一种骨支架复合体及其制备方法与流程

本发明实施例涉及组织工程
技术领域：
，具体涉及一种骨支架复合体及其制备方法。
背景技术：
：骨缺损是指骨的结构完整性被破坏，是临床的常见病症；感染、肿瘤、创伤、骨髓炎手术清创以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因；骨缺损在临床上发病率较高，缺损部位的骨骼不完整使其外形和功能出现缺陷，不同程度地影响着患者的生活质量。在骨科，骨肿瘤、外伤、骨髓炎、骨坏死等原因均可引起不同程度的骨缺损，尤其是大段骨缺损，是骨科面临的一大难题，传统的骨骼移植材料主要为自体异体骨和人工支架，因机体需要将骨骼移植材料逐步吸收、改建，效果比较缓慢，治疗周期长，而且并发症比较多，可能出现再次骨缺损，患者痛苦多，严重影响骨移植效果，骨缺损修复效果较差。技术实现要素：为此，本发明实施例提供一种骨支架复合体的制备方法，该制备方法制备得到的骨支架复合体能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化，提高骨缺损的修复效果以解决现有技术中采用骨骼移植材料而存在的效果缓慢、并发症多、骨缺损修复较差的问题。为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：根据本发明实施例的第一方面提供一种骨支架复合体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将聚磷酸钙进行研磨、过筛得到聚磷酸钙非晶粉末；(b)将得到的聚磷酸钙非晶粉末进行烧结、缓慢升温至580-585℃保持100-140min，随后冷却得到聚磷酸钙骨支架材料；(c)将聚磷酸钙骨支架材料与淫羊藿苷混合，再经3d快速打印成型，即得所述骨支架复合体。本发明上述制备方法中通过对聚磷酸钙进行研磨处理，能够提高制备得到的骨支架复合体的强度，以及对聚磷酸钙的缓释作用；再通过烧结、升温处理能够提高聚磷酸钙的生物力学性能；此外，本发明通过将淫羊藿苷和聚磷酸钙骨支架材料混合制备得到骨支架复合体，能够实现制备的骨支架复合体对淫羊藿苷和聚磷酸钙的缓释作用，通过聚磷酸钙和淫羊藿苷的共同作用能够促进骨髓间充质干细胞(bmscs)的成骨分化，从而修复骨缺损区，并且修复快、效果优异。进一步地，所述3d快速打印采用的3d打印机设置参数为：喷头400-600μm，移动速度80-120mm/min，支架存储为stl格式。进一步地，所述聚磷酸钙骨支架材料与淫羊藿苷的质量比为(3-5)∶1。通过对聚磷酸钙骨支架材料和淫羊藿苷用量的限定，能够实现两者更好的协同作用，达到更好的促进bmscs的成骨分化，提高骨缺损的修复效果。进一步地，所述聚磷酸钙非晶粉末粒径为70-100μm。通过对聚磷酸钙非晶粉末粒径的限定，能够更好的促进制备得到的骨支架复合体的强度以及对聚磷酸钙的缓释作用。进一步地，所述烧结温度为500-520℃，时间为110-120min。进一步地，所述缓慢升温速度为2-3℃/min。本发明通过上述参数的限定，能够更好的提高聚磷酸钙的生物力学性能。在本发明中对聚磷酸钙的来源不作严格限制，例如，可以通过市场购买得到；优选地，所述聚磷酸钙通过如下方法制备得到：将ca(h2po4)2·h2o进行保温后，再升温至熔融、淬冷后制得聚磷酸钙非晶烧料；再将得到的聚磷酸钙非晶烧料进行清洗、烘干即得所述聚磷酸钙。进一步地，所述保温的温度为400-600℃，时间为50-70min。进一步地，所述淬冷介质选自空气、惰性气体和水中的任意一种。进一步地，所述清洗采用的溶剂为乙醇。根据本发明实施例的第二方面提供一种骨支架复合体，所述骨支架复合体由上述制备方法制备得到。本发明骨支架复合体具有优异的机械强度，以及对聚磷酸钙和淫羊藿苷的缓释作用。本发明实施例具有如下优点：(1)本发明上述制备方法中通过对聚磷酸钙进行研磨处理，能够提高制备得到的骨支架复合体的强度，以及对聚磷酸钙的缓释作用；再通过烧结、升温处理能够提高聚磷酸钙的生物力学性能。(2)本发明通过将淫羊藿苷和聚磷酸钙骨支架材料混合制备得到骨支架复合体，能够实现制备的骨支架复合体对淫羊藿苷和聚磷酸钙的缓释作用，通过聚磷酸钙和淫羊藿苷的共同作用能够诱导bmscs的成骨分化，从而修复骨缺损区，并且修复快、效果优异。