利用netrin-1干扰药物和化疗药物的联合治疗的制作方法

本申请是申请日为2013年9月12日、申请号为201380051861.6、发明名称为“利用netrin-1干扰药物和化疗药物的联合治疗”的中国发明专利申请的分案申请。

本发明涉及治疗癌症的新型组合的组合物和方法。

背景技术：

最近提出netrin-1(最初发现作为轴突导航因子(1)的可溶性蛋白质)通过调节细胞凋亡在癌症进展中起着至关重要的作用(2,3)。实际上，netrin-1受体dcc和unc5h-即unc5h1、unc5h2、unc5h3和unc5h4(也称为unc5a、unc5b、unc5c或unc5d)-属于所谓的依赖性受体家族(4)(5)(6)。这些依赖性受体因其诱导细胞死亡(当从其配体释放时)的能力而产生依赖于它们各自配体的细胞状态(7)，并因此可表现为肿瘤抑制因子，因为它们消除可在配体不可用的背景中产生的肿瘤细胞(2，8)。在这一点上，具有针对其促细胞凋亡活性被灭活的dcc受体的小鼠发生自发性结直肠癌，并且更易于发生肠肿瘤进展(9)。类似地，小鼠中unc5h3/c在胃肠道中的失活与肠肿瘤进展相关(10)。

因此，根据依赖性受体模型，侵袭性人肿瘤的进展应当需要该死亡途径的失活。存在至少三种方式来实现该生存优势：netrin-1受体的表达的丧失，如在人结直肠癌中针对dcc和/或unc5h详尽描述的(10-13)；丧失通过dcc或unc5h诱导的下游死亡信号转导；获得配体的自分泌或旁分泌表达。有趣地，已显示netrin-1在相当大部分的转移性乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌中、在与结直肠癌相关的炎症中和在成神经细胞瘤中被上调(14-19)。在体外和在癌症的小鼠或鸡模型中的概念证明研究已显示，通过netrin-1sirna或干扰netrin-1受体相互作用导致的netrin-1的沉默与肿瘤细胞死亡和与肿瘤生长和转移瘤的抑制相关(14-18)。这些后来的研究提出，破坏netrin-1对其受体的结合可代表大部分癌症中的高效抗癌策略，在所述癌症中netrin-1以自分泌或旁分泌的方式表达。早期药物开发集中在模拟与netrin-1相互作用的受体的生物试剂-生物制剂上(20)。

一些其它工作集中在netrin-1及其受体在血管生成中的作用，希望血管生成的调控可帮助抑制肿瘤进展。us2006/0153840公开了netrin-1受体活性的调节可激活或抑制血管生成，并提出了减少或增加血管生成的策略。该文献公开了netrin-1受体或其片段用作为促血管生成物质的用途，以及包含netrin-1受体和免疫球蛋白的fc片段的融合蛋白用作促血管生成多肽的用途。该文献教导，netrin-1诱导的抗血管生成作用可通过阻断netrin-1对其受体诸如unc5h2(也称为unc5b)的可用性来逆转，并且抑制或阻断netrin-1受体的活性可诱导强的血管生成。wo2010/059821公开了unc5b在静息成人脉管系统中被下调，但在植入肿瘤的出芽式血管生成期间中重新表达，激动剂(netrin-1)对表达unc5b的新生血管的刺激抑制出芽式血管生成以及unc5b的功能的遗传丢失可减小netrin-1介导的血管生成抑制。该文献暗示unc5b活化抑制出芽式血管生成，并且unc5b会是潜在的抗血管生成靶。该文献随后提出抑制unc5b的活性或抑制netrin-1对该受体的结合的抗-unc5b抗体用作抗血管生成剂和用作治疗特征在于异常血管发生的疾病诸如癌症的试剂的用途。wo2006/054000公开了抗-netrin-1抗体用作抗血管生成剂的用途以及其在治疗癌症的组合物中的用途。两个最近的文献进一步提出将抗unc5b或抗-netrin-1抗体组合至现有的化疗药物。在不存在关于这些相互矛盾的公开内容的一致实验结果的情况下，本领域普通技术人员难以在抗-netrin-1或抗unc5h2抗体对血管生成的影响上达成某些明确的教导，更不用说关于潜在的抗肿瘤活性了。本领域普通技术人员还难以建立已知影响增殖的肿瘤细胞而非形成血管的静息内皮细胞的化疗药物与基于抗netrin-1或抗-unc5h2抗体的抗生管生成治疗之间的生物联系。

技术实现要素：

然而本发明提供了将基于netrin-1干扰的治疗与作为肿瘤细胞的应激反应的结果，增加肿瘤细胞存活对netrin-1的依赖性的化疗药物组合的生物原理。

事实上，在早期临床评价过程中对符合基于netrin-1干扰的治疗的癌症患者部分的搜寻导致本发明人研究常规化疗治疗对netrin-1和netrin-1受体表达的影响。多柔比星、5-氟尿嘧啶(5fu)、紫杉醇(taxol)和顺铂确实是“经典”化疗，并且仍然广泛地用于具有乳腺癌、肺癌、结直肠癌以及其它类型的实体瘤的患者(具有局部肿瘤和晚期肿瘤的患者)的管理中。然而，尽管它们是有效的，但常规试剂的使用受到毒性和抗性的出现的限制。本发明人在此处显示，这些化疗治疗，即使它们作用于不同的细胞机制，但仍触发netrin-1及其受体的显著增加。本发明人显示，该增加与在体外netrin-1干扰后增加的细胞死亡诱导相关。因此本发明人显示，多柔比星与netrin-1干扰药物候选物的组合在动物模型中增强肿瘤生长抑制作用。

此处显示的临床前数据支持这样的观点：组合常规药物与netrin-1干扰可在具有降低浓度的常规药物的情况下导致出人意料的增强的效力。这些数据一起支持这样的原理：与常规化疗组合的基于netrin-1干扰的疗法与协同抗癌作用相关。据认为基于netrin-1干扰的疗法具有两个积极作用，第一积极作用是归因于netrin-1/受体结合的抑制的细胞凋亡或细胞死亡的诱导(所谓的netrin-1受体诱导的细胞凋亡的促进)，第二积极作用是化疗诱导的netrin-1和/或受体表达的增加的潜在有害作用会被netrin-1/受体结合及其抗细胞凋亡作用的抑制抵消。

在本发明中，组合物和方法用于治疗表达或过表达netrin-1的癌症，其中该表达或过表达与癌症本身相关，或由单独的化疗药物治疗诱导，或为这两者表达或过表达。

本发明的目的是联合抗癌治疗的方法，包括给有此需要的患者施用化疗药物和netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体。所述化疗药物和netrin-1干扰药物以有效量存在。

本发明的另一个目的是组合物，其包含用作与化疗药物组合用于患者的抗癌药剂的netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体。本发明还涉及组合物，其包含用作利用化疗药物治疗的患者中的抗癌药剂的netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体。

本发明的另一个目的是组合物，其包含用作与netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体组合用于患者的抗癌药剂的化疗药物。本发明还涉及组合物，其包含用作利用netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体治疗的患者中的抗癌药剂的化疗药物

本发明的另一个目的是组合物或部件的试剂盒，其包含化疗药物和netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体，以用于给患者同时地、分别地或相继地施用。

本发明的另一个目的是用作抗癌药剂或抗癌治疗的组合物或部件的试剂盒，其包含化疗药物和netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体，以用于给患者同时地、分别地或相继地施用。

本发明的另一个目的是组合物，其包含药学上可接受的载体或媒介物中的化疗药物和netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体。

本发明的另一个目的是用作抗癌药剂的组合物，其包含药学上可接受的载体或媒介物中的化疗药物和netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体。

另一个目的是netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体用于制备抗癌药剂的用途，所述抗癌药剂旨在用于与化疗药物一起联合治疗患者。

另一个目的是化疗药物用于制备抗癌药剂的用途，所述抗癌药剂旨在用于与netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体一起联合治疗患者。

另一个目的是netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体和化疗药物用于制备组合的抗癌药剂的用途。

另一个目的是netrin-1干扰药物或能够在体内表达netrin-1干扰药物的载体和化疗药物用于制备组合的抗癌药剂组合物或部件的试剂盒(以用于给患者同时地、分别地或相继地施用)的用途。

根据本发明的重要特性以及如下文中进一步解释的，化疗药物为诱导netrin-1在癌细胞中过表达的药物，并且netrin-1干扰药物促进netrin-1受体诱导的细胞凋亡或细胞死亡。

患者可以是哺乳动物，更具体地是人。

治疗性处理包括预防和治疗。

现描述这些目的的更详细实施方案。

所述化疗药物具体地是这样的药物，其诱导netrin-1在癌细胞中过表达。可对任何癌细胞(诸如来自活组织检查的细胞系或细胞)容易地进行药物诱导netrin-1过表达的确定。在实施方案中，对来自待治疗的癌症的细胞，例如来自活组织检查的细胞进行所述测定。在另一个实施方案中，对代表待治疗的癌症的细胞(诸如细胞系)进行所述测定。在另一个实施方案中，对a549或h460细胞系进行所述测定。所述测定可包括比较利用化疗药物处理的细胞与未处理的细胞之间的netrin-1基因表达。表达可通过pcr，尤其是定量rt-pcr，例如使用本文中公开的和提供的引物(seqidno：11和12)来测量。诱导该过表达的药物家族中的药物的分类可简单地通过参照图1按照下列关于a549或h460细胞系的材料和方法中描述的方法来进行。

