努斯基，佛蒙特州)在450nm下测量吸光度。标准曲线使用四参数曲线拟合来绘制浓度比对吸光度。表5中的结果表明本发明的synnaps可以与充当检测配体的抗体一同充当涂覆配体或捕获配体。
表5.用synnaps示差检测靶蛋白。
抗体-synnaps测定
用25mm硼酸盐、75mmnacl(ph8.5)中的2μg/mlmab170抗mcry3a将高结合性96孔板(nuncmaxisorp)(100μl/孔)在4℃涂覆过夜。将板用含有0.05％tween-20的磷酸盐缓冲盐水ph7.3(pbs)(pbst)洗涤三次。将在elisa稀释剂(含有1％牛血清白蛋白的pbst)中的含cry1ab、ecry3.1ab和mcry3a的样品或者标准品添加到板中(100μl/孔)，在室温(rt)伴随摇动孵育1hr，并且洗涤五次。将在elisa稀释剂中的100μl/孔的10nmsynnaps-13与0.1μg/ml链霉亲和素-碱性磷酸酶(杰克逊免疫研究实验室(jacksonimmunoresearchlabs)，西格罗夫(westgrove)，宾夕法尼亚州)添加到板中，在rt/摇动下孵育1hr，并且如前进行洗涤。添加底物磷酸对硝基苯酯(surmodics公司，伊登普雷利(edenprairie)，明尼苏达州)(100μl/孔)，并且允许在室温显色30min。使用酶标仪(biotekpowerwavexs2，威努斯基，佛蒙特州)在405nm下测量吸光度。标准曲线使用四参数曲线拟合来绘制浓度比对吸光度。结果表明，在40ng/ml的蛋白浓度下，以2.4的吸光度示差检测到ecry3.1ab，证明不存在来自非靶蛋白的干扰。
本实例中披露的结果证明本发明的synnaps可以用作复合生物样品的免疫测定中的捕获配体或检测配体。将抗体充当涂覆配体并且将synnaps充当检测配体的elisa方法，与使用抗体作为涂覆配体和检测配体两者的elisa在定量靶蛋白方面是相当的。使用将synnaps充当涂覆配体并且将抗体充当检测配体的elisa方法，与使用抗体作为涂覆配体和检测配体两者的elisa在定量靶蛋白方面具有良好关联，但是敏感性降低约5倍。
实例4.使用synnaps的亲和纯化
本实例描述了本发明的synnaps在亲和纯化方法中的用途。设计实验来测试如上所述显示示差结合ecry3.1ab的synnaps-13是否可以用于从含有靶蛋白和非靶蛋白cry1ab与mcry3a(它们与靶蛋白具有基本上同一性的区域)的复合植物基质中选择性纯化靶蛋白ecry3.1ab。将链霉亲和素t1珠(0.1ml)(invitrogendynabeadsmyone)遵循制造商的程序用pbs洗涤3x，并且重悬浮在pbst中的0.5ml0.1％bsa中。添加20ugsynnaps-13，并且在4℃伴随旋转孵育混合物约1hr。用pbst中的0.1％bsa洗涤珠3x，之后添加0.5ml的来自表达cry1ab、ecry3.1ab和mcry3a的转基因玉米的叶提取物，并且在rt伴随旋转孵育30m。将上清液去除并保存用于测试。将珠如前进行洗涤，并且然后用0.2ml0.1m甘氨酸(ph2.0)洗脱。将洗脱液添加至含有20μl0.5mtrisph8.5的管中，并且将体积用pbs补到0.5ml。样品取自原始叶提取物(包含所有三种蛋白)、耗尽的上清液(应仅包含cry1ab和mcry3a)和洗脱液(应仅包含ecry3.1ab)，并且在cry1ab、ecry3.1ab和mcry3aelisa中进行测试。在表6中显示的结果表明，即使当靶蛋白处于非靶蛋白(所述非靶蛋白与靶蛋白具有基本上同一性的区域)存在下时，synnaps-13仍然特异性检测并且捕获来自转基因玉米叶提取物的ecry3.1ab。
表6.从复合植物基质亲和纯化靶蛋白。
实例5.使用本发明的synnaps的斑点印迹测定
本实例描述了本发明的synnaps在用于示差检测靶转基因蛋白的斑点印迹中的用途。先前证明synnaps2、nsynnaps9、和synnaps13分别可以特异性结合天然cry1ab、mcry3a、和ecry3.1ab蛋白。为了研究synnaps在斑点印迹中的潜在应用，将天然cry1ab、mcry3a和ecry3.1ab蛋白以9、19、38、75、和150ng的量单独地点样到硝酸纤维素膜带上。在风干约2小时后，用含有3％脱脂乳的tbs(ph8.0)的封闭缓冲液封闭蛋白点样带30分钟，并且然后在冷藏室中、在相同封闭缓冲液中以10nm的浓度与各自的synnaps一起孵育过夜。在室温下用tbst洗涤3x10min后，在室温下用ap-链霉亲和素缀合物将带孵育1小时。通过将带在bcip/nbt液体底物中孵育1min，使检测可视化。
结果显示，synnaps2的最低检测水平为75ng的cry1ab，并且synnaps9的最低检测水平为150ng的mcry3a。在这些实验条件下，在从38ng至150ng的不同水平下，使用synnaps13没有检测到ecry3.1ab，这表明在这些类型的斑点印迹中，它具有低于synnaps2和synnaps的敏感性。
