一种治疗鸡肾肿湿热症的中药组合物及制备方法和应用与流程

本发明涉及一种兽药领域，尤其涉及一种治疗鸡肾肿湿热症的中药组合物。

背景技术：

鸡肾脏疾病由多种疾病或致病因子引起，包括肾炎、肾结石、痛风症、输尿管结石、尿毒症等，其共同特征是肾脏肿胀、肾小管和输尿管出现尿酸盐沉淀，严重时可导致鸡群死亡。近年来随着环境中各种病原体感染压力的逐渐增加，以肾肿为重要临床表现的疾病逐渐增多，给养鸡业造成严重经济损失，严重影响了养鸡业的发展。

湿热是导致肾病病情持续进展和反复发作的重要因素。中国中医研究院时振声教授认为，湿热郁滞是肾病的主要病机，肾病湿热证是最常见的证型。不同日龄的鸡均可发生肾脏疾病，病鸡表现精神萎靡、羽毛蓬乱、低头嗜睡、拉白色稀粪或呈水样状、肛门周围被粪便污染。鸡体消瘦，雏鸡生长发育缓慢，产蛋鸡群产蛋下降，畸形蛋增多。肾型支气管炎引起的多，病程较长，死亡率不等，发病者最终以死亡结束。传染性法氏囊病引起的肾病，病程短，发病率高，死亡率高达30-50％。给养鸡业造成不同程度的经济损失。鸡肾肿湿热证是现代养鸡业中鸡死亡的主要疾病之一。鸡群一旦发生肾肿症，死亡率将会逐步提高，特别是当其他疾病伴随着肾肿症发生时，其死亡率将会增加l倍以上。

目前，据临诊症状及剖检病变程度，临床多选用抗菌类药(如氟苄青霉素、羟氨苄青霉素、喹诺酮类的诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星等)；维生素c粉剂或水溶剂，浓鱼肝油水剂或浓鱼肝油粉剂，或用商品营养添加剂速补-14和利尿剂如肾肿解毒药、肾肿解毒灵等。但是有些药物如磺胺类，氨基糖苷类，头孢菌素类等在体内通过肾脏排泄，对肾脏有潜在的毒性作用，若长时间，大剂量使用容易造成肾脏损伤。反而加剧病情发展。且多数“肾肿解毒”药不但有利尿作用同时有脱水的副作用。该类药品使用后，鸡群粪便稀薄、垫料潮湿，时间稍长鸡群便开始脱水、电解质紊乱而死亡，如不停药，死亡将不能结束，而且情况会越来越严重。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有清热利湿，健脾化浊的功效，主要治疗湿热及饲料蛋白质含量过高引起的鸡肾肿湿热证的治疗鸡肾肿湿热症的中药组合物。

本发明是通过如下措施实现的：

一种治疗鸡肾肿湿热症的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下重量份的原料组成：土茯苓0.1-10份、白茅根0.1-10份、槐花0.1-10份、益母草0.1-10份、广藿香0.1-10份、泽泻0.1-10份、白术0.1-10份(每份重量为100g)。

本发明的具体特点还有：

所述中药组合物由以下重量份的原料组成:土茯苓3.66份、白茅根3.66份、槐花0.93份、益母草0.93份、广藿香0.28份、泽泻0.28份、白术0.26份。

所述中药组合物由以下重量份的原料组成：土茯苓3.74份，白茅根3.74份，槐花0.83份，益母草0.83份，广藿香0.30份、泽泻0.29份、白术0.27份。

所述中药组合物由以下重量份的原料组成：土茯苓3.81份，白茅根3.81份，槐花0.74份，益母草0.74份，广藿香0.32份、泽泻0.3份、白术0.28份。

所述中药组合物是按如下方法制成的：

①取土茯苓加20％～90％乙醇回流提取两次，每次15～120分钟，合并两次得到的提取液，并进行过滤，最后回收乙醇；

②取槐花、益母草、白茅根、泽泻、白术加水提取三次，每次15～120分钟，合并三次所得到的提取液，进行过滤；

③将步骤①与步骤②中最终得到的提取液合并并浓缩至相对密度约1.06(60℃)，将浓缩后的提取液进行喷干，得到喷干粉；

④取广藿香，将广藿香粉碎至80～200目，得到广藿香细粉，将步骤③得到的喷干粉与广藿香细粉混合并加入常规药用辅料，制备成所需剂型。

所述中药组合物被制成片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂中的任一种。

所述泡腾颗粒剂的制备方法为：

①取土茯苓加60％乙醇回流提取两次，每次60分钟，合并两次得到的提取液，并进行过滤，最后回收乙醇。

②取槐花、益母草、白茅根、泽泻、白术加水提取两次，每次90分钟，合并两次所得到的提取液，进行过滤。

③将步骤①与步骤②中最终得到的提取液合并得到总提取液，使用减压浓缩方式将总提取液浓缩至相对密度约1.06(60℃)，然后将浓缩后的总提取液采用喷雾干燥的方式进行喷干，得到喷干粉。

