丹参乙酸镁或含有丹参乙酸镁的药物组合物对于肝脏缺血再灌注的保护作用及应用的制作方法

本发明属于医药用途领域，具体涉及丹参乙酸镁或含有丹参乙酸镁的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物为治疗和/或预防肝脏损伤，尤其是由肝脏缺血再灌注引起的肝损伤的药物。

背景技术：

肝脏是人体最大的实质性器官，也是人体重要的代谢器官之一，其功能主要包括胆汁的生成和分泌、脂质和糖代谢、解毒、凝血、调节血液循环量，同时肝脏也是重要的免疫器官，通过吞噬、隔离、消除入侵和内生的各种致病原起到保护机体健康的作用。肝脏在发挥解毒和免疫作用的同时也会受到内、外源性毒性物质的侵害，损伤肝脏，造成肝脏功能的异常。据统计，全球肝病患者高达13亿，欧美国家约为5亿，我国约为4亿，随着肝脏疾病的发展进程，多数会发展为肝癌，目前尚未有治疗肝癌的特效药物，肝脏移植是治疗终末期肝病的唯一有效手段，而移植往往伴随着对肝脏组织进行缺血处理。jennings在十九世纪七十年代首先提出缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,iri)的概念：缺血的器官、组织重新再获得血液供应后不仅不能使组织、器官功能恢复，反而会加重功能代谢障碍及结构破坏，这种现象被称之为iri。

需要指出的是，肝脏缺血再灌注损伤与心脑血管的缺血再灌注损伤的病因以及疾病发展进程是有着明显的不同。心脑血管缺血再灌注损伤的发病原因是血管内物质沉积形成栓塞或者坏死，导致心脑血管缺血，多数是一种病理性的原因所导致的，仅有少数是因为器官移植等手术所致的物理性损伤，因此在心肌梗死以及脑卒中的治疗上除了需要保护心脑组织之外还要注意对血管的保护以及进行溶栓和防止血栓再次形成，而肝脏缺血再灌注损伤的主要靶细胞是肝窦内皮细胞以及后期对肝细胞的损伤，导致肝脏功能异常，代谢紊乱等，其主要发生在肝脏移植、肝切除、创伤、出血性休克以及其他系统性低血流量疾病如败血症、呼吸衰竭、充血性心力衰竭等。多发于物理性损伤或者其他血液供应不足的病变，因此，针对肝脏缺血再灌注的损伤着重需要保护的肝脏细胞本身，肝细胞是肝脏发挥功能的重要基础，肝脏缺血再灌注损伤对肝细胞的损伤会导致肝脏功能异常，严重时还会导致肝衰竭，研究发现肝衰竭概率高达10％，同时还容易引发急或慢性肝移植排斥，对于患者的术后恢复、手术的成功率以及患者的存活率有着很大的影响。

检索肝脏缺血再灌注相关研究发现，和心脑血管缺血再灌注损伤不同，临床上并没有针对性减轻肝脏缺血再灌注损伤的治疗药物。平常仅所使用的抗氧化剂(维生素c、维生素e、α-硫辛酸、还原型谷胱甘肽、n-乙酰半胱氨酸等)、褪黑素、曲美他嗪等药物虽然在一定程度上能够起到保护作用，但依旧不能确切的缓解缺血再灌注损伤，因此，迫切需要找到一种能够安全有效且有明确机制的药物来治疗或者减轻这种肝脏损伤。

技术实现要素：

由于临床肝脏缺血再灌注损伤发病普遍、死亡率高、缺乏治疗此类损伤的特效药物，因此寻找和研发机制明确、疗效可靠、安全的药物是急需解决的一个重要问题，具有重要的临床价值。

本发明研究发现，丹参乙酸镁或含有丹参乙酸镁的药物组合物对于肝脏缺血再灌注具备比较明确的保护作用，能够减少由于肝脏缺血再灌注造成的肝脏损伤，减少并发症，改善临床治疗效果。本发明利用小鼠肝脏缺血再灌注动物模型，首次系统证明丹参乙酸镁或含有丹参乙酸镁的药物组合物对于肝脏缺血再灌注的治疗和保护作用，并阐明其内在机制，为临床应用提供理论依据。

