非洲猪瘟病毒疫苗及其用途的制作方法

本发明涉及免疫学领域。具体而言，本发明涉及非洲猪瘟疫苗及其用途。更具体的，本发明涉及基于重组腺病毒的疫苗。
背景技术：
：非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其发病率高，死亡率可高达100％，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚确认发生，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2018年，我国已经发现了asf疫情，带来了巨大的直接和间接经济损失。疫苗是预防和治疗asf的重要手段。目前的asfv疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗是指，通过物理或化学手段将asfv灭活而获得的疫苗。灭活使其失去感染能力，但保留其抗原性。迄今为止，采用多种传统方法制备的asf灭活疫苗均不能对强毒攻击提供有效的免疫保护，包括病毒接种肺泡巨噬细胞以及感染脾组织后匀浆制备的灭活疫苗。减毒活疫苗是指用减毒的asfv毒株的活病毒制备的疫苗。减毒的asfv毒株包括：传代减毒毒株、天然减毒毒株和重组减毒毒株。传代减毒毒株是指asfv在猪骨髓来源细胞、vero和cos-1等细胞系传代的过程中致病力逐渐下降而获得的毒株。例如，利用分离株asfv-g在vero细胞中进行传代培养，病毒毒力逐渐衰减，在传至第110代时完全丧失。然而，家猪接种传代减毒的asfv-g毒株后并未获得相应保护力，以抵抗亲本病毒的攻击。此外，有报道接种传代减毒的asfv毒株，家猪呈现出肺炎、流产和死亡等副作用，以及呈现asf慢性感染临床症状。天然减毒毒株是指天然存在的减毒毒株，例如asfvourt88/3或nh/p68毒株。然而，天然减毒毒株免疫动物后可造成诸多副作用，包括肺炎、流产、死亡等。例如，以nh/p68毒株免疫后，25％～47％的猪呈现慢性感染；以ourt88/3免疫后，可导致发热、关节肿胀等症状。重组减毒毒株是指采用分子生物学方法敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因获得的毒株。所述重组降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答，可以用于研制比传统弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程减毒活疫苗。已经报道了asfv毒力基因和免疫抑制基因：tk(k196r)、9gl(b119l)、cd2v(ep402r)、dp148r、nl(dp71l)、uk(dp96r)和多基因家族360和505(mgf360/505)；以及免疫逃逸相关基因a238l、a179l、a224l、dp71l、mgf360/505、i329l、k205r、d96r、dp148r、a276r、d96r和ep153r等。然而，目前还没有提供针对asfv的成功保护的减毒活疫苗。此外，在中国，只允许在少数指定的科研机构内使用asfv活病毒进行研究工作。因此，仍然存在提供新型asfv疫苗，如亚单位疫苗的需要。活载体疫苗是指将病原体的蛋白质编码基因克隆到活病毒载体，然后用于免疫动物，在动物体内表达所述蛋白质，从而诱导针对所述蛋白质的免疫应答。现有技术报道了一些活载体疫苗。例如，cn108504686a和cn108504687a分别提供了表达asfv的ep153r和ep402r基因的重组腺病毒载体。然而，在现阶段不能进行活病毒实验的情况下，需要提供疫苗以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。技术实现要素：为了满足上述需要，本发明提供一种免疫原性组合物，包含第一、第二和第三构建体，以及任选存在的药学上可接受的载剂，其中所述第一构建体包含非洲猪瘟病毒(asfv)的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因或其片段，或包含asfv的cd2v、a104r、a151r、b119l、b602l基因或其片段，所述第二构建体包含asfv的p12、p32、p54、p72基因或其片段，所述第三构建体包含asfv的p220基因或其片段。在一些实施方案中，所述第一构建体包含以5’-3’方向排列的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因或其片段。在一些实施方案中，所述第二构建体包含以5’-3’方向排列的p12、p32、p54、p72基因或其片段。在一些实施方案中，所述第一、第二和第三构建体基于病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体。在一些实施方案中，所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。在一些实施方案中，所述腺病毒载体是人5型复制缺陷型腺病毒载体。在一些实施方案中，所述基因来自asfvgeorgia株。