线粒体靶向的声响应性的多层次肿瘤深穿透声敏剂的制备方法与流程

本发明申请属于生物医药
技术领域：
，具体公开了一种线粒体靶向的声响应性的多层次肿瘤深穿透声敏剂的制备方法。
背景技术：
：线粒体在细胞凋亡、程序性细胞死亡和线粒体活性氧信号的传导中起着重要作用。因此，线粒体作为抗癌药物的靶点是非常具有吸引力的。声动力疗法是一种基于超声(us)、声敏剂的用于治疗癌症的替代疗法，在将声敏剂用于肿瘤治疗的研究中，声敏剂面临的主要困境是如何将声敏剂选择性地富集到肿瘤区域，以及如何将声敏剂从血管内递送到灌注不良的肿瘤深部区域。由于肿瘤血管特有的“渗漏”结构增强了epr效应，使声敏剂可以在肿瘤中被动积聚(积聚的越多，越有利于肿瘤的治疗)，但是积聚效率较低，所以仅仅靠声敏剂在肿瘤中的被动积聚，完全不能达到对肿瘤治疗的理想效果。并且，声敏剂对肿瘤深部区域的渗透能力较差(使得其在肿瘤组织、血管周边和肿瘤深部区域的分布不均匀)，大大降低了声敏剂对肿瘤的治疗效果。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种线粒体靶向的声响应性的多层次肿瘤深穿透声敏剂的制备方法，以解决现有声敏剂在肿瘤中的积聚效率低，以及对肿瘤深部区域的渗透能力较差、在肿瘤内分布不均匀的问题。为了达到上述目的，本发明的基础方案为：线粒体靶向的声响应性的多层次肿瘤深穿透声敏剂的制备方法，包括以下步骤：(1)合成具有ir780的脂膜；(2)水化步骤(1)得到的脂膜，加入pfp，制得声敏剂ir780-nds。本基础方案的原理和有益效果在于：本制备方法所用到的ir-780为碘化物(cas号为207399-07-3)，pfp为全氟戊烷(cas号为375-61-1)。本制备方法通过简单、易操作和实验重复性强的乳化法就制得内部包载pfp，外壳修饰ir780的声敏剂。首先，将本声敏剂打入血管后，采用us辐照，本声敏剂的扩散方向为：血管内→血管周边的肿瘤组织→肿瘤深部，能够在肿瘤组织内高度积聚，并且能够多层次深穿透肿瘤、在肿瘤中均匀分布，具体原理如下：①由于us是一种机械波，us辐照本身就能够使物质产生质点的位移，从而影响周围压力(即产生空化效应)，从而将声敏剂推离波源，促进声敏剂沿血管周边的肿瘤组织→肿瘤深部方向扩散。②pfp在us辐照下产生adv效应，一方面pfp由液体变为气体，形成微泡，形成的微泡又进一步增强了空化效应，促进了过程①；另一方面，adv效应能够破坏肿瘤血管内皮间隙，使血管内皮间隙变大，使更多的在血液循环中的声敏剂进入到血管周边的肿瘤组织内，并由血管周边的肿瘤组织进入到肿瘤深部。除了adv效应能够促进本声敏剂由血管周边的肿瘤组织→肿瘤深部扩散之外，ir780也能够促进了本声敏剂由血管周边的肿瘤组织→肿瘤深部扩散。其次，本声敏剂还能够诱导肿瘤细胞凋亡，具体原因如下：①us辐照ir780，ir780产生活性氧(ros)，ros能够导致细胞毒性(ir780无需us辐照就能够达到向肿瘤深部运动的效果，但是不会产生活性氧)。②us可直接诱导肿瘤细胞凋亡。其次，本声敏剂不需要额外化学偶联就能够靶向到线粒体。其次，本声敏剂还能够多模态成像(超声us、活体荧光fl和光声pa成像)，pfp在us辐照下由液体变为气体(形成微泡)的独特相变能力可以用于us成像；ir780在近红外区强吸收能够用于fl成像和pa成像。多模态成像可以监测声敏剂在体内各脏器的分布情况，指导声动力治疗。综上，本声敏剂能够达到倍增增强肿瘤深部sdt，能够直接诱导肿瘤细胞凋亡，能够对肿瘤进行线粒体靶向sdt，能够多模态成像，有效确保了本声敏剂对肿瘤的治疗效果。另外，本声敏剂呈液体时为纳米级，十分稳定，在us照射下，本声敏剂由纳米级液滴转变为微米级气泡，微米级气泡有效保证了本声敏剂对肿瘤的治疗效果。进一步，步骤(2)加入pfp后，在冰浴下声震、离心后制得声敏剂ir780-nds。在冰浴下声震、离心的操作步骤较为简单，便于本制备方法的推广应用。进一步，所述步骤(1)采用dppc、dspe-peg2000、胆固醇和ir780合成脂膜，dppc为二棕榈酰磷脂酰胆碱，dspe-peg2000为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。dppc、dspe-peg2000和胆固醇三种原料较为常见，便于本制备方法的推广应用。进一步，按质量比，dppc:dspe-peg2000:胆固醇:ir780＝8-16:2-6:2-6:1-3。包封效率越高，本声敏剂在线粒体和肿瘤的靶向性越佳，对肿瘤的治疗效果越佳，在以上质量比下，ir780在声敏剂ir780-nds中的包封率能够达到83％。