因此，本发明提供了丹参乙酸镁或含有丹参乙酸镁的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物为治疗和/或预防肝脏损伤的药物。

优选地，所述肝脏损伤为由肝脏缺血再灌注引起的肝损伤。

优选地，所述含有丹参乙酸镁的药物组合物为丹参多酚酸盐(国药准字z20050249)。

其中，所述丹参乙酸镁的化学结构如图1所示。

丹参是重要的活血化瘀中药，丹参及其制剂临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗。丹参乙酸镁(或丹酚酸b镁)是丹参中的主要水溶性成分。《神农本草经》记载丹参具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效，早期对于丹参的研究发现，它能够抗心律失常，扩张冠脉，增加冠脉血流量，调节血脂，抗动脉粥样硬化；能改善微循环，提高耐氧能力，保护心肌；可扩张血管，降低血压；能降低血液粘稠度，抑制血小板聚集，对抗血栓形成。对于丹参的研究也发现丹参能够改善肾功能、保护缺血性肾损伤；还能对抗肝纤维化作用。

本发明人团队曾基于丹参乙酸镁为主要成分，配合其他多酚酸盐类化合物对心血管系统的保护作用，研制了丹参多酚酸盐及其粉针剂(国药准字z20050249)，用于冠心病和心绞痛的治疗，在临床上已应用于2000万以上患者，显示了显著的安全性和有效性。

本发明人进一步研究发现，丹参乙酸镁能够有效地降低肝脏缺血再灌注所引起的血清中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、乳酸脱氢酶(ldh)、白介素-6(il-6)、白介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的异常升高，同时能够降低组织中丙二醛(mda)的含量，升高组织中超氧化物歧化酶(sod)的含量，对抗肝脏缺血再灌注引发的肝损伤，发挥保护作用。而以丹参乙酸镁为主要成分(80％以上)的丹参多酚酸盐同样能够保护肝脏缺血再灌注损伤，效果与丹参乙酸镁相似。以上药效学发现的机制在于，我们发现的丹参乙酸镁通过调控jak2/stat3信号转导通路，抑制炎症，从而达到对抗急性肝损伤作用。因此我们认为，丹参乙酸镁可以有效对抗肝损伤，其机制为丹参乙酸镁对于炎症的抑制作用(详见下面详细数据支持)。此作用从未被报道。

此前有中文文献报道，丹参多酚酸盐对小鼠肝脏缺血再灌注后引起的肺损伤有一定保护作用。该文献实际上是评估肝脏缺血后所引起的远器官损伤，并非肝损伤。而且机制方面，仅仅是推测nfκb的参与，并未深入研究论文：[1]滕飞,傅志仁,孙克彦,郭闻渊,刘芳,王正昕,丁国善.丹参多酚酸盐对小鼠肝脏缺血再灌注后肺损伤的保护作用[j].解放军医学杂志,2011,36(11):1171-1174.。另外，另有一篇文献报道，含丹参复方可以改善肝脏纤维化，促进肝脏组织再生。但是，肝纤维化是一种慢性疾病，丹黄复方抗纤维化据推测是复方可以抑制纤维母细胞的过度增生，促进肝细胞的分裂。并无确切数据显示单独丹参或者其主要成分在此过程中发挥作用([2]朱清静.丹黄方对急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的实验研究[d].湖北中医学院,2006)。综上所述，以上两篇报道针对的药物主体(化合物单体还是中药复方)、治疗用途(急性还是慢性肝脏疾病，炎症应激反应还是肝脏纤维化)等和我们均不同，且没有明确机制。

附图说明

图1为显示丹参乙酸镁结构式。

图2显示丹参多酚酸盐对小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的alt、ast、il-6含量变化柱状图。a和b分别为假手术(sham)组、缺血再灌注损伤(iri)组、缺血再灌注损伤(iri)+丹参多酚酸盐10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg组血清中alt、ast水平，c为sham组、iri组、iri+丹参多酚酸盐10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg组肝脏组织中il-6的基因表达水平。*代表与sham组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；#代表与iri组相比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