在一些实施方案中，所述a104r基因的序列如seqidno:1或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述a151r基因的序列如seqidno:2或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述b119l基因的序列如seqidno:3或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述b602l基因的序列如seqidno:4或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述cd2v基因的序列如seqidno:5或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述k205r基因的序列如seqidno:6或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述p49基因的序列如seqidno:7或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述p12基因的序列如seqidno:8或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述p32基因的序列如seqidno:9或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述p54基因的序列如seqidno:10或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述p72基因的序列如seqidno:11或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述p220基因的序列如seqidno:12或其简并变体所示。在一些实施方案中，所述第一和第二构建体的中的基因融合表达。在一些实施方案中，所述第一构建体包含seqidno:13或15的核苷酸序列或其简并变体。在一些实施方案中，所述第二构建体包含seqidno:14的核苷酸序列或其简并变体。本发明还提供一种asfv疫苗，包含本发明的免疫原性组合物。本发明还提供包含一或多个本发明的构建体的宿主细胞。本发明还涉及本发明的免疫原性组合物或本发明的第一、第二和/或第三构建体在制备用于治疗或预防asfv感染的药物中的用途。本发明还提供包含本发明的第一、第二和第三构建体的免疫原性组合物，其用于治疗或预防asfv感染。本发明还提供治疗和或预防asfv感染的方法，包括给有需要的对象施用本发明的免疫原性组合物或一或多个本发明的构建体。本发明还提供分离的核酸分子，包含asfv的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因或其片段，或包含asfv的cd2v、a104r、a151r、b119l、b602l基因或其片段，或包含asfv的p12、p32、p54、p72基因或其片段。在一些实施方案中，所述基因或其片段按5’-3’方向排列为a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49，或按5’-3’方向排列为cd2v、a104r、a151r、b119l、b602l，或按5’-3’方向排列为p12、p32、p54、p72。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含seqidno:13、14或15的核苷酸序列。附图说明图1是本发明的重组腺病毒构建过程中制备的腺病毒穿梭载体的示意图。其中插入序列是，例如，seqidno:12-14之一的序列。图2是本发明的重组腺病毒构建过程中制备的腺病毒骨架载体的示意图。其中插入序列是，例如，seqidno:12-14之一的序列。图3是获得重组腺病毒的方法的示意图。其中插入序列是，例如，seqidno:12-14之一的序列。图4显示蛋白质印记的结果。第1泳道是蛋白质分子量标记(marker)；第2泳道是未经转染的样品；第3泳道是经空白腺病毒转染的样品；第4-7泳道依次是经腺病毒h12495、h12496、h12497和h12498转染的样品。发明详述本发明主要涉及用于治疗和预防非洲猪瘟(asf)的疫苗。除非另有说明，本文中使用的术语具有本领域技术人员一般理解的含义。asf是由asfv感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。asf的特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％。临床症状为发热(达40-42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。我国已于2018年发现asf疫情。因此，迫切需要开发针对asfv的疫苗。有报道，asfv疫苗的先前的研究主要集中灭活疫苗和减毒疫苗。然而，灭活疫苗不能诱导有效的保护性应答；减毒毒株在我国是不允许研究的。因此，有需要开发新型的asfv疫苗。潜在的候选疫苗是活载体疫苗。与其他疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。asfv是一种有囊膜的双链dna病毒，其基因组是单分子线状双链dna，全长为约170kb-190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，包含末端反转重复序列。asfv基因组编码假定膜蛋白、分泌性蛋白、参与核苷酸和核酸代谢(dna修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组包含151个orf，可以编码150-200种蛋白质。有利的是，用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质。