化疗药物特别地是细胞毒性药物。

在一些优选实施方案中，所述药物为多柔比星、5-氟尿嘧啶(5fu)、紫杉醇(例如taxol)或顺铂。

在实施方案中，所述药物为细胞毒性抗生素。细胞毒性抗生素可以是放线菌素、蒽环类抗生素、博莱霉素、普卡霉素或丝裂霉素。蒽环类抗生素可以是多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、去甲氧柔红霉素或表柔比星。

在实施方案中，所述药物为烷化剂。所述烷化剂可以是铂衍生物，诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂或其它烷化剂诸如环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派。其它种类包括表鬼臼毒素类，例如依托泊苷、拓扑异构酶抑制剂(喜树碱类)，例如伊立替康、托泊替康、dna的小沟的烷化剂，例如曲贝替定(yondelis)、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞。

在实施方案中，所述药物为紫杉烷或其他微管蛋白靶向剂。紫杉烷可以是紫杉醇或多西他赛，或艾日布林(最近被批准用于乳腺癌)。

在实施方案中，所述药物为抗肿瘤剂诸如：

-乳腺激素疗法药物：例如他莫昔芬、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、faslodex；

-前列腺激素疗法药物：例如，lhrh激动剂、比卡鲁胺、阿比特龙；

-单克隆抗体：例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗；

-激酶抑制剂：例如，伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼、舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、克唑替尼、阿西替尼。

本发明暗示或可能不暗示对化疗药物的剂量方案的变化。然而，与netrin-1干扰药物发生的协同作用可允许在患者中使用较低剂量方案。技能医生能够确定在由本发明提供的联合治疗的情况下的最佳剂量方案。

本发明还涉及患者的联合治疗，其中所述化疗在治疗方案包含至少2种化疗药物的意义上已经是联合化疗。也就是说，根据本发明的不同目的方法、组合物、部件的试剂盒和用途，组合至少一种netrin-1干扰药物和至少两种(例如2、3、4或5种)化疗药物。

netrin-1干扰药物是这样的药物，其干扰netrin-1与netrin-1受体相互作用的能力，或其干扰netrin-1诱导netrin-1受体的二聚化或多聚化的能力，或更常见地其促进netrin-1受体诱导的细胞凋亡。本领域普通技术人员可参考wo2007/099133，其公开了netrin-1与其受体之间的干扰，netrin-1与受体之间的相互作用或结合的减弱或抑制，或netrin-1诱导netrin-1受体的二聚化或多聚化的能力的减弱或抑制，由此促进netrin-1受体诱导的细胞凋亡。

在实施方案中，它为小干扰rna或sirna，所述小干扰rna或sirna为双链rna(dsrna)(即其可在长度上具有10至50个核苷酸)并且减少编码netrin-1的基因的表达。第一链的部分与靶基因互补，即其具有足够的互补性以与靶基因杂交，例如与靶基因或与其部分具有至少80％的同一性。ap：人netrin-1mrna序列登录号：nm_004822。可使用的sirna序列：seqidno：10aagcuggacgcagcaugaugc(有义)，对应于序列nm_004822的位置94-114。

在第二实施方案中，干扰药物是结合至netrin-1的药物，并且因干扰药物的结合而使得netrin-1不能结合至其受体或诱导netrin-1受体(特别是dcc和/或unc5)的二聚化/多聚化。在实施方案中，该药物是结合netrin-1的抗体。其优选是特异性结合netrin-1的多克隆或单克隆抗体。在另一个实施方案中，该药物是包含netrin-1受体的胞外结构域或所述胞外结构域的片段的化合物。例如，netrin-1受体的胞外结构域或所述胞外结构域的片段的氨基酸序列以uniprot序列id[胞外域位置范围]给出：unc5a：q6zn44[氨基酸26-306，或片段34-240]；unc5b：q8izj1[氨基酸27-377或片段29-244]；unc5c：o95185[氨基酸41-380或片段61-258]；unc5d：q6uxz4[氨基酸33-379]；dcc：p43146[氨基酸26-1097]。该药物能够结合netrin-1。netrin-1受体可以是dcc、unc5a、unc5b、unc5c或unc5d。本发明的方法可使用两种或更多种化合物，其各自包含来自不同netrin-1受体的胞外结构域或其部分。例如，所述药物包含两种包含来自dcc和来自unc5(例如unc5a)的胞外结构域或其部分的化合物。

在第三实施方案中，干扰药物是结合至netrin-1受体的药物。netrin-1受体可以是dcc、unc5a、unc5b、unc5c或unc5d。本发明的方法可使用两种或更多种各自结合至不同netrin-1受体的干扰药物。例如，所述药物包含两种干扰药物，一种结合至dcc和另一种结合至unc5，例如unc5a。在实施方案中，该药物是结合至netrin-1受体的抗体。其优选为特异性结合至netrin-1受体的多克隆或单克隆抗体。在另一个实施方案中，该药物是化合物，特别是包含肽部分的化合物，或者是小分子，其能够结合至netrin-1受体，该结合能够阻止netrin-1通过netrin-1受体阻断细胞凋亡诱导的能力，尤其是诱导受体的二聚化或多聚化的能力。

“抗体”在最广义上用于指可结合netrin-1的任何抗体，其中该结合阻碍netrine-1与netrin1受体之间的结合。

“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和这些抗体的抗原结合片段，所述片段显示期望的生物活性。单克隆抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。术语“抗体”是指任何全长抗体或抗体的功能性片段(通过遗传工程或非遗传工程获得的)，其包含至少一个抗原组合位点或由所述位点组成，从而允许所述抗体结合抗原性化合物的至少一个抗原决定簇。以抗体片段为例，可提及的有片段fab、fab’、f(ab’)2和单链可变片段(scfv链)。本发明中使用的抗体是特异于抗原的抗体。它们优选为单克隆抗体或单特异性多克隆抗体，即它们仅特异性识别一种表位。在本发明的背景中有用的单克隆抗体或单特异性多克隆血清或通过筛选基因组文库获得的抗体的产生是常规技术。

抗-netrin1多克隆抗体，除其它以外，可通过借助于选择的氨基酸序列来免疫动物例如兔、小鼠等，收集获得的抗血清和随后按照对于本领域普通技术人员来说本身已知的方法，将获得的抗血清倾倒在例如含有受体的免疫吸附剂上来获得。

netrin-1氨基酸序列(无信号肽)是如seqidno:13中描述的，并可将netrin-1完整或部分地用于设计抗体。

通常地，可按照由和milstein(1975)描述的淋巴细胞融合和杂交瘤培养的常规方法获得单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的其它方法也是已知(harlow等人，编辑，1988“antibodies：alaboratorymanual”)。单克隆抗体可通过免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔或甚至人类等)和使用导致杂交瘤的淋巴细胞融合技术(和milstein,1975)来制备。

存在对该常规技术的替代技术。例如，可能通过表达从杂交瘤克隆的核酸来产生单克隆抗体。还可能通过噬菌体展示技术，通过将抗体的cdna引入载体来产生抗体，所述载体通常是在噬菌体的表面展示基因文库v的丝状噬菌体(例如大肠杆菌(e.coli)的fuse5,scott,1990)。用于构建这些抗体文库的方案描述于marks等人(1991)中。对应于具有信号序列的全长netrin-1(seqidno：14)或其适当的片段的cdna用于产生根据这些方法的单克隆抗体。

在优选实施方案中，干扰药物包含netrin-1受体的胞外结构域或所述胞外结构域的片段。所述netrin-1受体可以为dcc、unc5a、unc5b、unc5c或unc5d。

在实施方案中，所述胞外结构域或其部分结合于抗体fc部分。在优选实施方案中，fc部分为人igg的fc或其部分。人igg可即是igg1、igg2a、igg2b、igg3。在优选实施方案中，所述igg为igg1。

在实施方案中，融合蛋白是单链，其意指所述蛋白由dcc或unc5片段(所述片段分别包含dcc的第4或第5纤连蛋白样结构域或unc5的两个ig样结构域或由所述结构域组成)和改善化合物的药学参数的肽或蛋白质序列制成。

在另一个优选实施方案中，所述融合蛋白是双链，其意指所述融合蛋白由两条链(其各自分别包含dcc的第4或第5纤连蛋白样结构域或unc5的2个ig样结构域或由所述结构域组成)和抗体fc部分制成，其中两条链优选通过一个或多个(例如2个)二硫键连接在一起。