实例6.synnaps中关键功能氨基酸位置的鉴定
本实例描述了synnaps配体synnaps2、synnaps9和synnaps13与抗原cry1ab、mcry3a和ecry3.1ab的抗原结合位点的表征。通过在对应于seqidno:8的氨基酸位置7、8、9、21、22、23或24、26、29、31、33、40、42、44和46的氨基酸位置处的氨基酸取代诱变，鉴定对于synnaps2、synnaps9和synnaps13结合区的功能结合而言关键的氨基酸位置。在elisa中，针对每种变体synnaps确定结合亲和力。导致结合效率丧失的位置处的取代表明所述位置对于功能结合而言是关键的。将每种synnaps，即synnaps2(seqidno:10)、synnaps9(seqidno:17)或synnaps13(seqidno:21)的亲本克隆用作阳性对照。
构建每种synnaps变体，使其具有n-末端his标签(seqidno:37)。在大肠杆菌中产生每种加标签的synnaps变体。用25mm硼酸盐、75mmnacl(ph8.5)中的1μg/ml的cry1ab、ecry3.1ab或mcry3a将高结合性96孔板(nuncmaxisorp)(100μl/孔)在4℃涂覆过夜。将板用含有0.05％tween-20的磷酸盐缓冲盐水ph7.3(pbs)(pbst)洗涤三次。将在elisa稀释剂(含有1％牛血清白蛋白的pbst)中的每种配体添加到板中(100μl/孔)，在室温(rt)伴随摇动孵育约1hr，并且洗涤五次。对于检测，将在elisa稀释剂中的1/4000稀释的rgs-hishrp缀合物(凯杰公司(qiagen))添加到板中，在rt/摇动下孵育1hr，并且进行洗涤。添加底物四甲基联苯胺(surmodics公司，伊登普雷利(edenprairie)，明尼苏达州)(100μl/孔)，并且允许在室温伴随摇动显色15-30min。使用1nhcl(100μl/孔)将反应终止，并且在450nm下测量吸光度。
cry1ab结合、mcry3a结合和ecry3.1ab结合的elisa结果分别显示在表7、8和9中。
表7.synnaps2变体与cry1ab抗原的结合亲和力。
synnaps2突变的结果证明，对结合对应于seqidno:10的氨基酸位置22、29、31和44的cry1ab抗原的synnaps配体的氨基酸位置进行的突变完全敲除了cry1ab结合。确切地说，对seqidno:10的w22a、s29a、y31a和r44a进行的突变敲除了synnaps2(seqidno:10)的cry1ab结合。在对应于氨基酸位置8、21、23、26、33和46的氨基酸位置处的突变将与cry1ab的结合亲和力减少了从约5％至约50％。确切地说，seqidno:10的突变y8a、v21a、i23a、f26a、r33a和y46a将与synnaps2配体与cry1ab的结合亲和力减少至seqidno:10的结合亲和力的从约5％至50％。
表8.synnaps9变体与mcry3a抗原的结合亲和力。
synnaps9突变的结果证明，对结合对应于seqidno:17的氨基酸位置24、29和42的mcry3a抗原的synnaps配体的氨基酸位置进行的突变完全敲除或几乎完全敲除了mcry3a结合。确切地说，对seqidno:17的p24a、i29a和f42a进行的突变敲除或几乎敲除了synnaps9(seqidno:17)的mcry3a结合。在对应于氨基酸位置9、21、22、26、31、40和44的氨基酸位置处的突变将与mcry3a的结合亲和力减少了从约16％至约60％。确切地说，seqidno:17的突变g9a、y21a、h26a、f31a、g40a和h44a将synnaps9配体与mcry3a的结合亲和力减少至seqidno:17的结合亲和力的从约16％至60％。此外，在对应于seqidno:17的氨基酸位置8、33和46的氨基酸位置处的突变增加了synnaps13配体的结合亲和力。确切地说，seqidno:17的突变q8a、m33a和t46a将与mcry3a的结合亲和力增加至seqidno:17的结合亲和力的约112％。
表9.synnaps13变体与ecry3.1ab抗原的结合亲和力。
synnaps13突变的结果证明，对结合对应于seqidno:21的氨基酸位置22、31、40和44的ecry3.1ab抗原的synnaps配体的氨基酸位置进行的突变完全敲除或几乎完全敲除了ecry3.1ab结合。确切地说，对seqidno:21的h22a、r31a、l40a和y44a进行的突变敲除或几乎敲除了synnaps13(seqidno:21)的ecry3.1ab结合。在对应于氨基酸位置7、8、9、21、24、26和29的氨基酸位置处的突变将与ecry3.1ab的结合亲和力减少了从约27％至约76％。确切地说，seqidno:21的突变k7a、r8a、w9a、l21a、l24a、v26a和y29a将synnaps13配体与ecry3.1ab的结合亲和力减少至seqidno:21的结合亲和力的从约27％至76％。