因此，一方面，本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物表达asfv的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49、p12、p32、p54、p72、p220基因。出人意料地，发明人发现，上述基因必须以特定的组合进行构建，才能够成功表达。因此，在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含第一、第二和第三构建体，以及任选存在的药学上可接受的载剂，其中所述第一构建体包含非洲猪瘟病毒(asfv)的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因或其片段，所述第二构建体包含asfv的p12、p32、p54、p72基因或其片段，所述第三构建体包含asfv的p220基因或其片段。在一些实施方案中，所述第一构建体包含以5’-3’方向排列的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因或其片段。在一些实施方案中，所述第二构建体包含以5’-3’方向排列的p12、p32、p54、p72基因或其片段。如本发明所用，术语“免疫原性组合物”是指包含至少一种抗原的组合物，所述抗原在施用免疫原性组合物的宿主中诱发免疫应答。如本文所用，术语“免疫应答”包括但不限于：产生或活化特异性地针对本发明免疫原性组合物中所包含的一或多种抗原的抗体、b细胞、辅助性t细胞、阻抑性t细胞及/或细胞毒性t细胞及/或γ-δt细胞。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物诱导产生抗体。在一些实施方案中，所述第一、第二和第三构建体基于病毒载体。如本文所用，术语“病毒载体”是指一种核酸载体，其包括至少一个病毒基因组元件，并可以包装入病毒的蛋白质衣壳中，形成病毒颗粒。术语“核酸”是指dna分子、rna分子或其衍生物。术语“多肽”及“蛋白质”可互换使用，是指通过共价肽键键合的多个氨基酸残基的多聚体。当根据允许产生病毒颗粒的合适条件将核酸载体转导入合适的细胞或细胞系时形成所述病毒颗粒。在本发明的上下文中，术语“病毒载体”应被理解为包括核酸载体(例如dna病毒载体)以及其产生的病毒颗粒。本领域已知的病毒载体的典型实例从各种不同的病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(aav)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、甲病毒、水疱性口炎病毒等)产生。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体。病毒载体可以是有复制能力或复制选择性的(例如，被改造为在特定宿主细胞中更好复制或选择性复制)，或可以是复制缺陷或复制受损的。在一些实施方案中，所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。在一些实施方案中，所述腺病毒载体是人5型复制缺陷型腺病毒载体(had5)。本发明的免疫原性组合物可以针对不同的asfv毒株。在一些实施方案中，所述基因来自asfvgeorgia株。本领域技术人员知晓，由于密码子的简并性，编码相同多肽的核酸可以具有不同的核苷酸序列。在本发明的一些实施方案中，所述a104r基因的序列如seqidno:1或其简并变体所示；所述a151r基因的序列如seqidno:2或其简并变体所示；所述b119l基因的序列如seqidno:3或其简并变体所示；所述b602l基因的序列如seqidno:4或其简并变体所示；所述cd2v基因的序列如seqidno:5或其简并变体所示；所述k205r基因的序列如seqidno:6或其简并变体所示；所述p49基因的序列如seqidno:7或其简并变体所示；所述p12基因的序列如seqidno:8或其简并变体所示；所述p32基因的序列如seqidno:9或其简并变体所示；所述p54基因的序列如seqidno:10或其简并变体所示；所述p72基因的序列如seqidno:11或其简并变体所示；和/或所述p220基因的序列如seqidno:12或其简并变体所示。在一些实施方案中，本发明的构建体包含与所述基因可操作连接的调控元件。术语“调控元件”是指在给定宿主细胞或受试者中允许、有助于或调控核酸分子表达(包括但不限于复制、转录、剪接、翻译、稳定性和/或输送)的任意元件，包括但不限于启动子、增强子、终止子等。术语“可操作连接”表示被连接的元件的方式排列使它们能够按照预期目的起作用。例如，如果启动子引起核酸分子转录(从转录起始位点到终止子)，从而在宿主细胞中表达，则启动子与核酸分子可操作连接。在一些实施方案中，所述第一和第二构建体中的基因分别与不同启动子可操作连接，即所述基因的表达由不同的启动子分别驱动。在一些实施方案中，所述第一构建体中的基因在同一启动子的驱动下表达，即所述第一构建体中的各基因形成融合基因。在一些实施方案中，所述第二构建体中的基因在同一启动子的驱动下表达，即所述第二构建体中的各基因形成融合基因。如本文所用，术语“融合基因”是指将两个或多个基因的编码区首尾相连构成的嵌合基因，其由同一套调控元件控制。在一些实施方案中，所述第一构建体包含seqidno:13的核苷酸序列或其简并变体的融合基因。在一些实施方案中，所述第二构建体包含seqidno:14的核苷酸序列或其简并变体的融合基因。本发明还提供分离的核酸分子，包含asfv的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因或其片段，或包含asfv的p12、p32、p54、p72基因或其片段。