在实施方案中，药物包含dcc的第5个纤连蛋白结构域(fn5或5fbn)。优选地，药物包含dcc融合蛋白，其包含融合于抗体fc部分的该fn5。在优选实施方案中，所述fc部分为人igg的fc或其部分。人igg可即是igg1、igg2a、igg2b、igg3。在优选实施方案中，igg为igg1。dcc基因可以例如在id1630(如2012年7月14日更新的)下获自ncbi，其编码如uniprotp43146(2012年7月11日更新的)的dcc受体蛋白。用于本发明并且包含fn5的dcc融合蛋白描述于wo2012025618中。在实施方案中，所述融合蛋白具有wo2012025618中的氨基酸序列seqidno：2、3或4。在实施方案中，所述融合蛋白由wo2012025618中的dna序列seqidno：1编码。包含fn5的融合蛋白的其它实例为wo2007099133、fitamant等人(14)和delloye-bourgeois(16)中描述的具有谷胱甘肽s-转移酶的dcc-5-纤连蛋白融合蛋白(dcc-5fbn-gst)。

在实施方案中，药物包含unc5的2个ig样结构域。优选地，药物包含unc5融合蛋白，其含有融合于抗体fc部分的unc5的两个ig样结构域的。人igg可即是igg1、igg2a、igg2b、igg3。在优选实施方案中，igg为igg1。在实施方案中，unc5为unc5a。在另一个实施方案中，unc5为unc5b。在另一个实施方案中，unc5为unc5c。在另一个实施方案中，unc5为unc5d。

在实施方案中，unc5a-融合体中的unc5a蛋白包含seqidno：1的氨基酸20-217或由所述氨基酸组成。该融合蛋白还可包含igg1fc，所述igg1fc包含seqidno：1的氨基酸220至446或由所述氨基酸组成。该fc例如通过接头例如gt融合于unc5a蛋白。在实施方案中，本发明涉及unc5a蛋白的unc5a融合体，其包含seqidno：1的氨基酸序列：κ2信号肽序列：氨基酸1至19；unc5a的ig样结构域：氨基酸20至217；接头：氨基酸218-219；人igg1fc：氨基酸220至446，或由所述序列组成。在实施方案中，成熟融合蛋白不包含κ2信号肽序列。在优选实施方案中，所述融合蛋白是双链。本发明还包括变体序列，其在20-217氨基酸序列或seqidno：1的氨基酸20-446的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的百分比同一性。氨基酸置换可以例如存在于20-217氨基酸序列或seqidno：1的全长上的位置9、72、74、87、144、164、170、193和/或210的一个或几个位置上。

在另一个实施方案中，unc5b融合体中的unc5b蛋白包含seqidno：2的氨基酸20至215或由所述氨基酸组成。该融合蛋白还可包含igg1fc，所述igg1fc包含seqidno：2的氨基酸218至444或由所述氨基酸组成。该fc例如通过接头诸如gt融合于unc5a蛋白。在实施方案中，本发明涉及unc5b蛋白的unc5b融合体，其包含seqidno：2的氨基酸序列：κ2信号肽序列：氨基酸1至19；unc5b的ig样结构域：氨基酸20至215；接头：氨基酸216-217；人igg1fc：氨基酸218至444，或由所述氨基酸序列组成。在实施方案中，成熟融合蛋白不包含κ2信号肽序列。在优选实施方案中，所述融合蛋白是双链。本发明包括变体序列，其在20-215氨基酸序列或seqidno：2的氨基酸20-444的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的百分比同一性。氨基酸置换可以例如存在于20-215氨基酸序列或seqidno：2的全长上的位置29、74、100、109、113、146、149、155、172、184、189、201、213和/或214的一个或几个位置上。

在另一个实施方案中，unc5c融合体中的unc5c蛋白包含seqidno：3的氨基酸20至217或由所述氨基酸组成。该融合蛋白还可包含igg1fc，所述igg1fc包含seqidno：3的氨基酸220至446或由所述氨基酸组成。该fc例如通过接头诸如gt融合于unc5a蛋白。在实施方案中，本发明涉及unc5c蛋白的unc5c融合体，其包含seqidno：3的氨基酸序列：κ2信号肽序列：氨基酸1至19；unc5c的ig样结构域：氨基酸20至217；接头：氨基酸218-219；人igg1fc：氨基酸220至446，或由所述氨基酸序列组成。在实施方案中，成熟融合蛋白不包含κ2信号肽序列。在优选实施方案中，所述融合蛋白是双链。本发明包括变体序列，其在20-217氨基酸序列或seqidno：3的氨基酸20-446的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的百分比同一性。氨基酸置换可以例如存在于20-217氨基酸序列或seqidno：3的全长上的位置33、66、109、129、136、178、189和/或211的一个或几个位置上。

在另一个实施方案中，unc5d融合体中的unc5d蛋白包含seqidno：4的氨基酸20至217或由所述氨基酸组成。该融合蛋白还可包含igg1fc，所述igg1fc包含seqidno：4的氨基酸220至446或由所述氨基酸组成。该fc例如通过接头诸如gt融合于unc5a蛋白。在实施方案中，本发明涉及unc5d蛋白的unc5d融合体，其包含seqidno：4的氨基酸序列：κ2信号肽序列：氨基酸1至19；unc5d的ig样结构域：氨基酸20至217；接头：氨基酸218-219；人igg1fc：氨基酸220至446，或由所述氨基酸序列组成。在实施方案中，成熟融合蛋白不包含κ2信号肽序列。在优选实施方案中，所述融合蛋白是双链。本发明包括变体序列，其在20-217氨基酸序列或seqidno：4的氨基酸20-446的全长上具有等于或大于90％，优选大于96、95、94、93、92或91％的百分比同一性。氨基酸置换可以例如存在于20-217氨基酸序列或seqidno：4的全长上的位置38、79、80、115、131、178、186、201和/或212的一个或几个位置上。

本发明提供了下列核酸分子：

-编码unc5a蛋白的seqidno：5；nt(核苷酸)；nt1-6hindiii限制性位点，nt7-15kozak序列，nt16-72κ2信号序列，nt73-666unc5a编码序列，nt667-672xpni限制性位点；

-编码unc5b蛋白的seqidno：6；nt(核苷酸)；nt1-6hindiii限制性位点，nt7-15kozak序列，nt16-72κ2信号序列，nt73-660unc5b编码序列，nt661-666xpni限制性位点；

-编码unc5c蛋白的seqidno：7；nt(核苷酸)；nt1-6hindiii限制性位点，nt7-15kozak序列，nt16-72κ2信号序列，nt73-666unc5c编码序列，nt667-672xpni限制性位点；

-编码unc5d蛋白的seqidno：8；nt(核苷酸)；nt1-6hindiii限制性位点，nt7-15kozak序列，nt16-72κ2信号序列，nt73-666unc5d编码序列，nt667-672xpni限制性位点；

-编码人igg1fc(铰链+ch2+ch3dna序列，nt7-693)的seqidno：9，其中kpni限制性位点在位置1-6nt上，xbai限制性位点在位置694-699上。

本发明的核酸分子可以是dna分子或rna分子。它们还可以是核酸类似物，诸如寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖-寡核苷酸、lna(锁核酸)分子、pna(肽核酸)分子、gna(乙二醇核酸)分子、tna(苏糖核酸)分子、吗啉代多核苷酸或antagomir(缀合有胆固醇的)核酸分子或其如本领域中已知的任意修饰(关于修饰的实例，参见，例如，us5,525,711,us4,711,955,us5,792,608或ep302175)。本发明的背景中的核酸分子可以是天然存在的核酸残基或人工产生的核酸残基。核酸残基的实例为腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)、黄嘌呤(x)和次黄嘌呤(hx)。在本发明的背景中，胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)可以互换使用，这取决于核酸分子的各自类型。例如，如本领域技术人员所清楚知道的，作为dna的部分的胸腺嘧啶(t)对应于作为对应的转录的mrna的部分的尿嘧啶(u)。本发明的核酸分子可以是单链或双链、线性或环状的，天然或合成的，并且，如果没有另外指明，无任何大小限制。核酸分子还可以包括在本文的下文中进一步描述的启动子。启动子可以是同源的或异源的。在一个具体的实施方案中，本文中提供的核酸分子处于这样的的启动子的控制之下。

通常地，如本文中所用，包含具有本文中提供的序列的核酸序列的多核苷酸还可以是由所述核酸序列组成的多核苷酸。

可将本发明的核酸分子克隆进载体。本领域普通技术人员可参考wo2007/099133，其描述了可用于进行本发明的载体和制备载体的方法及其用途。如本文中所用，术语“载体”具体地指质粒、粘粒、病毒、噬菌体和通常用于遗传工程的其它载体。在优选实施方案中，这些载体适合用于细胞、真核细胞如真菌细胞、微生物的细胞诸如酵母或原核细胞的转化。在特别优选实施方案中，这样的载体适合用于细菌细胞的稳定转化，例如以转录本发明的核酸分子。例如，载体可以是puc18。具体地，wo2007/099133公开了表达基于dcc的融合蛋白的载体，诸如在wo2007/099133的实施例1中被鉴定为7800和7809的载体。本发明从而提供了用于dcc融合蛋白的编码wo2012025618中的seqidno：2、3或4的融合蛋白的载体，或wo2012025618中的dna序列seqidno：1的载体。