④取广藿香，将广藿香粉碎至100目，得到广藿香细粉，然后适量nahco3加入适量熔融的peg6000中，搅拌均匀，放冷，碎粉过筛，然后加入步骤③中的喷干粉、枸橼酸、糊精、蔗糖，再加入乙醇制粒即得泡腾颗粒剂。

⑤对步骤④中制备的泡腾颗粒剂进行检测。

所述步骤⑤中的检测方法为：

s1、制备对照品溶液：取适量落新妇苷对照品、芦丁对照品，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含落新妇苷50μg、芦丁100μg的混合溶液，得到对照品溶液；

s2、制备待检测药液：取适量所述步骤④中制备的泡腾颗粒剂并研磨成细粉1.0g，精密称定，倒入具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到待检测药液；

s3、分别精密量取步骤s1制备的对照品溶液和步骤s2制备的待检测药液各10μl，注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法对对照品溶液和待检测药液中的落新妇苷和芦丁进行含量测定，进行对比

所述步骤④中，所述nahco3和所述peg6000质量比例为1:0.8，所述nahco3所述枸橼酸质量比例为1:1.25，所述糊精和所述蔗糖溶液质量比例为1:1。

所述中药组合物在制备用于治疗鸡肾肿湿热症的药物中的应用。

本发明的有益效果为：清热利湿，健脾化浊的功效，主要治疗湿热及饲料蛋白质含量过高引起的鸡肾肿湿热证，按中兽医理论，肾肿症属于湿热症，湿热结于下焦，使尿路不利，尿频涩痛，甚则闭而不通，治则以清热利水通淋为主。本发明中药组合物以土茯苓等君药，取其通经透络、解毒除湿的功效,配以白茅根、槐花、泽泻、白术以凉血止血，清热利尿，益母草以活血化瘀，广藿香芳香化浊，和中止呕，发表解暑，醒脾健胃。

附图说明

图1为本发明说明书实验二中落新妇苷和芦丁的混合标准品(上图为落新妇苷291nm检测，下图为芦丁257nm检测)图谱。

图2为本发明说明书中土茯苓阴性样品的图谱。

图3为本发明说明书实验二中槐花阴性样品的图谱。

图4为本发明说明书实验二中落新妇苷的标准曲线图。

图5为本发明说明书实验二中芦丁的标准曲线。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1：

原料组成：土茯苓366g，白茅根366g，槐花93g，益母草93g，广藿香28g、泽泻28g、白术26g。

制备方法：

①取土茯苓366g加8倍量60％乙醇回流提取两次，每次60分钟，合并两次得到的提取液，并进行过滤，最后回收乙醇；

②取槐花93g、益母草93g、白茅根366g、泽泻28g、白术26g加8倍量水提取两次，每次60分钟，合并两次所得到的提取液，进行过滤；

③将步骤①与步骤②中最终得到的提取液合并得到总提取液，使用减压浓缩方式将总提取液浓缩至相对密度约1.06(60℃)，然后将浓缩后的总提取液采用喷雾干燥的方式进行喷干，得到喷干粉；

④取广藿香28g，将广藿香粉碎至100目，得到广藿香细粉，然后将100gnahco3加入80g熔融的peg6000中，搅拌均匀，放冷，碎粉过筛，然后加入步骤③中的喷干粉、125g枸橼酸、糊精、蔗糖，补足1000g，再加入乙醇制粒即得泡腾颗粒剂；

⑤对步骤④中制备的泡腾颗粒剂进行检测。

步骤⑤中检测方法：

s1、制备对照品溶液：取适量落新妇苷对照品、芦丁对照品，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含落新妇苷50μg、芦丁100μg的混合溶液，得到对照品溶液；

s2、制备待检测药液：取适量所述步骤④中制备的泡腾颗粒剂并研磨成细粉1.0g，精密称定，倒入具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到待检测药液；

s3、分别依次精密量取步骤s1制备的对照品溶液和步骤s2制备的待检测药液各10μl，注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法对对照品溶液和待检测药液中的落新妇苷和芦丁进行含量测定，进行对比。

结果：每克本发明中药中落新妇苷的含量为1.56mg，芦丁的含量为5.28mg。

本试验制备的治疗鸡肾肿湿热证的中药在存放24个月期间，在外观性状、鉴别、检查、含量各项检查指标均无明显变化，符合临床前药品质量标准的各项规定，质量基本稳定。

实施例2：

原料组成：土茯苓374g，白茅根374g，槐花83g，益母草83g，广藿香30g、泽泻29g、白术27g。

制备制法：①取土茯苓374g加8倍量60％乙醇回流提取两次，每次60分钟，合并两次得到的提取液，并进行过滤，最后回收乙醇；

②取槐花83g、益母草83g、白茅根374g、泽泻29g、白术27g加8倍量水提取两次，每次60分钟，合并两次所得到的提取液，进行过滤；

③将步骤①与步骤②中最终得到的提取液合并得到总提取液，使用减压浓缩方式将总提取液浓缩至相对密度约1.06(60℃)，然后将浓缩后的总提取液采用喷雾干燥的方式进行喷干，得到喷干粉；