在一些实施方案中，所述核酸分子包含以5’-3’方向排列的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因或其片段，或包含以5’-3’方向排列的p12、p32、p54、p72基因或其片段。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含seqidno:13或14的核苷酸序列。适用于本发明的构建体的启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子、rsv启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子、单纯疱疹病毒(hsv)-1的胸苷激酶(tk)启动子以及t7聚合酶启动子。在一些实施方案中，本发明的构建体包含cmv启动子。本发明的免疫原性组合物还包含药学上可接受的载剂。术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于溶剂、分散介质、涂覆剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、佐剂、免疫攻击剂及其组合。“稀释剂”包括但不限于水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油和磷酸盐缓冲盐水(pbs)。等渗剂包括但不限于氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂包括但不限于白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含pbs或盐水。术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入生物体时，可增强生物体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含佐剂。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物不包含佐剂。本文所用的“佐剂”包括但不限于含铝佐剂(例如，氢氧化铝、磷酸铝、明矾)、脂多糖、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、cpg寡核苷酸。另一方面，本发明还提供一种asfv疫苗，包含本发明的免疫原性组合物。另一方面，本发明还提供包含本发明的构建体的宿主细胞。术语“宿主细胞”涵盖在本发明的构建体和载体构建过程中涉及的全部细胞，包括但不限于细菌、酵母、哺乳动物细胞。另一方面，本发明还涉及使用本发明的免疫原性组合物或发明的第一、第二和第三构建体治疗或预防asfv感染。如本文所用，“治疗或预防”通常涉及给有需要的动物施用有效量的本发明的免疫原性组合物。术语“治疗”是指在动物个体或群体的至少一些动物已感染asfv且这些动物已展示一些由asfv感染引起或与其有关的临床症状后，施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”是指在动物没有受到asfv感染或不展示任一由asfv感染引起或与其有关的临床症状之前，施用有效量的免疫原性组合物。术语“有效量”包括但不限于诱发或能够诱发个体中的免疫应答的抗原量。所述有效量能够减小动物群体中asfv感染的发病率或减小asfv感染的临床症状的严重程度。术语“临床症状”是指asfv的感染体征。asfv感染的临床症状的实例包含但不限于发热(达40-42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。在本发明中，“有效量”可以是105-109pfu，优选106-108pfu，更优选107pfu。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物是液体形式的组合物。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物的体积为0.5-5ml，优选1-4ml，更优选1.5-3ml，例如，1.5ml、2ml、2.5ml或3ml。本发明的有益效果是：本发明的免疫原性组合物能表达asfv的主要免疫原性蛋白，能够克服现有技术中灭活疫苗和减毒活疫苗的缺陷，解决了我国没有非洲猪瘟疫苗的难题，大大降低了养猪过程中感染非洲猪瘟病毒的风险。本发明的免疫原性组合物包含复制缺陷型重组腺病毒，在猪体内呈现一过性表达而不繁殖，解决了弱毒疫苗长期使用后导致病毒扩散的风险和灭活苗抗体水平不高的问题。本发明的重组腺病毒仅含有非洲猪瘟病毒的主要保护基因，不含非洲猪瘟病毒的其它基因，因此本发明的重组腺病毒和非洲猪瘟野毒株之间不会发生重组。本发明构建的重组腺病毒全部在动物中成功激发了针对asfv的抗体。实施例通过以下实施例对本发明进行进一步的详细说明。应理解，以下实施例旨在对本发明进行示例性说明，而非限制本发明的范围。实施例1、方法本实施例涉及重组腺病毒的制备和免疫所使用的方法。1.基因的获得通过generunner软件，以不同的组合拼接asfvgeorgia株a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49、p12、p32、p54、p72、p220基因，去除5’端基因的终止密码子和3’端基因的起始密码子，以及其他基因的起始和终止密码子。根据所得序列，通过合成获得想要的融合基因，在融合基因5’和3’端分别引入kpni和noti酶切位点。