TIR/BB环拟似物AS-1在制备治疗角膜新生血管性疾病的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及tir/bb环拟似物as-1在制备治疗角膜新生血管性疾病的药物中的应用。

背景技术：

血管的发生和形成是一基本的生物学过程，而病理性的新生血管形成在多种眼病中发挥着重要作用。其中角膜新生血管性疾病是我国的第二大致盲性眼病，发病机制尚未完全阐明，也无有效的治疗方法。

角膜碱烧伤是临床上常见的眼外伤类型，致盲率极高。碱烧伤后往往会形成角膜新生淋巴管和新生血管。这些病理性血管组织具有紧密连接缺失，高渗透性的特征，易出血，加重炎症反应、导致角膜混浊,最终导致视力下降,严重者可致盲。此外，角膜新生淋巴管和新生血管的形成打破了角膜的“免疫赦免”状态，这也是临床角膜移植排斥反应的主要原因，目前尚缺乏有效的治疗手段。所以，深入开展对角膜新生血管和角膜新生淋巴管的研究，开发新的、主要作用于逆转这些病理性血管组织、更加安全有效的治疗药物，是医学界致力于解决的关键科学问题。

在角膜碱烧伤所引起的免疫功能紊乱中，细胞因子的作用不能忽视。角膜上皮受刺激后可产生大量的白细胞介素-1(interleukin-1，il-1)，而il-1又导致角巩膜缘langerhans细胞向角膜中央的迁移，参与炎细胞浸润，炎症细胞因子的大量分泌。il-1β是角膜碱烧伤炎症反应早期合成和释放的细胞因子,不仅对多种炎症细胞具有趋化作用,还能直接作用于角膜并引起组织损伤，导致角膜溃疡的发生。炎症因子il-1β通过结合il-1受体，招募髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，myd88)，介导nf-κb的活化，促进促血管生成因子vegf-a，以及促组织修复以及血管新生因子il-10等的分泌，导致过度的血管新生,进而造成角膜瘢痕化、影响角膜透明度。此外，il-10通过促进m2型巨噬细胞中jak/stat3活化，分泌vegf-c，进而促进新生淋巴管的形成在碱烧伤的鼠角膜使用白介素一受体拮抗剂(interleukin-1receptorantagonist，il-1ra)后角膜的混浊度、新生血管评分显著低于对照,且角膜炎细胞浸润减少，炎症细胞因子的表达量降低。同时，il-1ra可剂量依赖性地抑制淋巴细胞在角膜的聚集和活化,下调角膜碱烧伤后免疫应激水平。因此，il-1β/il-1r信号通路是治疗角膜碱烧伤重要的干预靶点。

tir/bb环拟似物as-1(hydrocinnamoyl-l-valylpyrrolidine，as-1)是一种脂溶性小分子化合物，容易进入细胞内，它模拟了myd88-tir-bb环【(f/y)-(v/l/i)-(p/g)】的一段三肽序列，能够抑制myd88与白细胞介素-1ⅰ型受体/辅助受体(interleukin-1receptortypei/interleukin-1receptoraccessoryprotein，il-1ri/il-1racp)的结合。研究表明，as-1对多种炎症相关疾病，以及纤维化疾病有不同程度的抑制作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供tir/bb环拟似物as-1在制备治疗角膜新生血管性疾病的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：

tir/bb环拟似物as-1在制备治疗角膜新生血管性疾病的药物中的应用。

tir/bb环拟似物as-1在制备治疗角膜碱烧伤的药物中的应用。

tir/bb环拟似物as-1在制备治疗角膜碱烧伤新生血管化的药物中的应用。

tir/bb环拟似物as-1在制备治疗角膜碱烧伤新生淋巴管化的药物中的应用。

tir/bb环拟似物as-1通过阻断il-1r与myd88的结合，抑制转录因子nf-b的活化，减少炎症因子的分泌，炎细胞的浸润，同时降低vegf-a、vegf-c的水平，最终缓解碱烧伤角膜新生血管化和新生淋巴管化，达到治疗目的。

本发明首次将脂溶性小分子多肽引入角膜碱烧伤的治疗领域，对as-1对角膜碱烧伤治疗作用的研究，不仅为碱烧伤角膜新生血管和角膜新生淋巴管的治疗提供新的靶向药物，同时为小分子多肽治疗角膜碱烧伤提供新思路。

有益效果：

1、as-1在治疗角膜新生血管性疾病中有很好的应用前景，增加研究的力度有可转化为眼用制剂的可能。

2、对as-1对角膜碱烧伤治疗作用的研究，不仅为碱烧伤角膜新生血管和角膜新生淋巴管的治疗提供新的治疗药物，同时也为减轻甚至阻断临床角膜移植排斥反应提供了新思路。

附图说明

图1为本发明实施例的实验设计路线。

图2为实施例1中as-1逆转碱烧伤的角膜新生血管化的裂隙灯白光照片和钴蓝光照片，n＝6。

图3为实施例1中碱烧伤后小鼠角膜新生血管和新生淋巴管的生长情况。其中：a为裂隙灯照片，b为小鼠角膜石蜡包埋组织h&e染色照片，c、d、e分别为westernblot及其定量图，n＝6。