④取广藿香30g，将广藿香粉粉碎至100目，得到广藿香细粉，然后将100gnahco3加入80g熔融的peg6000中，搅拌均匀，放冷，碎粉过筛，然后加入步骤③中的喷干粉、125g枸橼酸、糊精、蔗糖，补足1000g，再加入乙醇制粒即得泡腾颗粒剂；

⑤对步骤④中制备的泡腾颗粒剂进行检测。

步骤⑤中检测方法：

s1、制备对照品溶液：取适量落新妇苷对照品、芦丁对照品，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含落新妇苷50μg、芦丁100μg的混合溶液，得到对照品溶液；

s2、制备待检测药液：取适量所述步骤④中制备的泡腾颗粒剂并研磨成细粉1.0g，精密称定，倒入具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到待检测药液；

s3、分别依次精密量取步骤s1制备的对照品溶液和步骤s2制备的待检测药液各10μl，注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法对对照品溶液和待检测药液中的落新妇苷和芦丁进行含量测定，进行对比。

结果：每克本发明中药中落新妇苷的含量为1.63mg，芦丁的含量为5.48mg。

实施例3：

原料组成：土茯苓381g，白茅根381g，槐花74g，益母草74g，广藿香32g、泽泻30g、白术28g。

制备制法：

①取土茯苓381g加8倍量60％乙醇回流提取两次，每次60分钟，合并两次得到的提取液，并进行过滤，最后回收乙醇；

②取槐花74g、益母草74g、白茅根381g、泽泻30g、白术28g加8倍量水提取两次，每次60分钟，合并两次所得到的提取液，进行过滤；

③将步骤①与步骤②中最终得到的提取液合并得到总提取液，使用减压浓缩方式将总提取液浓缩至相对密度约1.06(60℃)，然后将浓缩后的总提取液采用喷雾干燥的方式进行喷干，得到喷干粉；

④取广藿香，将广藿香粉32g粉碎至100目，得到广藿香细粉，然后将100gnahco3加入80g熔融的peg6000中，搅拌均匀，放冷，碎粉过筛，然后加入步骤③中的喷干粉、125g枸橼酸、糊精、蔗糖，补足1000g，再加入乙醇制粒即得泡腾颗粒剂；

⑤对步骤④中制备的泡腾颗粒剂进行检测。

步骤⑤中检测方法：

s1、制备对照品溶液：取适量落新妇苷对照品、芦丁对照品，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含落新妇苷50μg、芦丁100μg的混合溶液，得到对照品溶液；

s2、制备待检测药液：取适量所述步骤④中制备的泡腾颗粒剂并研磨成细粉1.0g，精密称定，倒入具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到待检测药液；

s3、分别依次精密量取步骤s1制备的对照品溶液和步骤s2制备的待检测药液各10μl，注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法对对照品溶液和待检测药液中的落新妇苷和芦丁进行含量测定，进行对比。

结果：每克本发明中药中落新妇苷的含量为1.72mg，芦丁的含量为5.47mg。

本发明药物的发明人在原料药的选择、制备方法及其应用方面，进行了一系列实验研究，确定了制备本发明药物的原料药和制备方法，使其与现有技术相比具有明显的突出疗效优势。

实验一、药效临床试验

步骤一、肾损伤造模方法的建立

1、材料

试验动物：1日龄三黄肉鸡。

饲料标准：基础日粮参照npc，1998年中国肉鸡饲料标准配制的粉料。

2、试验方法

取正常饲养至11日龄健康雏鸡100只，称重后随机分成5组，分别喂予按每千克饲料拌料添加复方新诺明0.0、1.0、2.0、3.0和4.0克的肉鸡全价饲料，给药后每天观察雏鸡的精神、食欲、饮水、排便、运动等，连续给药至7天时，所有给药的4组鸡只表现为精神沉郁、采食量下降，拉水样稀便，有部分鸡只出现石灰样便。至此，停止试验，分别称重，统计各组的日均增重、日均采食量、料重比，并剖检观察心、肝、脾、肾、肺等器官的组织病理变化和称量统计脏器指数(脏器湿重/活体重×100)。

3、试验结果

3.1、临床症状

在连续给药7天后，通过拌料添加1‰～4‰复方新诺明的4组都出现了不同程度的精神沉郁、采食量下降及水样拉稀，其中添加3‰、4‰剂量组的鸡症状最为明显，大部分鸡只出现了消瘦、拉白色石灰样稀粪。