(3)本发明骨支架复合体具有优异的机械强度，以及对聚磷酸钙和淫羊藿苷的缓释作用。附图说明为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。图1为本发明实施例3制备得到的骨支架复合体的电镜扫描图；图2为本发明实验例中提供的bmscs阳性表达cd44的染色结果图；图3为本发明实验例中提供的bmscs阴性表达cd34的染色结果图；图4为本发明实验例中两组大白兔在4周、8周、12周股骨髁处标本的x线检查结果图；图5为本发明实验例中两组大白兔在4周、8周、12周股骨髁组织的van-gieson染色图；图6为本发明实验例中采用显微镜观察两组大白兔在4周、8周、12周时bmscs迁移图；图7为本发明实验例中采用显微镜观察两组大白兔在4周、8周、12周时神经生长因子表达水平图。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下各实施例采用的原料如下：淫羊藿苷：纯度98％；来源西安昊轩生物有限公司，批号为yyh120318。实施例1本实施例为一种骨支架复合体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将ca(h2po4)2·h2o在400℃保温70min后，升温至熔融，采用水进行淬冷制得聚磷酸钙非晶烧料；再将得到的聚磷酸钙非晶烧料采用乙醇进行清洗、烘干即得聚磷酸钙；(b)将聚磷酸钙进行研磨、过筛得到粒径为70-100μm的聚磷酸钙非晶粉末；(c)将得到的聚磷酸钙非晶粉末进行烧结，然后以2℃/min升温至580℃保持140min，随后冷却得到聚磷酸钙骨支架材料，其中烧结温度为500，时间为120min；(d)按照质量比为5∶1将聚磷酸钙骨支架材料与淫羊藿苷混合，再经3d快速打印成型，即得骨支架复合体，其中3d快速打印采用的3d打印机设置参数为：喷头400μm，移动速度120mm/min，支架存储为stl格式；打印参数为x轴为4mm，y轴为4mm，z轴为10mm。实施例2本实施例为一种骨支架复合体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将ca(h2po4)2·h2o在600℃保温50min后，升温至熔融，采用水进行淬冷制得聚磷酸钙非晶烧料；再将得到的聚磷酸钙非晶烧料采用乙醇进行清洗、烘干即得聚磷酸钙；(b)将聚磷酸钙进行研磨、过筛得到粒径为70-100μm的聚磷酸钙非晶粉末；(c)将得到的聚磷酸钙非晶粉末进行烧结，然后以3℃/min升温至585℃保持100min，随后冷却得到聚磷酸钙骨支架材料，其中烧结温度为585℃，时间为110min；(d)按照质量比为3∶1将聚磷酸钙骨支架材料与淫羊藿苷混合，再经3d快速打印成型，即得骨支架复合体，其中3d快速打印采用的3d打印机设置参数为：喷头600μm，移动速度80mm/min，支架存储为stl格式；打印参数为x轴为4mm，y轴为4mm，z轴为10mm。实施例3本实施例为一种骨支架复合体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将ca(h2po4)2·h2o在500℃保温60min后，升温至熔融，采用水进行淬冷制得聚磷酸钙非晶烧料；再将得到的聚磷酸钙非晶烧料采用乙醇进行清洗、烘干即得聚磷酸钙；(b)将聚磷酸钙进行研磨、过筛得到粒径为70-100μm的聚磷酸钙非晶粉末；(c)将得到的聚磷酸钙非晶粉末进行烧结，然后以2.5℃/min升温至582℃保持120min，随后冷却得到聚磷酸钙骨支架材料，其中烧结温度为582，时间为115min；(d)按照质量比为4∶1将聚磷酸钙骨支架材料与淫羊藿苷混合，再经3d快速打印成型，即得骨支架复合体，其中3d快速打印采用的3d打印机设置参数为：喷头500μm，移动速度100mm/min，支架存储为stl格式；打印参数为x轴为4mm，y轴为4mm，z轴为10mm。对上述方法制备得到的骨支架复合体在电竞下进行超微结构观察，观察结果如图1所示，由图1可知，电镜下淫羊藿苷均匀分布在骨支架复合体的表面。