图3为显示丹参乙酸镁对小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的alt、ast、ldh含量变化柱状图。a-c分别为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组血清中alt、ast、ldh水平。*代表与sham组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；#代表与iri组相比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

图4为显示丹参乙酸镁对小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的血清中炎症因子tnf-α、il-1β、il-6含量变化柱状图。a为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组血清中tnf-α水平，b为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组血清中il-1β水平，c为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组血清中il-6水平。*代表与sham组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；#代表与iri组相比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

图5为显示丹参乙酸镁对小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的组织中丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)含量变化的柱状图。。a为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组组织中mda的水平，b为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组组织中sod水平。*代表与sham组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；#代表与iri组相比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

图6为丹参乙酸镁对小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的组织中磷酸化jak2/stat3水平和凋亡蛋白bax的表达水平变化柱状图以及蛋白表达电泳图。a为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组组织中p-jak2表达情况及定量分析，b为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组组织中p-stat3表达情况及定量分析，c为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组组织中bax表达情况及定量分析。*代表与sham组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；#代表与iri组相比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

图7为显示丹参乙酸镁减轻由于缺血再灌注所引起损伤程度，减轻坏死水平的照片及损伤面积的柱状图。a为sham组(a)、sham+mlb30mg/kg组(b)、iri组(c)、iri+mlb30mg/kg组(d)典型的病理切片，b为sham组、sham+mlb30mg/kg组、iri组、iri+mlb30mg/kg组病理评分定量分析。*代表与sham组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；#代表与iri组相比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1丹参多酚酸盐对于肝脏缺血再灌注的保护作用

1.1、分组、给药和实验方法

c57bl/6小鼠(购自上海实验动物有限公司)适应性喂养三天，随机分为假手术组(sham)、缺血再灌注损伤组(iri)、缺血再灌注损伤+丹参多酚酸盐10mg/kg组、30mg/kg组、100mg/kg组，丹参多酚酸盐(国药准字z20050249)使用生理盐水溶解，缺血再灌注损伤+丹参多酚酸盐10mg/kg组、30mg/kg组、100mg/kg组分别于手术前24h、12h、1h经尾静脉给药三次，每次分别给予10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg丹参多酚酸盐，除了假手术组以外，其余各组根据文献报道(ge,m.,etal.,brg1-mediatednrf2/ho-1pathwayactivationalleviateshepaticischemia-reperfusioninjury.celldeathdis,2017.8(6):p.e2841)构建70％热缺血再灌注模型，简而言之，50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，沿腹中线开口，分离出肝脏血管、胆管，使用无创显微止血夹夹闭肝左叶和肝中叶肝血管、胆管造成肝70％缺血，缺血60min后，恢复供血，缝合腹腔，再灌注6h后收集各组血液样本和缺血再灌注组织样本，用于血生化和qpcr检测。

1.2、血生化检测

收集的血液样本室温静置1h后，3500rpm/min，4℃离心15min，取上清液，利用全自动血生化仪(sysmexjca-bm6010c)检测血液中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)的水平。结果见图2。如图2所示，丹参多酚酸盐显著降低小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的alt、ast升高，在30mg/kg以上剂量药效达到峰值。

1.3、qpcr检测白介素-6(il-6)的基因表达

每15-25mg肝组织加入0.5mltrizol，用高通量组织研磨机匀浆，加0.2ml氯仿，上下颠倒1min左右，室温放置3min，12000rpm/min，4℃离心10min取上清，加入1/2体积的无水乙醇上下混匀后转移至吸附柱，静置2min后12000rpm/min，4℃离心3min，弃去废液，将吸附柱重新放入收集管中，加入500μlrpesolution，静置2min，10000rpm/min离心30s，洗涤两次，将吸附柱加入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中加入30uldepc-treatedddh2o，静置5min，12000rpm/min离心2min，利用take3超微量多体积检测板测定rna浓度后，反转后利用qiagenrealtimepcr仪检测相关基因的变化情况。