3.2、生长性能及脏器指数

表1给复方新诺明7d各组鸡的生长性能及脏器指数n＝20

注：同行数据上标字母相邻者差异显著(p<0.05)。

由表1数据可以看出，在饲料中添加3‰、4‰smz组鸡的日均增重显著低于阴性对照组，而料重比则显著高于阴性对照组；所有添加smz的用药组肾脏系数均大于阴性对照组，但添加3‰、4‰smz组则显著大于阴性对照组和添加1‰、2‰smz组。表明在饲料中添加3‰、4‰smz连用7天便造成肾肿性损伤和影响增重等生长指标。

3.3、剖检病变

与阴性对照组鸡只相比，添加1‰、2‰smz组鸡只肾脏稍肿胀，呈苍白色；添加3‰、4‰smz组鸡只肾脏明显肿胀，苍白，部分呈花斑肾样。

3.4、肾脏组织切片观察

阴性对照组肾小球结构正常，肾小球囊腔明显，肾小囊壁层和肾小管细胞结构清楚，细胞界限较清晰，添加3‰、4‰smz组鸡只肾脏大多数肾小球肿胀，肾小球囊腔扩大，部分肾小体、肾小管肿胀破裂，呈现缩小、萎缩状，有的肾小体内可见淋巴细胞浸润。而添加1‰、2‰smz组鸡只肾脏病变则不十分明显。

步骤二、治疗鸡肾损伤的实验临床试验

1、材料

1.1、试药：本发明中药组合物泡腾颗粒剂。

1.2、对照药物：苍蓝口服液。

1.3、试验动物：1日龄三黄肉鸡。

1.4、饲料标准：基础日粮参照npc－1998年中国肉鸡饲料标准配制的粉料。

2、试验方法

2.1、鸡肾损伤造模

购1日龄三黄肉鸡600只，正常饲养至18日，随机分出90只作为阴性对照组(每组30只，3个重复)不作任何处理单独饲养；其余510只采用基础日粮中按每千克饲料拌料添加复方新诺明(smz)3.0g(此添加剂量是参照肾损伤造模方法的建立实验结果而确定)，连续饲喂的肾损伤造模方法进行人工造模。结果连续饲喂添加3‰smz的饲料至7天时，整个鸡群出现精神沉郁，饮食欲不振，采食量明显下降，拉白色石灰水样稀粪。截止第7天24:00时，整个鸡群死亡13只，取死亡鸡和精神极度沉郁鸡17只剖检观察发现，肾脏明显肿胀，多数呈苍白色花斑样；采集部分明显肿胀肾脏作冰冻切片观察显示，大多数肾小球肿胀，肾小球囊腔扩大，部分肾小管细胞排列紊乱、小管破裂。据此，结合肾损伤造模方法的建立实验结果，认为此批510只鸡的肾损伤造模成功。剔除死亡和精神极度沉郁鸡只后，从中挑选出450只人工造模性肾损伤患病鸡用于后续治疗试验。

2.2、治疗试验

将上述模成功的450只鸡按体重随机分为5个处理组(包括ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ组)，每组30只(设3个重复)。ⅱ组为阳性药物对照组，苍蓝口服液混饮2.0ml/l；ⅲ、ⅳ、ⅴ依次为实施例一原料配比的泡腾颗粒剂低、中、高剂量(剂量依次为：0.5g/l、1.0g/l、2.0g/l)组(1.0g/l为每升水中混有药品1.0g)，全天混饮给药；ⅵ组为阳性对照组，不药物治疗处理。于造模成功后的第二天(即26日龄)开始给药，连续用药5天。另外，ⅰ组为阴性对照组，90只不做任何处理的鸡。试验期从26日龄起观察至35日龄止，共10天。

2.3测试指标及疗效判定

整个试验期对各组鸡整体状况进行逐日观察记录精神状况、采食量及粪便情况。试验观察期结束，分别称重，统计各组的日均增重、日均采食量、料重比，并剖检观察心、肝、脾、肺、尤其是肾等器官的组织病理变化和称量统计肾脏指数(肾脏湿重/活体重×100)。并按下列标准判定疗效：