2.腺病毒穿梭质粒的构建合成产物以及腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv分别用kpni和noti进行双酶切，酶切体系为：合成产物15μl、10×buffer5μl、kpni3μl、noti3μl和h2o24μl(共50μl)；或padtrack-cmv质粒10μl、10×buffer6μl、kpni3μl、noti3μl和h2o38μl(共60μl)。上述酶切体系经混匀后，短暂离心，37℃水浴6小时。用8g/l的琼脂糖凝胶进行电泳，分离目的条带并回收(以商业化试剂盒按照说明书进行)。将回收的合成产物分别与回收的padtrack-cmv连接，连接反应体系为：基因回收产物4μl、padtrack-cmv回收产物2μl、10×buffer1μl、t4dna连接酶1μl和h2o3μl(共10μl)。上述连接体系于16℃水浴过夜，然后用连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。取阳性克隆进行测序以确定正确的克隆。3.腺病毒骨架载体(人5型复制缺陷型腺病毒，had5)的构建将2中获得的腺病毒穿梭载体用pmei酶切进行线性化。酶切体系为：载体25μl、pmei4μl、0.1g/lbsa10μl、10×buffer10μl和h2o51μl(共100μl)。经37℃水浴中6h后，经琼脂糖凝胶电泳回收线性化的穿梭载体。将线性化的穿梭载体转化到含有腺病毒骨架载体pad-easy-1的大肠杆菌bj5183感受态细胞(方法与步骤1中的大肠杆菌转化方法相同)。获得重组腺病毒骨架载体。4.重组腺病毒的制备将3中获得的重组腺病毒骨架载体用paci酶切进行线性化。酶切体系为：载体25μl、paci5μl、0.1g/lbsa10μl、10×buffer10μl和h2o50μl(共100μl)。37℃水浴中8h后，在酶切后的产物中，加入2.5体积的无水乙醇和1/10体积的3m的naac，置于-20℃沉淀1h，在4℃以12000rpm离心15min，弃去上清，加入70％乙醇洗一次，自然干燥后，加入20μlh2o溶解dna。将线性化的重组腺病毒骨架载体转染至人胚胎肾细胞hek293/293t细胞中。培养经转染的细胞，以获得重组腺病毒(rhad5)。5.重组腺病毒稳定性测试将重组腺病毒在hek293细胞中传代至100代，通过噬斑法检测重组腺病毒是否能稳定传代。6.用重组腺病毒免疫动物将30日龄的仔猪随机分成若干组，每组30头，并通过颈部肌肉注射，以剂量为1×107pfu(约2ml的pbs中)的腺病毒接种到仔猪。7.检测免疫应答试验猪在接种后的20天、100天、180天时进行耳静脉采血，并分离血清，并用瑞典avanova公司的非洲猪瘟抗体elisa检测试剂盒按照说明书检测抗体。样品检测中读出的od450nm越高，表明抗体滴度越高。8.细胞蛋白质的提取a.将western及ip细胞裂解液和蛋白酶抑制剂pmsf(碧云天生物技术，货号分别为p0014和st506)按每990μl细胞裂解液加10μlpmsf混合，置于冰上预冷；b.从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，pbs洗涤1-2次；c.弃去pbs，加入步骤a中的预冷的混合物，冰上裂解细胞30min；d.于4℃，12,000rpm离心5-10min，保留上清液。9.蛋白质浓度测定使用piercebcaproteinassaykit(thermo，货号23226)，按照说明书测定蛋白质浓度。10.蛋白质印记sds-page凝胶电泳a.使用上海天能科技有限公司的稳压稳流电泳仪(货号eps-600)和微型垂直电泳槽(货号ve-180)，以thermo的pagerulertmprestainedproteinladder(货号26617)作为分子量标记标记，进行sds-page凝胶电泳；b.使用上海天能科技有限公司的转移电泳槽(货号ve-186)，将蛋白质从凝胶转移到pvdf膜上；c.将pvdf膜移至含5％脱脂奶粉的tbst中，室温1h摇动进行封闭；d.用含5％脱脂奶粉的tbst稀释一抗(小鼠anti-flag，sigma，货号f1804s，稀释比1:5000；或兔anti-gapdh，bioworld，货号ap0063，稀释比1:10000)，将封闭后的pvdf膜(蛋白质面朝上)置于一抗液面上，4℃摇动过夜，然后用tbst在室温下洗三次，每次摇动10min；e.将pvdf膜置于用含5％脱脂奶粉的tbst稀释二抗(山羊抗小鼠igg，beyotime，货号a0216，稀释比1:3000；或山羊抗兔igg，beyotime，货号a0208，稀释比1:3000)中，室温下温育1-2h，然后用tbst在室温下洗三次，每次摇动10min；h.用lumibest卓越型ecl发光液(share-bio，货号sb-wb012)进行显色：将a和b两种试剂等体积混合制备发光液；将膜的蛋白面朝上放在白板上，将发光液滴加在膜上，充分覆盖膜表面，然后放入成像仪中拍照。实施例2、基因组合的确定组合asfvgeorgia株的12个基因：a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49、p12、p32、p54、p72、p220，并在各组合的3’末端插入flag标签。然后，根据实施例1的方法制备腺病毒并转染293t细胞(转染所用的腺病毒如表1所示)，提取细胞的蛋白质并进行定量，然后通过蛋白质印记方法检测基因表达，以未经病毒感染的细胞、不携带外源基因的腺病毒感染的细胞作为阴性对照，以gapdh作为阳性对照。