结果还证明在结合结构域中某些氨基酸位置对于多种synnaps配体的完全功能性而言是关键的。跨synnaps的数据的总结显示在表10中，其中“++”意指与非突变synnaps相比结合相当，“+”意指与非突变synnaps相比结合减少，并且“-”与非突变synnaps相比没有结合。
表10.不同synnaps的结合亲和力的总结。
结果表明：(a)对应于seqidno:10、seqidno:17和seqidno:21的氨基酸位置22和31的氨基酸位置减弱抗原结合(即位置22和31减弱synnaps配体与cry1ab、mcry3a和ecry3.1ab的结合)；(b)对应于seqidno:10和seqidno:17的氨基酸位置44的氨基酸位置减弱抗原结合(即位置44减弱synnaps与cry1ab和mcry3a的结合)；(c)对应于seqidno:10和seqidno:21的氨基酸位置29的氨基酸位置减弱抗原结合(即位置29减弱synnaps与cry1ab和ecry3.1ab的结合)；(d)对应于seqidno:17和seqidno:21的氨基酸位置9、21、24或40的氨基酸位置减弱抗原结合(即位置9、21、24和40减弱synnaps与mcry3a和ecry3.1ab的结合)。
实例7.synnaps在植物细胞中的表达。
本实例描述了synnaps配体在植物细胞中的表达。在本实例中，制备了包含可操作地连接到synnaps-13编码序列的夜香树属(cmp)启动子(美国专利7,166,770)的表达盒，所述编码序列可操作地连接到nos终止子。将所得表达盒克隆到二元载体中并且转化至农杆菌属菌株eha101中，用于递送到植物细胞中。用含有表达载体的农杆菌属浸润来自三种植物(分别是玉米、大豆和烟草)的叶。将浸润的植物放置在托盘中，并且维持在25℃的生长室中，其中光周期为16小时光照和8小时黑暗。4天后，将组织取样，在pbst中提取，并且使用上述elisa在直接结合测定中针对cry1ab、ecry3.1ab和mcry3a进行测试。将按1nm添加synnaps-13的提取物用作阳性对照。在a405处读取吸光度。结果表明，在来自玉米、大豆或烟草的提取物中没有检测到cry1ab或mcry3a。然而，在来自所有三种植物物种的提取物中检测到ecry3.1ab，表明可以在玉米、大豆或烟草植物中产生功能synnaps-13。
序列表
<110>syngentaparticipationsag
yarnell,michelle
chevrel,anne
kitten,olivier
young,scott
<120>用于检测靶蛋白的非抗体配体
<130>81317-wo-reg-org-p-1
<150>us62/599,289
<151>2017-12-15
<160>98
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>615
<212>prt
<213>苏云金芽孢杆菌
<400>1
metaspasnasnproasnileasnglucysileprotyrasncysleu
151015
serasnprogluvalgluvalleuglyglygluargilegluthrgly
202530
tyrthrproileaspileserleuserleuthrglnpheleuleuser
354045
gluphevalproglyalaglyphevalleuglyleuvalaspileile
505560
trpglyilepheglyproserglntrpaspalapheleuvalglnile
65707580
gluglnleuileasnglnargileglugluphealaargasnglnala
859095
ileserargleugluglyleuserasnleutyrglniletyralaglu
100105110
serpheargglutrpglualaaspprothrasnproalaleuargglu
115120125
glumetargileglnpheasnaspmetasnseralaleuthrthrala
130135140
ileproleuphealavalglnasntyrglnvalproleuleuserval
145150155160
tyrvalglnalaalaasnleuhisleuservalleuargaspvalser
165170175
valpheglyglnargtrpglypheaspalaalathrileasnserarg
180185190
tyrasnaspleuthrargleuileglyasntyrthrasphisalaval
195200205
argtrptyrasnthrglyleugluargvaltrpglyproaspserarg
210215220
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>杂合毒素