治愈：鸡只精神、食欲、粪便恢复正常；剖检观察心、肝、脾、肺、肾等脏器无肉眼观察病变，且肾脏指数≤1.10。

显效：鸡只精神、食欲、粪便基本恢复正常；剖检观察心、肝、脾、肺、肾等脏器无明显肉眼观察病变，且1.10＜肾脏指数≤1.20。

有效：鸡只精神、食欲基本恢复正常，但仍然拉稀粪；剖检观察心、肝、脾、肺、无明显肉眼观察病变，但肾脏仍有轻度肿胀，且1.20＜肾脏指数≤1.30。

无效：鸡只精神沉郁，食欲不振，拉白色石灰样或严重水样稀粪；剖检观察肾脏明显肿胀，或呈花斑肾样，且肾脏指数＞1.30。

3.临床实验结果

3.1、各组临床症状观察结果

26日龄时，ⅱ～ⅵ组实验鸡表现采食量减少、精神沉郁、拉水样或石灰样稀粪。经过5日的治疗试验后(30日龄时)，“泡腾颗粒剂”中、高剂量组和阳性药物对照组鸡群精神状态有了明显改善，水样稀粪明显减少，白色石灰样稀粪消失；低剂量组鸡群精神状态也有所改善，水样稀粪现象仍然严重，少数鸡只仍然拉白色石灰样稀粪。至35日龄时，中高剂量组和阳性药物对照组精神状态完全恢复，粪便也基本正常；低剂量组精神状态基本恢复，但仍然有部分鸡只拉水样稀粪。ⅵ组即阳性对照组鸡群至观察期结束仍有约50％的鸡只精神沉郁，食欲不振，约70％拉白色石灰样或水样稀粪。ⅰ组即阴性对照组鸡群观察期精神、食欲和粪便完全正常。从26日龄至35日龄整个观察期内，ⅰ～ⅵ组实验鸡群均没有出现死亡。

3.2、生长性能及肾脏指数观察结果

表2各组鸡的生长性能及肾脏指数n＝30

注：同行数据上标字母相邻者差异显著(p<0.05)。

3.3、治疗观察结果

至试验观察期结束，各组每只鸡通过观察肛门周围羽毛，判定是否拉稀；并扑杀剖检观察内脏器官组织病变。结果显示：ⅰ组所有鸡只肛门周围羽毛洁净，无拉稀现象；剖检内脏均无肉眼观察病变。ⅱ、ⅳ、ⅴ组即阳性药物对照组和泡腾颗粒剂中、高剂量组均只有约10～15％鸡只肛门周围羽毛潮湿，呈轻度水样拉稀状；剖检观察心、肝、脾、肺内脏均无肉眼观察病变，仅有约10％鸡只肾脏轻度肿胀。ⅲ组即泡腾颗粒剂低剂量组有约50％鸡只肛门周围羽毛潮湿，其中约20％鸡只羽毛污秽不清；剖检观察约20％鸡只肾脏轻度肿胀，20％鸡只肾脏中度肿胀。ⅵ组即阳性对照组仅有约25～30％鸡只肛门周围羽毛干燥清洁，即约有70％的鸡只仍有拉稀现象；剖检观察约40％鸡只肾脏明显肿胀，约30％鸡只肾脏轻度肿胀。详细数据及疗效结果见表3。

表3疗效观察结果

注：同行数据上标字母相邻者差异显著(p<0.05)。

4、结论

泡腾颗粒剂按1.0g/l、2.0g/l全天混饮给药，连用5天，均能有效治疗药物导致的肾损伤，总有效率要高于对照药物苍蓝口服液，达96.7％，因此，本次泡腾颗粒剂治疗肾损伤的临床疗效试验的推荐剂量是：泡腾颗粒剂1.0g/l，连用5天，且效果优于对照药物苍蓝口服液。

实验二、本发明中药组合物制备工艺研究

1、仪器与试剂

高效液相色谱仪(hitachi泵l-2130，检测器l-2400；agilent1200四元低压梯度泵，vwd检测器)，鼓风干燥箱、数显鼓风干燥箱gzx-9146mbe，真空干燥箱dzf-6050型、喷雾干燥sy-6000、颗粒剂wk-60型，芦丁对照品(100080-201409，含量为92.6％，中国食品药品检定研究院)；落新妇苷对照品(批号111798-201504，纯度93.9％，中国食品药品检定研究院)；所用试剂除甲醇、乙腈为色谱纯外，其余试剂为分析纯；娃哈哈纯净水。