表1、基因组合腺病毒名称所包含的基因(3’端包含flag标签)h12495cd2v、a104r、a151r、b119l、b602lh12496a151r、b119l、b602l、p32h12497b602l、p54、p72h12498cd2v、p12、p32、p54、p72结果显示：首先，发明人发现，p220基因和其他11个基因的任何一个组合，都不能获得重组腺病毒。蛋白质印记的结果如图4所示，腺病毒h12495中所插入的基因可以有效地表达，腺病毒h12496中所插入的基因仅微弱表达，而h12497和h12498中所插入的基因不表达。基于此，发明人选定的优选的重组腺病毒的组合包含：包含按5’-3’方向排列的a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因的重组腺病毒；包含按5’-3’方向排列的p12、p32、p54、p72基因的重组腺病毒；以及包含p220基因的重组腺病毒。实施例3、优选的重组腺病毒的构建根据实施例1描述的方式，将a104r、a151r、b119l、b602l、cd2v、k205r、p49基因(seqidno:1-7)按照5’-3’的方向连接获得融合基因f1，f1的核苷酸序列如seqidno:13所示。将p12、p32、p54、p72基因(seqidno:8-11)按照5’-3’的方向连接获得融合基因f2，f2的核苷酸序列如seqidno:14所示。合成f1、f2和p220基因，并构建重组腺病毒rhad5-f1、rhad5-f2和rhad5-p220。噬斑法证明，所获得的重组腺病毒rhad5-f1、rhad5-f2和rhad5-p220可以稳定传代。实施例4、重组腺病毒rhad-f1、rhad-f2和rhad-p220诱导的免疫应答将120头30日龄的仔猪随机分为4组，每组30头。根据实施例1的方法，用rhad-f1、rhad-f2和rhad-p220免疫动物，并检测被免疫的动物的免疫应答。并用空白腺病毒接种动物作为对照。结果：样品血清od值如表2所示。表2、本发明的重组腺病毒载体接种的仔猪血清od值。可见，与空白腺病毒相比，接种重组腺病毒rhad-f1、rhad-f2和rhad-p220可以在仔猪中诱导有效的免疫应答。序列表<110>北京生科基因科技有限公司西安必萨图生物科技有限公司<120>非洲猪瘟病毒疫苗及其用途<130>i2018tc2981b<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>315<212>dna<213>africanswinefevervirus<400>1atgtcgacaaaaaaaaagcccacgattaccaagcaagagctttactccctagtggcggca60gatacccagttaaataaagctttgattgaaagaatttttacaagtcagcaaaaaataatc120caaaatgccttaaaacacaatcaagaagtgattataccacccggaatcaagttcaccgtc180gttacagtaaaagctaaacctgctcgccaaggccataatccggcaacaggagagcctatt240caaattaaagctaaacccgaacataaagcggtaaaaatacgagcattgaaacctgtacat300gacatgttaaactaa315<210>2<211>480<212>dna<213>africanswinefevervirus<400>2atgttgaataaaaaaataattgttatgatggcgttgttacacaaagaaaagcttatagag60tgcatctatcatgagctagaaaatggcgggacaatattgcttctaacaaaaaatattgtt120gtgtcagaaatttcatacattggcaatacttataaatattttacctttaatgacaatcat180gatctgataagcaaagaagatcttaaaggagcaacatccaaaaacattgctaaaatgatt240tataattggattataaaaaatcctcaaaataataagatttggagtggtgagccgcgtact300caaatttattttgaaaatgatttatatcatacaaattacaatcataaatgtataaaagat360ttttggaatgtttcaacttcagtcggtcctcatatctttaatgatcgtagcatttggtgt420actaaatgcacatccttttacccatttaccaacattatgtcgcccaatatattccaataa480<210>3<211>360<212>dna<213>africanswinefevervirus<400>3atgttgcattggggacctaaatactggcgatccttgcatctatatgctatctttttttca60gacgctcctagctggaaagaaaaatatgaagccatccaatggatactgaactttatcgag120tctctgccatgcaccaggtgccagcaccacgccttttcgtatcttacaaaaaatcccttg180acattaaacaactcggaggactttcagtactggaccttcgcgttccataacaacgtaaat240aaccggcttaataaaaaaataatttcttggtcagagtataaaaatatttatgaacaatca300atccttaaaacaatagaatatgggaaaaccgactttattggagcctggtcatctctataa360<210>4<211>1593<212>dna<213>africanswinefevervirus<400>4atggcagaatttaatattgatgagcttctcaaaaacgtattggaggatccctctactgaa60atatccgaagaaacgcttaaacagctttaccaaaggacgaacccttacaaacagttcaaa120aatgatagcagggtggccttttgctcttttacaaatttgcgggagcagtatattcgacgt180cttataatgactagctttattggatatgtcttcaaagctctgcaggaatggatgccttcc240tattcaaaacctacccacacgaccaaaactcttctcagtgagctaataacgttagttgat300actttgaaacaggaaactaatgatgttccctctgaatcggtagtaaatacaattttatct360atagcagatagctgcaaaacccagacgcagaaaagcaaggaagctaaaacaacgatcgat420agctttttacgagaacattttgtgtttgatcctaatcttcatgctcaaagtgcgtatact480tgtgcagataccaatgtagacacttgtgcaagcatgtgtgcagataccaatgtagacacc540tgtgcaagcatgtgtgcagataccaatgtagatacctgtgcaagcacttgtacaagcaca600gaatacaccgatttagcagatcctgagcgcatccctttacacatcatgcaaaaaacatta660aatgtgcctaatgagcttcaggccgatattgatgcaatcacccaaaccccacagggctat720agggcagcagcccacatattacaaaatatagaacttcaccaaagcattaaacatatgctt780gaaaatccgagggcgtttaaacccattctctttaacacaaaaattactagatatctttcg840cagcatattccacctcaggatactttttataagtggaattattacattgaggataattac900gaagagttgcgggccgctacggaaagcatctacccagaaaaacccgacctagagtttgcc960ttcattatttatgatgtggtggatagcagcaaccaacaaaaggttgatgaattttattat1020aaatataaagaccagattttctcagaggtttcatccattcaattaggcaactggacactc1080ctgggaagctttaaggccaacagagagcgctacaattattttaatcaaaataatgaaata1140ataaaacggattttggaccgtcatgaggaagacctaaagataggaaaagagattttacga1200aatactatttaccacaaaaaagcaaaaaatatacaagaaactggcccggatgctccgggg1260ctctccatctataattcaacctttcacacggatagcgggattaagggactgctttccttt1320aaggagctaaaaaacctagaaaaagcatctggaaatatcaaaaaagctcgagagtatgat1380tttatagacgactgcgaagaaaaaattaagcaactgcttagtaaagaaaatttaaccccc1440gatgaagaaagcgagctgataaaaacaaaaaaacagttagataatgcgcttgaaatgctc1500aatgtgcctgatgatacgatacgggtagatatgtgggtcaacaataataataaactcgaa1560aaagaaattttatatacaaaagcagaattgtaa1593<210>5<211>1083<212>dna<213>africanswinefevervirus<400>5atgataatacttatttttttaatattttctaacatagttttaagtattgattattgggtt60agttttaataaaacaataattttagatagtaatattactaatgataataatgatataaat120ggagtatcatggaatttttttaataattcttttaatacactagctacatgtggaaaagca180ggtaacttttgtgaatgttctaattatagtacatcaatatataatataacaaataattgt240agcttaactatttttcctcataatgatgtatttgatacaacatatcaagtagtatggaat300caaataattaattatacaataaaattattaacacctgctactcccccaaatatcacatat360aattgtactaattttttaataacatgtaaaaaaaataatggaacaaacactaatatatat420ttaaatataaatgatacttttgttaaatatactaatgaaagtatacttgaatataactgg480aataatagtaacatta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