进一步，按质量比，dppc:dspe-peg2000:胆固醇:ir780＝12:4:4:1。在以上质量比下，制得的声敏剂ir780-nds的性能较佳。进一步，所述步骤(2)的声震的强度为100-150w。在以上声震条件下，本声敏剂对pfp的包载效率较高。附图说明图1为本发明实施例1制得的声敏剂ir780-nds的光镜图；图2为本发明实验一的光学显微镜图像；图3为本发明实验二的sosg探针的荧光强度；图4为本发明实验六的活体荧光成像图。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细说明：实施例1一种线粒体靶向的声响应性的多层次肿瘤深穿透声敏剂的制备方法，具体包括以下步骤：(1)合成具有ir780的脂膜：将dppc、dspe-peg2000、胆固醇和ir780混合(按质量比为12:4:4:1)，溶于5ml氯仿后，转移到圆底烧瓶中进行旋转蒸发，形成脂膜；(2)用4ml的pbs水化脂膜，加入400μl的pfp，在冰浴下、在强度为125w的声震条件下声震5min(以震动5s、暂停5s的模式声震5min)，最后离心(6000rpm，5min)制得声敏剂ir780-nds。实施例2-9和对比例1-2实施例2-5与实施例1的区别仅在于dppc、dspe-peg2000、胆固醇和ir780的质量比不同，实施例6-9与实施例1的区别在于声震的强度，具体参见下表1。对比例1为外壳未修饰ir780的空白纳米液滴(以下简称nds)，对比例1(nds)的制备方法与本声敏剂ir780-nds的区别仅在于合成脂膜步骤中未添加ir780。对比例2为外壳修饰ir780的，但是内部包载pfob的空白脂质体(以下简称ir780-pfob)。表1结论：(1)对比例3中的dppc:dspe-peg2000:胆固醇:ir780的质量比＝7:1:1:1＜8-16:2-6:2-6:1-3；对比例7中dppc:dspe-peg2000:胆固醇:ir780的质量比＝17:7:7:1＞8-16:2-6:2-6:1-3，在pfp定量的情况下，dppc:dspe-peg2000:胆固醇:ir780的质量比＞8-16:2-6:2-6:1-3时，声敏剂内包载的pfp过少；dppc:dspe-peg2000:胆固醇:ir780的质量比＜8-16:2-6:2-6:1-3时，声敏剂的成球率较低。对比例5中的声震的强度＝90w＜100w(声震的强度过小)，对比例6中的声震的强度＝160w＞150w(声震的强度过大)，对比例5制备的声敏剂大小不均一，并且声敏剂成球率较低，对比例6制备过程中，观察到pfp由液体变为气体，形成微泡，不利于脂膜对pfp的包载。实施例1-5制得的声敏剂ir780-nds的大小均一，脂膜内包载的pfp量较大，并且脂膜对pfp的包封率能够达到83％。(2)将实施例1(ir780-nds)和对比例1(nds)分别溶解于水中，ir780-nds水溶液呈蓝绿色，nds水溶液呈乳白色。(3)将实施例1所制得的声敏剂ir780-nds进行表征，具体表征参数见图1：①从光学显微镜图像(图1)可以看出，本声敏剂ir780-nds的大小均一、呈圆形。②本声敏剂的粒径在300nm左右，能够通过epr效应经肿瘤血管内皮间隙进入肿瘤组织、肿瘤深部。③采集本声敏剂ir780-nds的紫外光谱图，本声敏剂ir780-nds在780nm处有最大的吸收峰。实验一将实施例1制得的声敏剂ir780-nds溶解于去离子水中，制得浓度为2mg/ml的声敏剂ir780-nds水溶液。采用超声辐照仪对浓度为2mg/ml的声敏剂ir780-nds水溶液进行辐照。在不同强度(在0.8、1.6、2.4、3.2和4.0w/cm2强度下辐照3分钟)辐照。结论：(1)如图2所示，采集光学显微镜图像，在0.8w/cm2的超声强度下没有检测到明显的微泡；当强度达到1.6w/cm2时，微泡逐渐生成，并且微泡的数量和相变程度随us辐照强度增大而增大；在2.4w/cm2强度下，声敏剂ir780-nds几乎全部转化为微泡，并且部分微泡开始破裂；在3.2w/cm2强度下，微泡逐渐破裂，在4.0w/cm2强度下，声敏剂ir780-nds微泡几乎全部破裂。(2)采集本声敏剂ir780-nds的超声图像发现，在0.8w/cm2的超声强度下没有检测到超声增强信号，在1.6-2.4w/cm2的超声强度下，超声造影观察到明显的超声增强，超声强度的变化趋势与结论(1)中微泡的形成过程相同。