本发明还提供了包含编码本文中描述的和提供的融合蛋白的本发明的核酸分子的载体诸如puc18。就unc5而言，本发明因而涉及载体诸如puc18，其包含编码下列的核酸分子：融合在一起的seqidno：1的氨基酸20-217和220-446，或序列seqidno:1；融合在一起的seqidno：2的氨基酸20-215和218-444，或序列seqidno：2；融合在一起的seqidno：3的氨基酸20-217和220-446，或序列seqidno：3；或融合在一起的seqidno：4的氨基酸20-217和220-446，或序列seqidno：4。具体地，本发明提供了载体诸如puc18，其含有核酸分子，所述核酸分子包含seqidno：5的核苷酸序列73-666，或seqidno：6的核苷酸序列73-660，或seqidno：7的核苷酸序列73-666或seqidno：8的核苷酸序列73-666。这些载体还包含seqidno：9的核苷酸序列，特别是核苷酸7-693。通常地，载体能够在真核宿主细胞中表达所述核酸分子。

所提供的载体为表达载体。通常地，表达载体已被广泛地描述于文献中。表达载体可包含选择标记基因和复制起始点(确保在宿主中复制)。表达载体可包含启动子。其还可包含转录终止信号。在启动子与终止信号之间优选存在至少一个限制性位点或多接头，这使得能够插入期望表达的核酸序列/分子。在实施方案中，载体能够在体内表达蛋白质，就是说所述载体，一旦给患者施用，就能够原位表达蛋白质。

应理解，当本文中提供的载体通过利用本领域中已知的表达载体(所述表达载体已包含适合用于本发明的背景(例如本文中描述的unc5融合蛋白的表达)的启动子)来生产时，以这样的方式将核酸分子插入该载体，以便所得的载体优选只包含一个适合用于本发明的背景的启动子。启动子通常可以是异源的或同源的。本文中描述的载体还可包括超过一个启动子，每一个各自的启动子可以是异源的或同源的。本领域普通技术人员知道可如何将这样的插入付诸实施。例如，可在连接之前从核酸构建体或从表达载体切去启动子。

根据本发明的蛋白质优选通过重组方法产生。优选地，蛋白质表达存在于真核细胞中，随后分离多肽，并通常纯化至药学上可接受的纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码其蛋白质的核酸插入表达载体。在适当的稳定的真核宿主细胞如cho细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、hek293细胞、cos细胞中进行表达，并从所述细胞(裂解后的细胞或上清液)回收蛋白质。hek293细胞似乎非常适合用于该目的，并且形成具体的实施方案。

在实施方案中，可将本发明的核酸分子和/或已将本文中描述的多核苷酸克隆进其中的载体转导、转化或转染或以另外的方式引入宿主细胞中。例如，宿主细胞是真核或原核细胞，优选真核细胞。作为非限定性实例，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。本文中描述的宿主细胞意欲特别地用于产生本发明中描述和提供的unc5-融合蛋白。

通常地，上述宿主细胞可以是原核或真核细胞，优选真核细胞，其包含本发明中提供的核酸分子或本文中描述的载体或来源于这样的细胞并且包含本文中描述的核酸分子或载体的细胞。在优选实施方案中，所述宿主细胞以使其包含整合入基因组的本发明的核酸分子的方式包含本发明的核酸分子或本文中描述的载体，即以所述方式利用所述核酸分子或载体进行修饰。例如，本文中描述的这样的宿主细胞可以是人、酵母或真菌细胞。在一个特定的方面，所述宿主细胞能够转录本发明的核酸分子。待用于产生本文中描述的宿主细胞的不同的相应表达系统的实例的概述例如包含于methodsinenzymology153(1987),385-516中,于bitter(methodsinenzymology153(1987),516-544)中，于sawers(appliedmicrobiologyandbiotechnology46(1996),billman-jacobe(currentopinioninbiotechnology7(1996),500-4),hockney(trendsinbiotechnology12(1994),456-463)中以及于griffiths(methodsinmolecularbiology75(1997),427-440)中。可通过标准方法，如例如sambrook和russell(2001),molecularcloning：alaboratorymanual,chspress,coldspringharbor,nyusa；methodsinyeastgenetics,alaboratorycoursemanual,coldspringharborlaboratorypress,1990中描述的方法，利用本发明的核酸分子或本文中描述的载体对宿主细胞进行转化或遗传工程化。

包含本文中提供的核酸分子或本文中描述的载体的宿主细胞可以是hek293细胞或hek293-freestyle细胞(人胚肾细胞系293,invitrogen)。本发明从而提供了用于产生如本文中提供和描述的dcc和unc5融合蛋白的方法。该方法包括特别地如本文中所述的在适当的宿主细胞中表达如本文中提供和描述的核酸分子，和从所述细胞或细胞培养上清液回收dcc或unc5融合蛋白的步骤。

本发明涉及包含netrin-1干扰药物的组合物。其特别地涉及包含本文中提供的dcc和/或unc5融合蛋白或编码dcc和/或unc5融合蛋白的体内表达载体的组合物。其还特别地涉及包含抗-netrin1抗体的组合物。这些组合物还可包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。这些组合物可用作药物共同成分(co-ingredient)或药物并且形成药物组合物或药剂，以与化疗药物或治疗组合地用于相同患者。

在实施方案中，本文中提供的dcc和/或unc5融合蛋白或编码dcc和/或unc5融合蛋白的体内表达载体以及化疗药物与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂存在于相同的组合物中。

在另一个实施方案中，以分别的药物形式提供它们。这形成包含化疗药物和netrin-1干扰药物(以用于给患者同时地、分别地或相继地施用)的组合物或部件的试剂盒。

在治疗、使用的方法以及使用的组合物的实施方案中，施用是相继的。在优选实施方案中，首先施用化疗药物，随后施用netrin-1干扰药物。两个施用之间的间隔可以为至少5、10、15、20或24小时，优选24至96小时，更优选24至72小时，特别是24至48小时，例如24小时。在实施方案中，仅在化疗药物施用后第二天施用所述netrin-1干扰药物。

这些不同的药物形式可以以足够的量用于本发明的治疗方法。

适合的药物载体的实例在本领域中是公知的。它们包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳液，诸如油/水乳液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包含这样的载体的药物组合物可通过公知的常规方法来配制。

可以以适合的剂量给受试者施用这些药物组合物，即对于netrin-1干扰药物，至少1mg/kg的其中癌症将被治疗的受试者的体重，例如约10mg/kg的所述受试者的体重至约100mg/kg的所述受试者的体重。可以以常用剂量，或以相对于常用剂量减少的剂量施用化疗药物，只要组合具有协同效力。例如，将化疗药物的剂量减少10、20、30、40、50％或更多。组合物的施用可通过不同方式，例如通过口服(例如丸剂、片剂、口腔、舌下、崩解剂、胶囊剂、薄膜、液体溶液或悬浮液、粉剂、固体晶体或液体)、通过直肠(例如栓剂、灌肠剂)、通过注射(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、皮内)，通过吸入(例如，支气管内)、局部、经阴道、外表皮(epicutaneously)或鼻内方式来实现或施用。剂量方案将由主治医生和临床因素来确定。如在医学领域中公知的，用于任一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、给药时间和途径、总体健康状况和同时施用的其它药物。

本发明的组合物和药物组合物可进行局部或全身性施用。施用将优选是静脉内或皮下施用。还可例如通过对内部或外部靶部位的生物弹道递送或通过到达动脉中的部位的导管将组合物和药物组合物直接施用至靶部位。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油，以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些电解质补充剂)等。还可存在防腐剂和其它添加剂，诸如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，还预期了低于或高于上述示例性范围的剂量，尤其是考虑到上述因素。

如已提及的，本发明涉及用于治疗过表达netrin-1的癌症的药物组合物。

癌症的一些实施方案包括转移性乳腺癌、非小细胞肺癌、侵袭性成神经细胞瘤、胰脏腺癌、原发黑素瘤(n＝7)、黑素瘤转移(n＝6)、卵巢癌、成胶质细胞瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、侵袭性b细胞淋巴瘤、肉瘤、肾腺癌、头颈癌、睾丸癌(例如胚胎性癌、畸胎瘤、卵黄囊瘤)、肾癌、胃癌、子宫癌。癌症的例子列于下文中。

确定给定的细胞是否在表面上表达依赖性受体dcc和/或unc5和/或是否显示netrin-1基因表达的显著上调的方法在本领域是公知的，并且包括但不限于facs(荧光激活细胞分选)的ihc(免疫组织化学)、定量pcr(例如利用六聚物引发的cdna)或可选择地与基于生色染料的蛋白质检测技术(如银染或考马斯蓝染色)或基于荧光和基于发光的对于溶液中和凝胶、印迹和微阵列上的蛋白质的检测方法诸如免疫染色配对的western印迹，以及免疫沉淀、elisa、微阵列和质谱法。在本发明的背景中，待治疗的癌症的实例列于本文中，包括任何所述癌症的难治性形式。