2、方法

2.1不同提取方法比较

设计了以下3种提取方法，以落新妇苷和芦丁的转移率为考察指标。

采用的提取工艺如下：

工艺1：土茯苓、白茅根、益母草、槐花、泽泻、白术六味药材，按处方比例投药，加10倍量水煎煮2次，每次1h，合并滤液，浓缩至每毫升含药材约0.25g；

工艺2：土茯苓10倍量60％乙醇回流提取2次，槐花、白茅根、益母草、泽泻、白术10倍量水煎煮2次，每次1h，合并滤液，浓缩至每毫升含药材约0.25g。

工艺3：槐花和土茯苓10倍量60％乙醇回流提取2次，白茅根、益母草、泽泻、白术10倍量水煎煮2次，每次1h，合并滤液，浓缩至每毫升含药材约0.25g。

含量测定方法按照兽药典土茯苓药材的方法，即：

高效液相色谱法测定：c18色谱柱；流动相：甲醇/1％醋酸(31：69)；检测波长：291nm(落新妇苷)，257nm(芦丁)。

将提取浓缩液摇匀，精密量取1ml至50ml容量瓶中，加60％甲醇定容，高效液相色谱法测定，进样量10ul，记录落新妇苷和芦丁的峰面积；

按照药典土茯苓和槐花的含量测定方法测定得到土茯苓中落新妇苷的含量为1.11％；槐花中芦丁的含量为6.92％。

计算不同工艺提取落新妇苷和芦丁的转移率，见表4。

表4提取工艺比较

从表4中可以看出，为了保证土茯苓及槐花中有效成分的转移率，土茯苓选择醇提工艺，槐花、白茅根、益母草、泽泻和白术选择水提工艺。

土茯苓醇提工艺：

取土茯苓药材，粉碎过10目筛，混合均匀，分别称取50g(尽量保证取样均匀)，按照正交设计表的条件进行提取，提取液过滤，滤液合并浓缩回收乙醇，最后均定容至100ml。含量测定方法按照兽药典土茯苓药材的方法，即：

高效液相色谱法测定：c18色谱柱；流动相：甲醇/1％醋酸(31：69)；检测波长：291nm。将提取浓缩液摇匀，精密量取1ml至50ml容量瓶中，加60％甲醇定容，过滤，测定，计算浓缩液有效成分落新妇苷的浓度及转移率，结果见下表5。

表5土茯苓提取的因素水平表

表6正交设计及直观分析表(结合表5数值)

表7方差分析表p＝0.05

从表6和7中结果可以看出，四个因素对落新妇苷的提取率影响大小顺序为：提取次数>乙醇浓度>提取时间>液固比。

从表7方差分析表可以看出，乙醇浓度和提取次数对提取率具有显著性影响。

从表5中可以看出，提取次数的最高水平为3次，60％和70％乙醇提取效果差异不大，提取时间的最高水平为90min，液固比的最高水平为12。

结合表5、表6和表7，从提取效率及成本角度考虑，选土茯苓提取工艺为：60％乙醇提取，液固比8，提取时间60min，提取次数为2次。

槐花、益母草、白茅根、泽泻和白术的水提取工艺：

影响水煎煮工艺的主要参数包括加水量、提取时间、提取次数等，采用l9(3⁴)正交试验优选提取工艺参数，以液固比、提取时间、提取次数为考察因素以芦丁含量为考察指标，设定以下的正交试验。

关于加水量，一般来说：根茎用药一般用药材量的8倍，叶花及全草用药一般用药材量的12倍，白茅根、白术、泽泻属于根类，槐花、益母草属于后者。提取时间：一般至少提取60min-120min，提取次数为1-3次。

取槐花9.3g、白茅根36.6g、益母草9.3g、泽泻2.8g、白术2.6g按照下述正交表经提取、浓缩至250ml，测定芦丁的含量。

含量测定方法为：

高效液相色谱法测定：c18色谱柱；流动相：甲醇/1％醋酸(35：65)；检测波长：257nm。将上述提取浓缩液摇匀，精密量取1ml至50ml容量瓶中，加50％甲醇定容，过滤，测定，计算浓缩液芦丁的浓度，计算芦丁的转移率，取定量烘干测定浸膏得率，按照芦丁转移率和浸膏得率均占50％权重计算，参见表9。

表8因素水平表

表9槐花、白茅根、益母草、泽泻和白术水提工艺直观分析表(结合表8数值)

表10槐花、白茅根、益母草、泽泻和白术水提工艺方差分析表

a＝0.05

以芦丁含量为评价指标时，各因素对提取效果的影响程度依次为c>a>b，即，提取次数>液固比>提取时间，方差分析表表明，提取次数具有显著性差异，直观分析表中可以看出，提取2次和提取3次差别不大，从节约成本、提高效率的角度考虑，确定最佳提取工艺为：a1b1c2，即，液固比8，提取时间60min，提取次数2次。

2.4提取液浓缩干燥方式的考察

减压浓缩和常压浓缩有效成分落新妇苷和芦丁的转移率相差不大。减压浓缩浓缩效率高，温度低且恒定，因此选择减压浓缩方式。

干燥工艺分别考察了鼓风干燥、减压干燥和喷雾干燥三种干燥方式。将提取液浓缩至相对密度1.06(60℃)，取出20ml留样待测，剩余样品平均分成4份，分别进行鼓风干燥(2份)、减压干燥和喷雾干燥，记录干燥耗时，采用干燥失重法测定干膏水分含量，以干燥前的浓缩液为参考，计算有效成分损失情况。

鼓风干燥(1)：采用gzx-9146mbe数显鼓风干燥箱，温度80℃，时间约6h；鼓风干燥(2)：采用gzx-9146mbe数显鼓风干燥箱，温度95℃，时间12h；减压干燥：采用dzf-6050型真空干燥箱，50℃，加五氧化二磷吸水，时间约4h；喷雾干燥：采用sy-6000实验室喷雾干燥机，进风温度170℃。