将上述制备得到的骨支架复合体应用有限元分析软件ansys10.0，进行网格划分、材料属性赋值生成有限元模型；设定边界条件为复合骨支架两端固定；轴向施加于骨支架上，逐步施加25n，150n，250n，350n轴向压力，观察不同载荷情况下模型的应力应变情况；结果如表1所示：表1在25n，150n，250n，350n轴向压力的平均应力及最大位移表压力应力位移(in)位移(mm)25n2.632e+011.512e-020.43150n1.467e+011.104e-012.48250n2.727e+011.741e-014.46350n3.228e+022.496e-016.21由表1可知：本发明制备得到的骨支架复合体具有优异的力学性能。实验例1材料与方法实验动物：健康级、3月龄、体重2.3-2.8kg、雌雄各半、新西兰大白兔40只，36只用于建立骨缺损模型，4只用于制备bmscs，新西兰大白兔由南华大学动物实验中心提供，实验动物和设施(设施地址：湖南省衡阳市常胜路28号)许可证号：syxk(湘)2015-0001。主要试剂：骨支架复合体由实施例3制备得到；dmem培养基、胎牛血清(美国sigma公司)，免疫组化鼠抗兔cd34多克隆抗体、鼠抗兔cd44多克隆抗体、兔抗鼠神经生长因子多克隆抗体、羊抗兔igg多克隆抗体(美国santacruz公司)，免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒、q-rtpcr试剂盒(美国invitrogen公司)。2实验方法兔bmscs的分离与培养：将新西兰大白兔麻醉成功后，消毒铺巾，自股骨髁上结节处行骨髓穿刺，骨髓穿刺针有落空感后，抽出穿刺针针芯，接上注射器，抽取2ml骨髓液，并用同样方法抽取对侧骨髓液，将抽取的骨髓加到percoll液面上，以2000r/min离心20min，吸取单核细胞层(云雾状)，pbs洗涤后收集细胞，加入dmem培养基(含青霉素100u/ml、链霉素100u/ml、体积分数10％胎牛血清)中培养，48h全量换液，以后每3d进行全量换液，代细胞基本铺满瓶底时进行传代培养，选取传代第3代细胞进行实验。兔bmscs鉴定：采用免疫组化法鉴定兔bmscs：将生长良好的第3代bmscs接种到放有盖玻片的6孔板中培养24h，取出盖玻片，使有细胞的一层向上，生理盐水冲洗2遍，晾干，多聚甲醛固定，加入过氧化氢孵育10min，蒸馏水洗涤，加入鼠抗兔cd34抗体和鼠抗兔cd44抗体过夜孵育，pbs液冲洗，加入dab显色液孵育10min，pbs洗涤，中性树胶封片，显微镜下拍照观察染色情况，染色结果如图2、图3所示；由图2、图3可知，培养细胞阳性表达cd44，阴性表达cd34，表明培养细胞为bmscs。建立兔骨缺损模型及植入骨支架复合体：于大白兔股骨髁处制作骨缺损模型：将两组新西兰大白兔采用戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉后，取仰卧位，手术区备皮、消毒，在大白兔双侧股骨远端后内侧切口，暴露大白兔股骨内侧髁，取内侧髁上1.5cm处作为钻孔点，用钻头(直径4mm)钻取深度10mm左右，钻孔过程中避免钻透，生理盐水冲洗骨屑，植入骨支架复合体，缝合切口，术后青霉素预防感染3d。分组及处理：将植入骨支架复合体后的36只大白兔根据随机数字法分为对照组和实验组，每组18只；植入骨支架复合体的同时，实验组大白兔经股静脉注入分离培养的bmscs1.5ml(1×109个细胞/l)，对照组大白兔经静脉注入等量生理盐水；术后4周、8周、12周每组分别处死6只；按上述方法于股骨髁上结节处行骨髓穿刺抽取骨髓，分离和培养bmscs，用于bmscs迁移数测定和bmscsⅰ型胶原蛋白、cd44水平测定；然后取兔双侧股骨髁处标本，一侧股骨髁处标本用于影像学检查和骨痂神经生长因子水平测定，一侧股骨髁处标本用于van-gieson染色。3检测结果3.1影像学检查：分别将上述取出的术后4周、8周、12周股骨髁处标本摄x线片，检查结果如图4所示；由图4可知，第4周，对照组复合骨支架和两端股骨界面清晰，无骨痂包绕，实验组复合骨支架和两端股骨界面模糊，骨支架旁侧有少量骨痂生长；第8周，复合骨支架和两端股骨界面模糊，骨支架旁侧有少量骨痂生成，观察组复合骨支架和两端股骨界面模糊，骨支架旁侧有较多骨痂生长；第12周，对照组复合骨支架和两端股骨界面处有大量骨痂包裹，实验组复合骨支架周围完全被新生的骨痂组织包裹。