结果如图2所示，丹参多酚酸盐能够显著降低缺血再灌注引起的il-6的基因表达升高，在30mg/kg以上剂量药效达到峰值。

实施例2丹参乙酸镁对肝脏缺血再灌注的保护作用及机制

丹参乙酸镁为丹参多酚酸盐的主要药效成分。因为上述实验已经证明丹参多酚酸盐在30mg/kg以上剂量达到最大药效剂量，下面实验选用丹参乙酸镁临床剂量30mg/kg为药效剂量进行机制研究。

2.1、c57bl/6小鼠适应性喂养三天，随机分为假手术(sham)组、缺血再灌注损伤(iri)组、缺血再灌注损伤+丹参乙酸镁(iri+mlb)30mg/kg组，丹参乙酸镁(中国科学院上海药物所宣利江组)使用生理盐水溶解，分别于手术前24h、12h、1h经尾静脉给药三次，每次给予30mg/kg。除了假手术组以外，其余各组根据文献报道[1]构建70％热缺血再灌注模型，简而言之，50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，沿腹中线开口，分离出肝脏血管、胆管，使用无创显微止血夹夹闭肝左叶和肝中叶肝血管、胆管造成肝70％缺血，缺血60min后，恢复供血，缝合腹腔，再灌注6h后收集各组血液样本和缺血再灌注组织样本，用于之后的研究和实验。

2.2、血生化检测

收集的血液样本室温静置1h后，3500rpm/min，4℃离心15min，取上清液，利用全自动血生化仪(sysmexjca-bm6010c)检测血液中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)和乳酸脱氢酶(ldh)的水平。结果见图3。如图3所示，丹参乙酸镁在临床剂量下同样能够显著降低小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的alt、ast、ldh升高。

2.3、炎症因子检测

利用白介素-6(il-6)、白介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)试剂盒(购自r&d和联科生物科技有限公司)按照试剂盒说明书检测血液中炎症因子的水平。结果见图4。如图4所示，丹参乙酸镁降低小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的血清中炎症因子tnf-α、il-1β、il-6升高。

2.4、氧化应激相关因子mda、sod水平的检测

利用mda、sod试剂盒(碧云天生物科技有限公司)检测组织样本中mda、sod水平。结果见图5。如图5所示，丹参乙酸镁降低小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的组织中丙二醛(mda)的升高，恢复由于缺血再管注所引起的超氧化物歧化酶(sod)降低。

2.5、westernblot检测p-jak2、p-stat3、bax表达

肝脏组织使用含有1％蛋白酶抑制剂pmsf的ripa裂解液(购自碧云天生物科技有限公司)，离心取上清，使用bca试剂盒(购自thermo)测定上清浓度，等量的蛋白与硫酸十二酯(sds)上样缓冲液(购自上海翊圣生物科技有限公司)混和，100℃煮沸10min。随后，等量的蛋白样品使用聚丙烯酰胺凝胶进行分离，然后转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜(购自millipore公司)上，3％脱脂奶粉封闭1h后，与一抗孵育过夜，其中p-jak2/jak2(购自abcam公司)、p-stat3/gapdh(购自cst公司)、stat3/bcl2/bax(购自protech公司)，0.1％tbst洗膜三次后加入二抗(购自cst公司)孵育1h后洗膜，使用超敏发光液(购自上海翊圣生物科技有限公司)和成像仪(购自勤翔仪器公司)进行发光。得到的图像使用imageproplus统计软件进行定量统计。

结果见图6。如图6所示，丹参乙酸镁能够降低小鼠肝脏缺血再灌注损伤所引起的组织中磷酸化jak2/stat3水平的升高，降低凋亡蛋白bax的表达。

2.6、丹参乙酸镁减轻由于缺血再灌注所引起损伤程度，减轻坏死水平的照片及损伤面积柱状图，结果见图7。

动物收集血液后，使用0.9％生理盐水经肝门静脉注射进入肝脏组织内，灌洗3次，每次10ml，取右侧大叶，使用10％福尔马林进行固定24h，将固定好的组织包埋在石蜡中，切成4um肝脏切片，使用苏木精和伊红染料进行染色。根据肝脏缺血再灌注损伤评分方法suzuki’s进行病理评分。

如图7所示，丹参乙酸镁能够减轻由于缺血再灌注所引起损伤程度，减轻坏死水平。