表11干燥工艺考察表

从上表11可以看出，干燥方式是影响有效成分含量的关键步骤，鼓风干燥和减压干燥两种干燥方式耗时较长，且有效成分损失较高，实践证明：温度越高时间越长，有效成分损失就越大。喷雾干燥使提取浓缩液经雾化后，再与热空气接触，水分迅速汽化得到干燥产品，试验证实，其有效成分得到最大程度的保留。

2.5制剂的制备

泡腾制剂是以适宜的酸和碱为崩解剂制成的一种剂型，常制备成片剂或颗粒剂。因入水后会产生大量二氧化碳气体而使制剂更容易溶解，本品制备成泡腾颗粒剂可以避免养殖场大量使用时因搅拌不均导致本品溶解不彻底。

酸碱对的选择：泡腾崩解剂酸碱配对可选用：枸橼酸和nahco3；酒石酸和nahco3；枸橼酸和na2co3；酒石酸和na2co3；枸橼酸，酒石酸和nahco3；枸橼酸，酒石酸和na2co3等多个系列；其中，枸橼酸是强有机酸，且口感较好，nahco3与na2co3对比产生同样的气体所用的质量少，因此碱选择nahco3。文献报道在枸橼酸和nahco3的比例为1-1.5：1时效果较好。

peg6000的选择与用量：由于泡腾颗粒剂中的酸源和碱源在制备和存放过程中遇水会生成二氧化碳，碱的口感差故将其中的碱源用peg6000熔融包合，经预实验确定peg6000与nahco3的配比范围为0.8-1.2。

润湿剂的选择：直接选用乙醇作为润湿剂，以防止酸碱遇水生成二氧化碳。

填充剂及矫味剂：选择糊精和蔗糖。

处方工艺：将nahco3用peg6000熔融包合，混匀，冷却，粉碎，过筛后，加入至喷干后的提取物粉中，再加入适量的枸橼酸、糊精和蔗糖适量，加乙醇作为润湿剂制粒，干燥即得。

正交试验优化处方工艺，表12正交实验因素水平表如下。以颗粒收得率、泡腾时间为考察指标。颗粒收得率越高评分越高，以收得率最高的为100分，泡腾时间指的是10g颗粒完全分散至200ml水中的时间，时间越短评分越高，时间最短者记100分。颗粒收得率和泡腾时间权重分别占50％，即综合评分＝(颗粒收得率得分+泡腾时间得分)/2。以综合评分进行直观分析和方差分析，得到直观分析表和方差分析表。

表12正交实验因素水平表

表13实验设计及直观分析表(结合表12数值)

表14方差分析表

由直观分析表13可以看出3个因素对本品颗粒收得率和泡腾时间的影响顺序是a>c>b，即peg6000与nahco3的比值影响最大，其次是糊精和蔗糖的比值，最后是酸碱比值。peg6000与nahco3的比值的最佳水平是0.8，酸碱比值的最佳水平是1.25，糊精蔗糖比值的最佳水平是1。

由方差分析表14可以看出，peg6000/nahco3对结果具有显著性影响。综上，得到本品的最佳泡腾颗粒制备工艺为100g的nahco3加入80g熔融的peg6000中，搅拌均匀，放冷，碎粉过筛，再加入提取物粉、125g的枸橼酸，糊精：蔗糖(1：1)补足1000g，加乙醇制粒即得。

实验三、本发明中药组合物含量测定

1、仪器与试剂

agilent1260高效液相色谱仪(g1311c四元泵，g1329b自动进样仪，g1316a柱温箱，g4212b二极管阵列检测器，agilent化学工作站)；agilent1200高效液相色谱仪(配备g1322a脱气机，g1311a四元泵，g1329a自动进样仪，g1315d二极管阵列检测器，agilent化学工作站)。

落新妇苷(批号110713111798-201504，中国药品生物制品检定所，c21h22o11含量为93.9％计)；芦丁(批号100080-201409，中国药品生物制品检定所，c27h30o16含量为92.6％)；乙腈、甲醇均为色谱纯。

2、含量测定方法

2.1、本发明中药的制备：按如下处方和制备工艺制备本发明中药。

2.1.1、处方：土茯苓366g，白茅根366g，槐花93g，益母草93g，广藿香28g、泽泻28g、白术26g；

2.1.2、制备工艺：

①取土茯苓366g加8倍量60％乙醇回流提取两次，每次60分钟，合并两次得到的提取液，并进行过滤，最后回收乙醇；

②取槐花93g、益母草93g、白茅根366g、泽泻28g、白术26g加8倍量水提取两次，每次60分钟，合并两次所得到的提取液，进行过滤；

③将步骤①与步骤②中最终得到的提取液合并得到总提取液，使用减压浓缩方式将总提取液浓缩至相对密度约1.06(60℃)，然后将浓缩后的总提取液采用喷雾干燥的方式进行喷干，得到喷干粉；