(3)采用超声分析软件测量声敏剂ir780-nds的回波强度(用于测定产生的微泡数量)，回波强度越强，本声敏剂ir780-nds产生的气泡越多，测定后发现：回波强度的定量结果与光学显微镜图像、超声图像的结果一致。在us辐照下，pfp产生adv效应，adv效应能够引起超声增强，本实验一发现：微泡的生成、破裂的趋势与超声增强的变化趋势一致，所以推断出：包载在声敏剂ir780-nds核心的pfp对adv效应、us成像性能具有显著贡献。实验二由于sosg探针能够与ros反应，在488nm波长下能够产生荧光，所以可以采用sosg作为检测探针检测生成的ros。分别在us强度(2.4w/cm2)、辐照时间(0、30、60、90和120s)的条件下辐照实施例1制得的声敏剂ir780-nds，记录sosg探针的荧光强度(如图3)，其中sosg探针的最大荧光强度出现在530nm，如下表2。表2辐照时间/s0306090120sosg探针的荧光强度84.27801135.8032225.027246.2628280.3845结论：由图3和表2可得，us辐照的时间越长，ir780产生的ros越多，ros产生的越多越能够提高本声敏剂ir780-nds对肿瘤细胞的细胞毒性。实验三在us辐照下，全氟辛基溴(pfob)不能产生微泡，因而不能发生adv效应，所以本发明采用pfob作为对比来验证adv效应辅助声敏剂ir780-nds在肿瘤中的穿透深度。选取us辐照实施例1(ir780-nds)、对比例1(nds)和对比例2(ir780-pfob)，分别采用us辐照实施例1(ir780-nds)和对比例2(ir780-pfob)，并对实施例1(ir780-nds)、对比例1(nds)和对比例2(ir780-pfob)进行荧光分析。结论：对比例1(nds)、对比例2(ir780-pfob)和实施例1(ir780-nds)离血管的距离依次增加，其中未采用us辐照的对比例1(nds)仅分布在血管附近。采用us辐照的实施例1(ir780-nds)分布在远离血管的地方，这证明adv效应和超声辐照能够诱导声敏剂多层次深穿透肿瘤，在肿瘤中均匀分布。实验四通过共焦激光扫描显微镜和流式细胞术研究声敏剂ir780-nds在细胞内的摄取情况。在不同的培养时间(1h、2h、3h和4h)观察小鼠乳腺癌细胞(以下简称4t1细胞)对实施例1(ir780-nds)和对比例1(nds)的摄取情况。结论：共聚焦图像显示4t1细胞周围的ir780-nds要明显多于4t1细胞周围的nds，这证明ir780-nds可以有效的被4t1细胞摄取，但是nds被4t1细胞的摄取情况较差。此外，对于实施例1(ir780-nds)来讲，流式细胞仪测定的荧光强度随着共孵育时间的增加而显著增强，与共聚焦结果一致，也证明了ir780-nds可以有效的被4t1细胞摄取。实验五构建肿瘤灌注不均、细胞密度高、间质压力增大的三维肿瘤模型模拟肿瘤，用来研究本声敏剂ir780-nds对肿瘤的穿透能力。结论：大量dii标记的声敏剂ir780-nds发出红色荧光，穿透肿瘤核心球体，并分布于整个球体。但是对比例1(nds)仅粘附于肿瘤球体表面。实验六对4t1荷瘤小鼠静脉注射实施例1(ir780-nds)，并在不同时间点(0.5h、1h、2h、4h、6h和24h)进行活体荧光成像。并在24小时后，对老鼠的主要器官进行体外荧光成像。结论：如图4所示，注射0.5-24小时后，小鼠肿瘤区域有明显的荧光信号，随着时间的推移肿瘤区域信号增强。24小时后，对老鼠的主要器官进行体外荧光成像发现：老鼠的肿瘤组织的荧光最强，积累的荧光信号要明显强于其他器官(心、肝、脾、肺、肾)。取主要脏器和肿瘤进行病理检查，大量的声敏剂ir780-nds聚集在肿瘤组织中，而nds主要聚集在肝脏和脾脏中。实验七采用mitotracker(具有绿色荧光)标记线粒体，dii(具有红色荧光)标记实施例1(ir780-nds)和对比例1(nds)，采用共聚焦显微镜对实施例1(ir780-nds)和对比例1(nds)的亚细胞定位进行监测和比较。结论：(1)在ir780-nds存在的情况下，在线粒体区域检测到显著的红色荧光。当图像重叠时，红色荧光与绿色荧光融合良好，说明ir780-nds具有线粒体靶向能力；(2)在nds存在的情况下，在线粒体区域没有明显的红色荧光。以上结果证明声敏剂ir780-nds在肿瘤中的有效积累、多层次深穿透和作为荧光显像造影剂、并且能够靶向到线粒体的理想特性。以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。当前第1页12