一种百日咳毒素在治疗脑梗死中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种百日咳毒素在治疗脑梗死中的应用。

背景技术：

脑梗死又称缺血性卒中，脑卒中是世界第二大致死病因。在我国，脑卒中已超过心脏疾病，成为我国人民致死和致残的首位原因。

小胶质细胞位于中枢神经系统内,是脑损伤后反应最快的炎症细胞，且参与调节缺血后脑损伤的转归。研究表明，脑缺血后小胶质细胞数分钟内即开始激活并产生过量的炎症因子，继而加重脑组织损伤。脑缺血后小胶质细胞增殖的高峰在48-72h。急性期抑制小胶质细胞的激活及炎症因子的释放可减轻脑缺血后脑损伤。

目前缺血性脑卒中的治疗是医学的一大挑战，高死亡率和高致残率仍是该病特点，探寻更多有效的治疗方法或药物具有重大的临床意义和实用价值。

技术实现要素：

本发明提出了百日咳毒素在治疗脑梗死中的应用，百日咳毒素可在卒中中起到保护作用，为临床治疗脑梗死的药物研发提供了积极的借鉴作用。

一种百日咳毒素在治疗脑梗死中的应用，所述的百日咳毒素为针剂，百日咳毒素制成针剂步骤包括：

(1)纯化：将百日咳杆菌培养与stainer和scholte综合液体培养基中，经36℃孵育5天，除去菌细胞的上清液并用冰醋酸调ph至6.5，然后每升中加入0.5g/ml的zncl220ml，离心收集沉淀物，按上清液量每升加入10％的na2hpo4溶液37ml，使复合物溶解，离心取沉淀，用50mmol/l的tris-hclnacl缓冲液ph8抽提两次以上，混合抽提液，以5mmol/ltris-hclnacl缓冲液ph816ml连续透析3次，进一步离心收集沉淀物，再以0.1mol/l焦磷酸钠ph10.5提取，抽提物再以tris-hclnacl缓冲液等体积稀释，将含有百日咳毒素的抽提物进行sepharosecl-6b层析，收集各组分，真空超速离心，所得的活性部分再通过生物凝胶a0.5m过柱，过柱的活性部分再离心浓缩，置2～5℃经2-3周，得到结晶的百日咳毒素；

(2)溶液配制：取结晶的百日咳毒素加入生理盐水中并36℃水浴，得到百日咳毒素溶液。

(3)封装：使用安剖灌装机将百日咳毒素溶液封装于安剖瓶中即得到用于治疗脑梗死的针剂。

优选的，所述的百日咳毒素制成的针剂浓度为40-50ug/ml。

本发明的有益效果：本发明提供的百日咳毒素可在卒中中起到保护作用，为临床治疗脑梗死的药物研发提供了积极的借鉴作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是实验组和对照组在72h后的脑梗死形态图；

图2是实验组和对照组在72h后的脑梗死面积统计图；

图3是实验组和对照组在不同阶段的脑梗死面积变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例通过小鼠实验验证百日咳毒素减小卒中后脑梗死面积的效果。

百日咳毒素(ptx)是鲍特氏菌属百日咳杆菌所产生的一种主要毒力因子，具有多种生物学活性，能引起百日咳众多的临床症状，也是主要的免疫原，其抑制小胶质细胞的聚集或增生，在脑卒中中起到保护作用。

(1)卒中模型的建立

采用大脑中动脉线栓法(mcao)建立缺血性脑卒中模型。选择20～25g雄性成年小鼠，腹腔注射复合麻醉药(氯胺酮1mg+甲苯噻嗪0.5mg溶解于1ml生理盐水中，注射剂量为0.01ml/g)进行麻醉。固定于手术台上，颈部消毒，置于手术显微镜下操作，沿颈正中线剪开皮肤，钝性剥离皮下组织，暴露右侧颈内、颈外和颈总动脉，在颈总动脉上剪一小口，以栓塞线沿颈内动脉进入约10mm或有轻微阻力，停止进线，清理术野、止血后，恢复颈部解剖结构，间断缝合皮肤切口，根据术中出血情况予腹腔注射生理盐水补液。术后放入动物饲养恒温箱保暖，单独饲养，每日两次腹腔注射生理盐水1ml，采用longa评分法进行动物行为学评分，以确定是否造模成功。

(2)ptx的治疗

在小鼠成功诱导卒中以后，实验组予ptx1000ng溶于1ml生理盐水腹腔注射干预，对照组予1ml生理盐水腹腔注射。

(3)原代神经元的培养

取24h内出生的小鼠，酒精消毒后断头，取出脑组织，在解剖液中分离组织，保留皮质和海马，仔细剥离脑膜(置于冰上)。将脑组织剪碎，静置后去上清。用0.25％胰蛋白酶轻柔混匀，在37℃培养箱中消化10min，取出，加入2倍体积的终止液，将组织转移至10cm的无菌培养皿并置于冰袋上，用巴斯德管反复吹打，静置后收集上清液，用70um细胞筛网过滤，于血球计数板上计数细胞。调整细胞悬液的密度，接种到多聚赖氨酸包被过的培养皿。放入37℃培养箱培养，4h后将接种液换为神经元培养液，以后每3天半量换液。

(4)ttc染色

将脑组织完整取出置于脑槽内，于-20℃速冻4min，冠状位从前向后以1mm厚度切脑，将切好的脑片放置于2％ttc染色液中，放入37℃温箱中避光染色20min，每隔5min翻转脑片一次。染色完成后可见梗死灶为白色，正常脑组织为红色。用数码相机采集照片留存。

(5)mtt法测定细胞存活率及乳酸脱氢酶的测定

细胞活率的测定使用mtt细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒，根据试剂盒提供的方法测量细胞活率，在酶标仪490nm处测量吸光度。乳酸脱氢酶(ldh)的测定则使用ldh的cytotox96－非放射性细胞毒性测定试剂盒，根据试剂盒提供的方法测量谷氨酸兴奋毒性，在酶标仪490nm处测量吸光度。

(6)免疫组化

mcao后24h，用麻醉使小鼠安乐死。取出鼠脑用4％多聚甲醛固定。将固定的鼠脑用石蜡包埋并切成连续3um厚的冠状切片。使用caspase-3抗体进行免疫组织化学染色。使用显微镜观察图像，计数caspase-3的阳性细胞。

(7)钙显像

将神经元用预热的hbss洗涤，然后加入fluo-3/am工作溶液(3μmfluo-3/am，hbss)于37℃孵育20min，用hbss再次洗涤并置于激光扫描共聚焦显微镜上，用488nm激发光激发并在530nm处检测。细胞每秒扫描一次，共持续240s。在hbss中记录60s作为基线，随后将细胞暴露于加入了谷氨酸的hbss中(50μm谷氨酸+10μm甘氨酸)，显微镜下记录180s。

(8)结果

ptx的治疗可减小卒中后脑梗死面积。ptx治疗后，脑梗死面积较对照组明显减小，由(51±11)％降至(34±8)％，说明ptx的治疗可以缩小maco后造成的缺血梗死灶，在卒中中起到保护作用。

如图1、图2所示，分别在梗死后24h、48h、72h时对小鼠的神经功能进行longa评分，并进行统计学分析，结果显示，在梗死后24h及48h时，小鼠行为学评分无统计学差异，梗死后72h，治疗组小鼠的行为学评分为1.6分，明显低于对照组2.3分，说明小鼠在发生脑梗死的初期，神经功能损伤程度相当。

如图3所示，经过3天ptx治疗后，治疗组神经功能逐渐恢复，而对照组则无明显变化。