④取广藿香，将广藿香粉碎至100目，得到广藿香细粉，然后将100gnahco3加入80g熔融的peg6000中，搅拌均匀，放冷，碎粉过筛，然后加入步骤③中的喷干粉、125g枸橼酸、糊精、蔗糖，再加入乙醇制粒即得泡腾颗粒剂。

2.2、落新妇苷和芦丁的含量测定

2.2.1、色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相：甲醇-0.1％醋酸溶液(36:64)为流动相，流速：1ml/min，检测波长为257nm和291nm，理论塔板数应不低于4000；

2.2.2、溶液制备

对照品溶液的制备：取落新妇苷和芦丁对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每毫升50μg和100μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品研细的粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

土茯苓阴性样品溶液的制备：取除土茯苓外的其余处方的药材按照制备工艺制备成缺土茯苓的阴性样品，同法制成缺土茯苓的阴性样品溶液。

槐花阴性样品溶液的制备：取除土茯苓外的其余处方的药材按照制备工艺制备成缺土茯苓的阴性样品，同法制成缺土茯苓的阴性样品溶液。

2.2.3、检测方法

分别精密量取上述对照品、阴性样品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进行检测，结果如附图1所示。

在该色谱条件下，参见附图3槐花阴性样品的图谱中，在与供试品的图谱中芦丁峰位置上无干扰；参见附图2土茯苓阴性样品的图谱中，在供试品的图谱中落新妇苷峰位置上无干扰。本发明采用同一个色谱条件，不同的检测波长，一次进样可同时检测两个主成分，且互不干扰，大大提高的检测效率。

2.2.4、标准曲线的绘制

精密称定落新妇苷和芦丁对照品，置100ml量瓶中，加入60％甲醇溶解后定容至刻度，混匀，得含落新妇苷106.16μg/ml和含芦丁295.49μg/ml的对照品溶液。精密量取上述对照品溶液适量，用60％甲醇稀释，得含落新妇苷5.31μg/ml、10.62μg/ml、16.99μg/ml、21.23μg/ml、42.47μg/ml、106.16μg/ml的系列对照品溶液；含芦丁10.77μg/ml、21.55μg/ml、34.48μg/ml、43.09μg/ml、86.19μg/ml、215.47μg/ml的系列对照品溶液。

取上述系列对照品溶液，按建立的色谱条件进行分析，记录色谱图与峰面积，结果参见附图4和5，以落新妇苷峰面积为纵坐标，落新妇苷的浓度(μg/ml)为横坐标，进行线性回归，得落新妇苷的标准曲线(n＝6)。回归方程：y＝22.863x-12.097，r²＝0.9999。结果：落新妇苷的含量在5.31μg/ml～106.16μg/ml范围内线性关系良好。以芦丁峰面积为纵坐标，芦丁的浓度(μg/ml)为横坐标，进行线性回归，得芦丁的标准曲线(n＝6),回归方程：y＝20.713x-11.719，r²＝1。结果：芦丁的含量在10.77μg/ml～215.47μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.5、精密度

精密吸取同一供试品溶液10μl，重复进样6次，记录色谱图，计算落新妇苷的峰面积平均值为997.803，相对标准偏差为0.25％，计算芦丁峰面积值平均值为2370.825，相对标准偏差为0.16％，表明本发明中药检测方法精密度良好。

2.2.6、重复性

按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液；分别按上述色谱条件进样分析，记录色谱图按标准曲线计算分别以落新妇苷和芦丁的峰面积计算含量。结果：本发明中药落新妇苷和芦丁含量的rsd分别为0.27％和0.51％(n＝6)。表明本发明中药检测方法重复性良好。

2.2.7、稳定性

取同一批号样品按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12h不同时间进样分析，记录色谱图，记录峰面积值，来考察样品的日内稳定性。结果，在12h内，芦丁和落新妇苷的含量基本稳定，按芦丁和落新妇苷峰面积计算，rsd为0.68％和0.71％。表明样品溶液在12小时内稳定。

2.2.8、加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批号本发明中药0.5g，共6份，加入10ml浓度分别为106.16μg/ml和295.49μg/ml的落新妇苷和芦丁的对照品溶液，加60％甲醇定容至50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％醋酸溶液(36:64)为流动相，检测波长为257nm，记录色谱图。

按外标法以落新妇苷和芦丁峰面积计算回收率。结果：落新妇苷的平均回收率为100.39％，rsd为0.64％(n＝6)；芦丁的平均回收率为101.97％，rsd为0.51％。表明本发明中药加样回收率良好。

3、结论

采用高效液相色谱法对本发明中药中的落新妇苷和芦丁进行含量测定，其它成分对测定结果无干扰，方法学考察结果表明线性关系良好，精密度、回收率及重复性均较好，可用于本品的质量控制。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。