图4为实施例2中碱烧伤后各组角膜组织中血管标志物ib4、淋巴血管化标志物lyve1、vegf-c的表达。其中：a为lyve1/ib4的表达，b为vegf-c/ib4的表达，n＝6。

图5为实施例2中碱烧伤后大鼠角膜组织中细胞因子水平。其中，a、b、c、d、e、f为msd电化学发光法检测角膜组织中35种细胞因子水平，g为real-timepcr检测角膜组织中细胞因子的mrna水平，n＝3。

图6为实施例3中as-1通过阻断il-1r与myd88的结合，抑制vegf-a、vegf-c、lyve1的水平。其中：a、b为免疫沉淀检测naoh处理的角膜内皮细胞中myd88与il-1r的结合及其定量图，c为免疫荧光检测碱烧伤组织中myd88与il-1r的共定位，d为westernblot检测naoh处理的角膜内皮细胞中促血管新生和促淋巴管新生相关蛋白的表达，n＝3。

图7为实施例3中通过阻断p65的核转位，抑制naoh处理的角膜内皮细胞中nf-κb的活化。其中：a为westernblot检测胞浆胞核中p65的水平，b为免疫荧光检测p65的核转位，c为emsa检测nf-κb的活化，n＝3。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

如图1所示，本发明分别以碱烧伤动物模型和人源角膜细胞作为研究对象，从组织功能到细胞水平全方位进一步探究(1)as-1对碱烧伤角膜的治疗作用及(2)as-1调控碱烧伤角膜的新生血管化和角膜新生淋巴管化的分子机制。

实施例1

1、实验动物：本发明使用的实验动物为sprague-dawley大鼠(spf级)，饲养于无锡市人民医院实验动物中心。

2、碱烧伤动物模型的建立

健康spf级8周雄性c57bl/6小鼠或者200-220g雄性sd大鼠经过眼科裂隙灯显微镜和间接眼底镜检查，排除眼部疾病。麻醉后奥布卡因滴眼液滴眼三次表面麻醉，开睑器开眼睑后，并除去结膜囊多余液体，将圆形whatman3号滤纸用1n的na0h溶液浸泡30s，置于角膜中央40s，随即用40ml生理盐水冲洗角膜和结膜囊60s，结膜囊涂红霉素眼膏预防感染。在碱烧伤后第3天、第7天、第14天通过裂隙灯显微镜观察并照相，记录大鼠角膜病变进展情况。

3、as-1给药方式

通过as-1对1nnaoh碱烧伤造模的c57bl/6小鼠或者sd大鼠结膜下隔日注射及每日左氧氟沙星滴眼液滴眼3次，于碱烧伤后3d、7d和14d进行裂隙灯，角膜荧光素钠造影或者he染色观察角膜损伤和新生血管数量，vegf-c免疫组化或者免疫荧光染色观察角膜新生淋巴管数量。elisa检测vegf-a，vegf-c的水平。检测as-1对碱烧伤角膜新生血管化和角膜新生淋巴管化。

如图2和图3所示，给与as-1后，角膜新生血管和角膜新生淋巴管数量明显低于溶剂对照组；as-1逆转碱烧伤引起的角膜溃疡损伤面积以及基质中的炎症细胞浸润及纤维组织增生和基质排列紊乱。

实施例2

培养人源的角膜细胞，as-1预处理后，给与0.01n的naoh处理，采用tunel细胞凋亡检测、流式细胞术、edu染色及划痕实验等方法确定as-1对细胞增殖、凋亡及迁移的调控，并检测淋巴管生长因子vegf-c的水平，从细胞水平揭示as-1对碱烧伤角膜的新生血管化和角膜新生淋巴管化影响。

如图4所示，碱烧伤后各组角膜组织中血管标志物ib4，淋巴血管化标志物lyve1，vegf-c的表达在as-1组中有显著的降低。

如图5所示，检测角膜组织中35种细胞因子水平，其在碱烧伤组中显著升高，尤其是在第3d、7d；as-1通过阻断il-1r与myd88的结合，抑制角膜中炎症因子的水平，尤其是il-1β、il-6、mcp1、il-17a、mip-1α、等；碱烧伤引起的促血管相关因子，如il-10、vegf、epo、mip-2等的升高，在as-1组中也得到明显逆转；同样在rt-pcr实验中得到进一步的验证。

实施例3

揭示as-1调控碱烧伤角膜的新生血管化和角膜新生淋巴管化的分子机制。

1)采用信号通路发现芯片筛选通路特异性基因，并通过western-blot进一步验证；进一步阻断或活化相应信号转导途径，检测as-1对细胞增殖的影响，揭示参与as-1调控碱烧伤角膜的新生血管化和角膜新生淋巴管化的信号转导系统。

2)通过过表达及sirna分别激活和阻断il-1r信号通路，检测as-1对碱烧伤角膜的新生血管化和角膜新生淋巴管化作用的改变情况，揭示参与as-1逆转碱烧伤角膜的新生血管化和角膜新生淋巴管化的机制。

如图6和图7所示，在角膜内皮细胞中，as-1抑制naoh处理诱导的il-1r与myd88的结合，抑制erk(1/2)的磷酸化以及nf-κb的转录活性，从而抑制vegf-a，vegf-c，lyve1的水平的升高。