附图说明

现通过参考附图以非限定性方式更详细地描述本发明，其中：

图1-4：netrin-1及其依赖性受体在多柔比星处理后被上调。

图1：利用2μm多柔比星处理肺癌细胞系a549和h460进行24小时，通过定量pcr评价利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)标准化和和与未处理细胞相比较的netrin-1基因表达。多柔比星处理在两种细胞系中都诱导netrin-1基因表达的强诱导。结果代表5个独立实验的平均值。进行mann–whitney检验，并指定p值。doxor，多柔比星；act.d，放线菌素d；nt，未处理的。

图2：利用1μm和2μm多柔比星处理a549细胞48小时，通过western印迹评价netrin-1蛋白水平。netrin-1蛋白(针对β-肌动蛋白进行标准化)在多柔比星处理后被强烈积累。

netrin-1的上调在用2μm多柔比星处理48小时后通过免疫荧光染色来确认。利用hoescht染色(呈蓝色)对细胞核进行复染。(未显示)

图3：在多柔比星处理后测量a549细胞的netrin-1受体基因表达。unc5a、unc5b和dcc基因表达被多柔比星显著上调，而unc5c和unc5d未显示显著的变化。进行mann–whitney检验，并指定p值。doxor，多柔比星；act.d，放线菌素d；nt，未处理的。

图4：多柔比星诱导的netrin-1上调直接依赖于基因转录。利用2μm多柔比星处理a549细胞，并用强效rna聚合酶抑制剂放线菌素d(100μg/ml)处理细胞24小时。在多柔比星处理后放线菌素d强烈抑制netrin-1上调(doxo.)。进行mann–whitney检验，并指定p值。doxor,多柔比星；act.d，放线菌素d；nt，未处理的，doxo.，多柔比星+放线菌素d。

图5-9：在用细胞毒性药物处理后，netrin-1及其受体表达在几个癌细胞系和卵巢肿瘤中增加。

图5-8：netrin-1(ntn1)、dcc、unc5b和unc5d的表达水平通过定量rt-pcr来测量。取决于针对每一个细胞系和药物处理计算的ic50值，以不同的药物浓度，用经典的化疗药物(多柔比星、顺铂、5-氟尿嘧啶和taxol)处理乳腺癌(hbl100)、肺癌(a549，h322，h358)、结肠癌(hct116，hct8)、胰腺癌(miapaca-2，panc-1)、成神经细胞瘤(sh-sy5y，imr32)、成胶质细胞瘤(sf767，u87mg)和卵巢癌(pa-1，tov-112d，nih-ovcar3)细胞系进行24小时。将netrin-1及其受体基因表达与对照未处理的细胞进行比较，如下对变化进行评分：-，无变化或下调；+，为对照2至4倍的基因表达；++，为对照4至100倍；+++，为对照100倍以上；n.d.，不能确定；n.e.，不表达。对于高于对照2倍的基因表达变化，确定为阳性细胞系。灰色框表示抗(即，在用最大药物浓度处理后超过50％的细胞存活)癌细胞系。

图9：netrin-1在化疗治疗后在卵巢肿瘤患者中过表达。在从卡铂/taxol处理的化疗周期之前和之后获得的患者的肿瘤的卵巢活组织检查提取的rna中分析netrin-1水平(利用用作管家基因的gapdh进行标准化的)。计算每一组的netrin-1的中值水平。

图10-15：netrin-1沉默使a549细胞对多柔比星致敏，并且诱导通过unc5b受体的凋亡细胞死亡。

图10-12：netrin-1沉默使肿瘤细胞对多柔比星致敏。用打乱的sirna(sictrl，sirna通用阴性对照#1,sigma-aldrich)或用靶向netrin-1的特异性sirna(sinet，序列seqidno：10：aagcuggacgcagcaugaugc)转染a549细胞。转染后24小时，用浓度递增的多柔比星处理细胞。在处理后48小时评价利用在材料和方法部分中描述的toxilight试剂盒测量的细胞死亡速率(图10)和细胞存活(图11)。将结果针对对照未处理的细胞进行标准化。虽然打乱sirna转染的细胞显示对多柔比星处理的一般抗性，但netrin-1沉默在多柔比星存在的情况下强烈诱导细胞死亡和减少细胞存活。通过如材料和方法部分中描述的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)排除测量的细胞死亡百分比的评价(图12)确认了netrin-1sirna使a549细胞对0.5μm和2μm多柔比星的处理致敏。*，p<0.05；**，p<0.01。doxor，多柔比星。

图13-14：netrin-1沉默与多柔比星处理组合触发细胞凋亡。如(图10-12)中一样转染a549细胞，并用指定的多柔比星浓度处理24小时。如材料和方法部分所述评价针对未处理的细胞标准化的活性半胱天冬酶-3(图13)和dna片段化(图14)。虽然多柔比星不能诱导利用打乱sirna(sictrl)转染的a549细胞的细胞凋亡，但针对netrin-1沉默的细胞显示细胞凋亡率的强烈增加。*，p<0.05；**，p<0.01。doxor，多柔比星。

图15：netrin-1沉默与多柔比星处理的组合通过netrin-1受体unc5b诱导细胞死亡。用打乱sirna(sictrl)、netrin-1特异性sirna(sinet)、unc5b特异性sirna(siunc5b)以及用netrin-1与unc5b-靶向sirna转染a549细胞。转染后24小时，用指定的多柔比星浓度处理细胞48小时，利用toxilight测量细胞死亡率，将其针对对照未处理的细胞进行标准化。虽然netrin-1沉默(sinet)使a549细胞对多柔比星处理致敏(相较于sictrl转染的细胞)，但netrin-1和unc5b(sinet+siunc5b)的同时沉默逆转由sinet和多柔比星处理诱导的细胞死亡。*，p<0.05；**，p<0.01。doxor，多柔比星。

图16-21：对netrin-1与其受体相互作用的干扰使肿瘤细胞对细胞毒性药物致敏。

图16-17：在2μg/mltrap-netrin^dcc(图16)和trap-netrin^unc5a(图17)存在或不存在的情况下，用指定的多柔比星浓度处理a549细胞48小时。利用多柔比星和两种重组融合蛋白的共处理相较于多柔比星-和pbs-处理的细胞增加细胞死亡率，通过toxilight测量所述细胞死亡率。将结果针对未处理的细胞进行标准化。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。doxor，多柔比星。

图18-19：在指定浓度的5-氟尿嘧啶(5-fu,图18)或顺铂(图19)存在的情况下，利用pbs或2μg/mltrap-netrin^unc5a处理a549细胞。共处理后48小时，通过mts测量细胞存活，将其针对未处理的细胞进行标准化。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。doxor，多柔比星。

图20-21：在指定浓度的5-fu(图20)或多柔比星(图21)存在的情况下，利用pbs或2μg/mltrap-netrin^unc5a处理miapaca细胞。共处理后48小时，通过mts测量细胞存活，将其针对未处理的细胞进行标准化。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。doxor，多柔比星。

图22：netrin-1干扰在临床前动物模型中增强多柔比星的抗癌作用。将a549细胞移入7周龄雌性无胸腺裸鼠中。一旦肿瘤达到100mm³的体积，就用trap-netrin^unc5a(20mg/kg),多柔比星(2mg/kg)或用两种药物组合，每周2次腹膜内处理小鼠，进行2周。作为对照，用pbs注射小鼠。直方图代表作为异种移植后天数的函数的每一组的肿瘤体积生长。虽然两种药物单独都不能减小肿瘤生长，但trap-netrin^unc5a与多柔比星处理的组合显著减小肿瘤生长。

图23-27-细胞毒性药物处理后的netrin-1受体基因表达。

图23-24：如图5中所述处理癌细胞，在药物处理后评价unc5a和unc5c基因表达。评分系统与图5中使用的一样。两种受体在处理后，相较于未处理的细胞都显示不显著的表达水平变化。

图25-27：卡铂/taxol处理之前和之后患者的肿瘤的卵巢活组织检查中的netrin-1受体表达。计算每一组的中位值。unc5b(图25)、unc5d(c＝图26)和dcc(图27)基因表达在化疗治疗后显示相似的上调。将基因表达水平针对用作管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)进行标准化。

图28：细胞对细胞毒性药物的敏感性。对指定的细胞系的响应顺铂、5-氟尿嘧啶(5fu)、多柔比星和紫杉醇(taxol)的抑制浓度(ic)ic10、ic30和ic50通过mts测定来进行测定。ic50值通过双倒数图的线性回归来计算。对于抗癌细胞系(即，在利用最大药物浓度icmax处理后超过50％的细胞存活)(由灰色框表示)，计算icmax和百分率。

图29：表达质粒np-x的图谱

序列表：

具体实施方式

i.材料和方法：

1.允许评估netrin-1表达或过表达的定量rt-pcr:

按照制造商的方案使用rnaii试剂盒(machereynagel,düren,germany)提取总rna。利用cdnasynthesis试剂盒(biorad)进行rt-pcr反应。使用下列程序反转录1μg总rna：在25℃进行5分钟，在42℃进行30分钟以及在85℃进行5分钟。对于表达研究，在2.0装置(rocheappliedscience)中，使用lightcyclerfaststartdnamastersybrgreeni试剂盒(rocheappliedscience)扩增靶转录物。将靶基因的表达针对用作管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)和磷酸甘油酯激酶(pgk)基因进行标准化。使用比较ct法计算针对管家基因标准化的靶转录物的量。进行验证实验，以证明靶基因和管家基因的效率大致相等。引物的序列如下：