3.2组织学观察：将术后4周、8周、12周取出的股骨髁浸泡在中性甲醛中，7d后取出，不进行脱钙，梯度酒精脱水，置于包埋液中包埋，3周后通过硬组织切片机沿股骨长轴切呈4.5μm厚切片，采用van-gieson染色观察组织学变化：石蜡切片脱蜡后用weigert苏木素染色20min，返蓝5min，用van-gieson染色1min，弃van-gieson染色液，酒精分化数秒，脱水、透明、封固，光学显微镜下100倍下观察股骨髁组织学变化；观察结果如图5所示；由图5可知：第4周，实验组骨支架和新生骨结合较紧密，骨支架边缘部分降解，对照组骨支架和新生骨界限明显，骨支架无明显降解；第8周，实验组骨支架和新生骨交界被新生骨小梁包绕，骨支架进一步降解，新生骨小梁沿骨支架降解形成的空隙向骨支架内部生长，对照组骨支架边缘部分降解，有少量新生骨小梁；第12周，实验组骨支架中央降解形成空隙，新生骨小梁沿骨支架降解空隙继续长入，对照组新生骨小梁少，骨支架降解缓慢，骨小梁长入骨支架空隙的范围比较局限。3.3bmscs迁移数测定：将抽取的术后4周、8周、12周骨髓按照上述方法再次分离培养bmscs采用transwell小室测定bmscs迁移能力：将6孔transwell小室的上室加入第2代bmscs悬液(2×105个细胞)，置入培养箱中培养24h，取出transwell小室，弃去培养液，甲醇进行固定，结晶紫法进行染色，棉签擦掉未迁移细胞，倒置相差显微镜下观察侵袭bmscs细胞数，观察结果如图6所示，bmscs细胞数统计结果如表2所示，统计学方法采用spss20.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，对照组和观察组之间各指标比较采用t检验，取p<0.05为差异有统计学意义；表2两组大白兔bmscs迁移细胞数比较(n＝6，±s)注：*为与对照组相比较p＜0.05。由图6和表2可知，第4周、8周、12周时，实验组大白兔bmscs迁移细胞数均高于对照组(p<0.05)。3.4bmscsⅰ型胶原蛋白、cd44水平测定：取术后4周、8周、12周分离培养的第2代bmscs；用trizol法提取bmscs总rna，总rna反转录呈cdna，采用q-rtpcr法测定bmscsⅰ型胶原蛋白、cd44mrna水平，以β-actin为内参照；ⅰ型胶原蛋白、cd44mrna表达量以2-δδct表示；测定统计结果如表3所示；统计学方法采用spss20.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，对照组和观察组之间各指标比较采用t检验，取p<0.05为差异有统计学意义；表3两组大白兔bmscsⅰ型胶原蛋白、cd44水平比较(n＝6，±s)注：*为与对照组相比较p＜0.05。由表3可知，第4周、8周、12周时，实验组大白兔bmscsⅰ型胶原蛋白、cd44mrna水平均高于对照组(p<0.05)。3.5骨痂神经生长因子水平测定：取术后4周、8周、12周大白兔骨痂，多聚甲醛固定，石蜡切片，采用免疫组化法测定骨痂神经生长因子水平：将石蜡切片进行免疫组化染色，以兔抗鼠神经生长因子(1：100)为一抗，以羊抗兔igg(1：1000)为二抗，dab显色，显微镜下观察神经生长因子表达情况，观察结果如图7所示，采用image-proplus6.0软件分析吸光度，神经生长因子水平以吸光度值表示；分析结果如表4所示，统计学方法采用spss20.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，对照组和观察组之间各指标比较采用t检验，取p<0.05为差异有统计学意义；表4两组大白兔骨痂神经生长因子水平比较(n＝6，±s)注：*为与对照组相比较p＜0.05。由图7和表4可知，第4周、8周、12周时，实验组大白兔骨痂神经生长因子水平均高于对照组(p<0.05)。4结论本发明制备得到骨支架复合体可促进骨缺损处骨痂形成和修复效果，可促进bmscs迁移能力，提高ⅰ型胶原蛋白、cd44水平，提高骨痂中神经生长因子水平；综上所述，本发明骨支架复合体能够通过促进bmscs成骨分化、增加神经生长因子水平促进骨缺损的修复。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12