正向引物：aaaagtactgcaagaaggactatgcseqidno:11。

反向引物：ccctgcttatacacggagatgseqidno:12。

2.人癌细胞中的netrin-1蛋白定量:

对于免疫印迹分析，通过在改良ripa缓冲液(50mmtris-hcl,ph7.5,150mmnacl,1％np-40,0.5％脱氧胆酸钠,0.1％sds,1mmedta,蛋白酶抑制剂混合物和5mmdtt)中超声处理裂解细胞，并在4℃温育1小时。通过离心(10.000g15’，4℃)沉淀细胞碎片，随后将蛋白质提取物(200μg/泳道)加载至10％sds-聚丙烯酰胺凝胶上，随后印迹至pvdf板(milliporecorporation,billerica,ma,u.s.a.)上。用pbs/0.1％tween20(pbs-t)中的10％脱脂乳和5％bsa封闭滤膜过夜，随后用兔多克隆α-netrin-1(稀释度1:500，克隆h104,santacruzbiotechnology,santacruz,ca,usa)和小鼠单克隆β-肌动蛋白(santacruzbiotechnologies)抗体温育2小时。在用pbs-t洗涤3次后，将滤膜用适当的缀合有hrp的二抗(1:10000,jacksonimmunoresearch,suffolk,uk)温育1小时。使用westdura化学发光系统(pierce,rockford,il,u.s.a.)进行检测。

对于免疫荧光研究，分离细胞，利用细胞离心涂片器(shandoncytospin3,thermoscientific)将细胞离心在盖玻片上，用4％(v/v)多聚甲醛将细胞固定30分钟。随后将细胞在0.2％tritonx-100/pbs中渗化30分钟，将其于含有2％bsa和2％常规驴血清的pbs中进行封闭。使用大鼠单克隆α-netrin-1抗体(r&dsystems)和alexa-488驴抗-大鼠igg(molecularprobes)对内源netrin-1进行染色。使用hoescht染色(sigma)对细胞核进行复染。

3.细胞死亡测定和常规药物处理:

通过不同的方法评价细胞死亡。对于总细胞死亡测定，将5*10³个细胞/孔在96孔板中生长于低血清培养基(serum-poormedium)中，用多柔比星处理所述细胞。48小时后，按照制造商的说明书，使用生物发光细胞毒性测定toxilight(lonza,basel,switzerland)评价细胞死亡。或者，通过吖啶橙和dapi染色，使用nucleocounternc-3000系统(chemometeca/s,denmark)测量细胞死亡百分比。简而言之，将5*10⁴个细胞涂板在12孔板中，用多柔比星进行处理。处理后48小时，收集漂浮细胞和贴壁细胞，将其悬浮于pbs中，并与两种不同的染料吖啶橙(对细胞的整个群体进行染色)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)(对无活力的细胞进行染色)混合。随后按照制造商的操作说明书，利用nucleocounternc-3000测定细胞死亡率(测量为总细胞群体中的dapi阳性细胞)。在96孔板中通过mts测定(celltiter96aqueousonesolutioncellproliferationassay,promega)测量细胞存活。按照制造商的程序对在低血清培养基中生长16小时随后用指定的多柔比星浓度在无血清培养基中处理48小时的3*10³个细胞进行mts测定。按照制造商的说明书，使用半胱天冬酶3/cpp32fluorimetricassay试剂盒(gentaurbiovision,brussel,belgium)如先前所述(21)进行半胱天冬酶-3活性测定。根据在荧光分光计(405nm/510nm,infinitef500,tecan,switzerland)上的1小时动力学循环读数计算半胱天冬酶活性(活性/分钟/微克的蛋白质)。

4.候选药物:

trap-netrin^dcc和trap-netrin^unc5a分别是融合于igg1fc部分的dcc胞外域的第5纤连蛋白结构域和unc5a胞外域的2个免疫球蛋白(ig1-ig2)结构域。分别在293-free-style和cho-free-style中产生这两种重组蛋白。

已使用质粒7800，按wo2012025618的实施例1-4产生trap-netrin^dcc。相似的融合蛋白可使用也在wo2012025618的这些实施例中描述的载体7809来产生。

已使用在5下描述的方法产生trap-netrin^unc5a。

5.trap-netrin^unc5a(unc5a-fc)、trap-netrin^unc5b(unc5b-fc)和trap-netrin^unc5c(unc5c-fc)的产生

质粒构建

将标准方法用于操作dna，如sambrook,j.等人，molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中描述的。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。通过基因合成制备所需基因区段。将合成的基因片段克隆进指定的表达载体。亚克隆的基因片段的dna序列通过dna测序来验证。

表达质粒示于图11中，命名为ps-unc5-fc-np-x(ps用于肽信号，x可以是v-01(对于unc5a)、v-02(对于unc5b)和v-03(对于unc5c))。

该载体是例如用于人工igfc融合蛋白的瞬时表达的表达质粒，在所述融合蛋白中，通过引入2个氨基酸的人工接头序列将人unc5a、b或c受体的ig样结构域融合于人igg1抗体的铰链区(fc恒定区；铰链-ch2-ch3)。

化学基因合成用于制备在5'和3'末端分别侧翼连接有唯一的hindiii和kpni限制性内切核酸酶位点的672(seqidno：5,7)或676bp(seqidno：6)的dna区段。类似地，制备了在5'和3'末端分别侧翼连接有唯一的kpni和xbai限制性内切核酸酶位点的699bp(seqidn0：9)的dna区段。编码在n末端位置具有κ2信号肽的所需unc5融合蛋白(unc5-fc融会蛋白)(seqidno：1、2、3)的开放阅读框架(orf)的dna区段通过连接上述两个dna区段来获得。将基因在表达载体(np-v)中引入至cmv-ie的立即启动子和增强子he1以及牛生长激酶(bgh)多腺苷酸化位点。

unc5融合蛋白(unc5-fc融合蛋白)包含如下序列：鼠信号序列(seqidno：1、2或3的氨基酸1至19)、人unc5受体的两个免疫球蛋白样结构域(unc5a：seqidno：1的氨基酸20至217；对应于氨基酸序列uniprotid：q6zn44的unc5a的氨基酸34至240；unc5b：seqidno：2的氨基酸20至215；对应于氨基酸序列uniprotid：q8izj1的unc5b的氨基酸49至244；unc5c：seqidno：3的氨基酸20至217；对应于氨基酸序列uniprotid：o95185的unc5c的氨基酸61至258)、2个氨基酸的接头(来自克隆位点；seqidno：3的氨基酸199至200)和人igg1抗体fc恒定区(seqidno：1或3的氨基酸220至446；seqidno：2的氨基酸218至444)。成熟unc5-fc融合蛋白不存在信号肽。

瞬时转染、表达和纯化

通过瞬时转染在8％co2，37℃下悬浮生长在293freestyle培养基(invitrogen)中的freestylehek293细胞(invitrogen)来获得重组蛋白质。对于转染，按照制造商的说明书使用试剂(invitrogen)。转染后3天，收获上清液并通过离心(以200g进行10分钟)进行澄清。按照制造商的说明书，使用蛋白gsepharose4ff纯化fc融合蛋白。在0.1mglycinph2.8中进行洗脱。将洗脱物于1mtris-hclph9.0中进行中和，并且针对pbs透析过夜。在变性和非变性条件下使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后进行考马斯蓝染色或在硝酸纤维素转移(使用抗-人igg(fc特异性)-hrp抗体,sigma)后进行western印迹分析来进行最后的分析。

也通过瞬时转染在8％co2，31℃下悬浮生长在化学成分明确的、无动物组分的、无血清培养基中的freestylecho-s细胞(中国仓鼠卵巢，invitrogen)来获得重组unc5a-fcas。对于转染，按照制造商的说明书使用freestyletmmax试剂(invitrogen)。在freestylecho-s细胞中，在瞬时表达下，unc5a融合蛋白(seqidno：1)可以以至少300mg/l的速率高效地进行分泌。通过离心收获上清液，随后进行无菌过滤(0.2μm)。使用bioradexperion系统测定上清液中的unc5a-fc的浓度。随后除在0.1mglycinehclph3.0中进行洗脱外，按照制造商的说明书通过阳离子交换层析，随后通过蛋白a亲和层析(pallproteinaceramichyperd)纯化fc融合蛋白。利用1mtris-hclph9中和洗脱物，将其针对20mm柠檬酸盐，134mmnacl,ph6.2透析过夜。利用bio-radexperion系统就数量、尺寸验证和污染物的存在进行最后的分析。

在下列实验中，已使用cho-s细胞中产生的unc5a-fc。

6.动物模型：

7周龄(20-22g体重)雌性无胸腺nu/nu小鼠获自charlesriver动物设施。将小鼠饲养在无菌滤盖饲养笼中，并在无病原体动物设施中进行维持。通过s.c.注射200μlpbs中的10⁷个细胞来将a549细胞植入至小鼠右胁腹中。一旦建立肿瘤(v≈100mm³)，就用netrin-1干扰药物和/或细胞毒性药物处理小鼠2周。利用测径器测量肿瘤尺寸。利用公式v＝0.5*(长度*宽度²)计算肿瘤体积。在处理结束时，收获肿瘤，称重，将其包埋在7.5％明胶–0.12m蔗糖中，切成20μm的切片。

7.统计分析:

报导的数据为至少3个独立测定的平均值±s.d.，每一个测定以一式三份进行。除非另外指定，否则通过非参数mann-whitneyu检验进行统计分析。

ii.结果和讨论

1.netrin-1及其受体在常规化疗后在肿瘤细胞中被上调

我们首先通过定量rt-pcr分析两个肺癌细胞系a549和h460中响应多柔比星的的netrin-1水平。如图1中所示，netrin-1mrna水平在用2μm多柔比星处理后，在两个细胞系中都得以极大地升高(分别地430和300倍)。该mrna的增加与netrin-1蛋白表达的强劲增加(图2和免疫荧光(未显示))相关。

随后，我们分析响应多柔比星导致的netrin-1受体dcc和unc5h–unc5a、unc5b、unc5c和unc5d的水平。如图3中所示，dcc、unc5a、unc5b和unc5d的水平在利用多柔比星处理的a549细胞中随netrin-1水平而升高。该升高对于unc5b受体达到44倍。为了监测该netrin-1及其受体的上调是否与增加的基因转录相关，在rna聚合酶抑制剂放线菌素d存在的情况下利用多柔比星处理a549细胞。如图4中所示，放线菌素d完全阻止多柔比星介导的netrin-1上调，从而支持常规治疗剂通过增强的基因转录触发netrin-1及其受体的增加的观点。

为了研究netrin-1及其受体的上调是限制于多柔比星还是对化疗药物的一般反应，通过在一小组响应各种常规化疗药物(诸如多柔比星、5-氟尿嘧啶(5fu)、紫杉醇(taxol)和顺铂)的15个癌细胞系中通过定量rt-pcr分析netrin-1水平。在利用对应于每一种药物针对每一个细胞系测定的ic10、ic30或ic50的3个浓度处理后，分析netrin-1水平(图28)。在表现出抗特定药物的细胞系(图28)中，将对应于最大有效浓度(icmax)的浓度用于监测netrin-1水平。如图5-8中所示，多柔比星和5fu分别在60％和36％的癌细胞系中触发显著(即高于对照>2倍)的netrin-1的增加。利用taxol和顺铂的处理分别地仅与20％和21％的细胞系中的netrin-1上调相关。化疗药物处理后的netrin-1上调不是肿瘤类型特异性的，因为在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和卵巢癌的至少一个细胞系中以及在成神经细胞瘤和胶质母细胞瘤细胞系中看到netrin-1上调。我们未能检查到netrin-1上调与化学抗性之间的任何相关性，因为在抗性和敏感性细胞系中都检测到netrin-1上调，以及因为一些抗性细胞系未显示netrin-1上调(图5-8)。

还在15个癌细胞系中研究了netrin-1依赖性受体响应这些细胞毒性剂的表达(图5-8)。与netrin-1反应类似，多柔比星似乎具有最大效应，因为其与分别地87％、80％和67％的筛选的细胞系中的dcc、unc5b和unc5d的上调相关。在筛选的癌细胞系中显示总体低表达的dcc是显示最大范围的上调的netrin-1受体，因为dcc表达在36％、43％和53％的细胞系(分别地响应顺铂、5fu和taxol)中强烈增加。netrin-1受体unc5a和unc5c的水平在大多数筛选的细胞系中大体上不受利用细胞毒性药物的处理影响(图23-24)。总之，这些数据支持netrin-1及其受体的上调通常响应常规药物治疗而发生的观点。

我们最后分析利用卡铂/taxol治疗之前和之后的患者的卵巢癌样品中的netrin-1和受体水平。如图9中所示，netrin-1mrna在化疗后被上调。此外，dcc、unc5b和unc5d水平也受卡铂/taxol处理影响(图25-27)。

2.netrin-1干扰增强细胞毒性药物诱导的细胞死亡

netrin-1及其受体在常规药物处理后被上调的事实表明存活对netrin-1的依赖性在化疗治疗的癌症细胞中被放大。因此，我们首先通过sirna策略分析在netrin-1沉默后多柔比星诱导的细胞死亡。随后用netrin-1sirna转染a549细胞，然后用递增浓度的多柔比星进行处理。netrin-1的沉默与多柔比星诱导的细胞死亡的显着增强相关，如通过细胞通透性的丢失(图10)、细胞存活(图11)、dapi排除(图12)、半胱天冬酶激活(图13)或dna片段化(图14)的测量显示的。为了确定该增加的敏感性是否因未结合的netrin-1依赖性受体的促细胞凋亡参与而引起，在unc5b(在多柔比星处理后a549细胞中表达的主要netrin-1受体)沉默的背景中进行类似实验。如图15中所示，unc5b的沉默与由netrin-1沉默和多柔比星处理诱导的细胞死亡的增强的抑制相关。

因此，我们采用治疗上更相关的方式观察netrin-1干扰的可能类似增强作用。已显示两种候选药物trap-netrin^dcc和trap-netrin^unc5a(其分别为dcc或unc5a的fc稳定化的胞外域)在体外触发表达netrin-1的肿瘤细胞的死亡和在植入小鼠模型中触发肿瘤生长抑制(未显示)。如图16-17中所示，这两个候选药物强烈增强多柔比星诱导的a549细胞的细胞死亡。由于netrin-1和受体在5fu和顺铂处理后也被上调(图5-8)，因此我们进行了trap-netrin^unc5a与5fu和顺铂的类似组合。在利用5fu或顺铂和trap-netrin^unc5a的共处理后观察到媲美的对细胞死亡的增强作用(图18-19)。类似地，在其中已显示5fu和多柔比星上调netrin-1及其受体的胰腺癌细胞系miapaca中，5fu或多柔比星与trap-netrin^unc5a的共处理促进细胞死亡(图20-21)。

3.netrin-1干扰在癌症的临床前动物模型中增强细胞毒性药物的抗癌作用

我们随后评估了上面看到的体外效应是否能够在治疗的角度上被转化至体内。将a549细胞植入裸鼠，每周2次通过i.p.注射媒介物或单独的20mg/kg的trap-netrin^unc5a或与2mg/kg的多柔比星组合的20mg/kg的trap-netrin^unc5a来治疗具有可触肿瘤的动物。按照这些施用方案和剂量使用的单一试剂-trap-netrin^unc5a或多柔比星治疗与可检测的但较弱的肿瘤生长抑制作用相关(图22)。然而，多柔比星与trap-netrin^unc5a的共治疗与肿瘤生长的强力和长期的抑制相关。总之，这些数据支持组合基于netrin-1干扰的治疗与常规化疗与与协同抗癌作用有关的观点。

4.组合netrin-1干扰和细胞毒性药物是有前景的治疗方法.

我们在此处显示，癌细胞系响应利用细胞毒性药物的治疗上调netrin-1的表达。此处测试的细胞毒性药物(其包括多柔比星、顺铂、5fu和紫杉醇(taxol))通常在辅助和高级背景下用于患有非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌和卵巢癌的患者的管理。此外，通过使用一个到目前为止受限的小组的人样品，我们已经表明，利用卡铂/taxol治疗的患者的原发性卵巢肿瘤显示相较于治疗前的相同肿瘤的netrin-1水平的升高。即使在细胞培养物中该netrin-1上调取决于使用的药物和癌症细胞类型而在动力学和幅度上有所不同(图1)，但已知这些药物影响不同的细胞机制的事实支持这样的观点，即netrin-1上调是是一般存活应激反应而非受特定化疗药物影响的的特定途径的特定改变。因此吸引人的是推测该netrin-1上调可以是由癌细胞响应这些药物而所采用的生存机制。

虽然该netrin-1的上调的机制仍有待确定，但其可具有显著的治疗效果。事实上netrin-1干扰药物目前正处于临床前开发中；这些化合物与常规细胞毒性剂的组合可证明是协同的。我们已表明，netrin-1的表达在来自乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和非小细胞肺癌患者的样品中被上调，并且干扰netrin-1自分泌/旁分泌环路在几个动物模型中触发癌细胞的细胞凋亡。此外，此处提出的数据表明，甚至更大组的患者可从单独的或与细胞毒性剂组合的netrin-1靶向剂获益。基于我们对肿瘤携带小鼠的体内观察，该组合未表现相较于单独的细胞毒性剂增强毒性。此处显示的临床前数据支持这样的观点，即组合常规药物+netrin-1干扰可在使用降低浓度的常规药物的情况下产生导致增强的效力。综上所述，这些数据支持在与常规化疗组合的早期临床试验中测试基于netrin-1干扰的疗法的原理。

5.过表达netrin-1和表达dcc和/或unc5a和/或b和/或c和/或d的癌症的实例。

给出了已针对其定量了netrin-1及其受体的表达的每一种类型的癌症的netrin-1过表达病例的百分比。

-60％的转移性乳腺癌(fitamant等人，pnas2008)，

-47％的非小细胞肺癌(delloye-bourgeois等人，jnci2009)，

-38％的侵袭性成神经细胞瘤(delloye-bourgeois等人，j.exp.med.2009)，

-61％的胰脏腺癌(link等人，annalsofchir.onco.2007；dumartin等人，gastro2010)，

-100％的原发性黑素瘤(n＝7)、黑素瘤转移(n＝6)(kaufmann等人，cellularoncology2009)，

-76％的卵巢癌(panastasiou等人，oncotarget2011)，

-65％的胶质母细胞瘤，

->60％的急性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病，

->50％的侵袭性b细胞淋巴瘤，

-30％的肉瘤，

-40％的肾腺癌，

-22％的头颈癌，

-睾丸癌(36％的胚胎性癌，50％的畸胎瘤，100％的卵黄囊瘤)

-50％的肾癌，

-26％的胃癌，

-19％的子宫癌。

参考资料

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21.paradisi,a.etal.2008.gastroenterology135:1248-1257.

序列表

<110>netrispharma

<120>利用netrin-1干扰药物和化疗药物的联合治疗

<130>bet13l2488

<150>ep12306100.4

<151>2012-09-12

<150>us61/700158

<151>2012-09-12

<160>14

<170>patentinversion3.5

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<212>prt

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<220>

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115120125

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<220>

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valpheileasnvalthrargglnglnvalgluaspphehisglypro

859095

gluasptyrtrpcysglncysvalalatrpserhisleuglythrser

100105110

lysserarglysalaservalargilealatyrleuarglysasnphe

115120125

gluglnaspproglnglyarggluvalproilegluglymetileval

130135140

leuhiscysargproprogluglyvalproalaalagluvalglutrp

145150155160

leulysasnglugluproileaspsergluglnaspgluasnileasp

165170175

thrargalaasphisasnleuileileargglnalaargleuserasp

180185190

serglyasntyrthrcysmetalaalaasnilevalalalysargarg

195200205

serleuseralathrvalvalvaltyrglythrasplysthrhisthr

210215220

cysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalphe

225230235240

leupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrpro

245250255

gluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluval

260265270

lyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthr

275280285

lysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalserval

290295300

leuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscys

305310315320

lysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileser

325330335

lysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupropro

340345350

serarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuval

355360365

lysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasngly

370375380

glnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspserasp

385390395400

glyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrp

405410415

glnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhis

420425430

asnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>5

<211>672

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>unc5adna序列

<400>5

aagcttgccgccaccatggacttcggcctgcggctgatcttcctggtgctggtgctgaag60

ggcgtgctgtgcctgccccacttcctggtggaacccgaggacgtgtacatcgtgaagaac120

aagcccgtgctgctggtgtgcaaggccgtgcccgccacccagattttcttcaagtgcaac180

ggcgagtgggtgcgccaggtggaccacgtgatcgagagaagcaccgacggcagcagcggc240

ctgcccacaatggaagtgcggatcaacgtgtcccggcagcaggtggaaaaggtgttcggc300

ctggaagagtactggtgccagtgcgtggcctggtccagcagcggcaccaccaagagccag360

aaggcctacatccggatcgcctacctgcggaagaacttcgagcaggaacccctggccaaa420

gaggtgtccctggaacagggcatcgtgctgccctgcagaccccctgagggcattccccct480

gccgaggtggaatggctgcggaacgaggacctggtggaccccagcctggaccccaatgtg540

tacatcacccgcgagcacagcctggtggtgagacaggcccgcctggccgacaccgccaac600

tacacctgtgtggccaagaacatcgtggccagacggcgctctgcctctgccgccgtgatc660

gtgtacggtacc672

<210>6

<211>666

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>unc5bdna序列

<400>6

aagcttgccgccaccatggacttcggcctgcggctgatcttcctggtgctggtgctgaag60

ggcgtgctgtgctactttctgcaagaaccccaggacgcctacatcgtgaagaacaagccc120

gtggaactgcggtgccgggccttccctgccacccaaatctacttcaagtgcaacggcgag180

tgggtgtcccagaacgaccacgtgacccaggaaggcctggacgaggccacaggcctgaga240

gtgcgcgaggtgcagatcgaggtgtcccggcagcaggtggaagaactgttcggcctggaa300

gattactggtgccagtgcgtggcctggtctagcgccggcaccaccaagagcagacgggcc360

tacgtgcggatcgcctacctgcggaagaacttcgaccaggaacccctgggcaaagaggtg420

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gtggaatggctgaagaacgaggacgtgatcgaccctacccaggataccaacttcctgctg540

accatcgaccacaacctgatcatccggcaggcccggctgagcgacaccgccaattacacc600

tgtgtggccaagaacatcgtggccaagcggcggagcaccaccgccaccgtgatcgtgtac660

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<210>7

<211>672

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>unc5cdna序列

<400>7

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ggcgtgctgtgcctgccccacttcctgatcgagcccgaagaggcctacatcgtgaagaac120

aagcccgtgaacctgtactgcaaggccagccccgccacccaaatctacttcaagtgcaac180

agcgagtgggtgcaccagaaagaccacatcgtggacgagcgggtggacgagacaagcggc240

ctgatcgtgcgcgaggtgtccatcgagatcagccggcagcaggtggaagaactgttcggc300

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aaggcctacgtgcggatcgcctacctgagaaagaccttcgagcaggaacccctgggcaaa420

gaggtgtccctggaacaagaagtgctgctgcagtgcagaccccccgagggaatccccgtg480

gccgaggtggaatggctgaagaacgaggacatcatcgaccccgtggaagatcggaacttc540

tacatcaccatcgaccacaacctgatcatcaagcaggcccggctgagcgacaccgccaac600

tacacctgtgtggccaagaacatcgtggccaagcggaagtccaccaccgccaccgtgatc660

gtgtacggtacc672

<210>8

<211>672

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>unc5ddna序列

<400>8

aagcttgccgccaccatggacttcggcctgcggctgatcttcctggtgctggtgctgaag60

ggcgtgctgtgcctgccccacttcatcgaagagcccgacgacgcctacatcatcaagagc120

aaccccatcgccctgcgctgcaaggcccgccccgccatgcagattttcttcaagtgcaac180

ggcgagtgggtgcaccagaacgagcacgtgagcgaggagaccctggacgagagcagcggc240

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cccgaagactactggtgccagtgcgtggcctggtcccacctgggcaccagcaagagccgg360

aaggccagcgtgcggatcgcctacctgcggaagaacttcgagcaggacccccagggccgg420

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gccgaggtggaatggctgaagaacgaggagcccattgacagcgagcaggacgagaatatt540

gacacccgcgccgaccacaatctgattattagacaggcccgcctgagcgacagcggcaac600

tacacctgtatggccgccaacatcgtggccaagcggcgctctctgtctgccaccgtggtg660

gtgtacggtacc672

<210>9

<211>699

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人igg1fc编码序列

<400>9

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gtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtac180

gtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaacagc240

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tacaagtgcaaagtctccaacaaggccctgcctgcccccatcgagaaaaccatcagcaag360

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gtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaattacaagaccaccccccctgtgctg540

gacagcgacggctcattcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagccggtggcag600

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aagtccctgagcctgagccccggcaagtaataatctaga699

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>靶向netrin-1的sirna

<400>10

aagcuggacgcagcaugaugc21

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>11

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<210>12

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>12

ccctgcttatacacggagatg21

<210>13

<211>580

<212>prt

<213>智人

<400>13

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151015

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202530

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354045

proproalaargtyrcysvalvalsergluargglyglugluargleu

505560

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65707580

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859095

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100105110

serleuglylyslysphegluvalthrtyrvalserleuglnphecys

115120125

serproargproglusermetalailetyrlyssermetasptyrgly

130135140

argthrtrpvalpropheglnphetyrserthrglncysarglysmet

145150155160

tyrasnargprohisargalaproilethrlysglnasngluglnglu

165170175

alavalcysthraspserhisthraspmetargproleuserglygly

180185190

leuilealapheserthrleuaspglyargproseralahisaspphe

195200205

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210215220

valalapheserargleuhisthrpheglyaspgluasngluaspasp

225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

proglucysaspargcyslysprophehistyraspargprotrpgln

290295300

argalathralaargglualaasnglucysvalalacysasncysasn

305310315320

leuhisalaargargcysargpheasnmetgluleutyrlysleuser

325330335

glyarglysserglyglyvalcysleuasncysarghisasnthrala

340345350

glyarghiscyshistyrcyslysgluglytyrtyrargaspmetgly

355360365

lysproilethrhisarglysalacyslysalacysaspcyshispro

370375380

valglyalaalaglylysthrcysasnglnthrthrglyglncyspro

385390395400

cyslysaspglyvalthrglyilethrcysasnargcysalalysgly

405410415

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420425430

alaproprothrthralaalaserservalglugluprogluaspcys

435440445

aspsertyrcyslysalaserlysglylysleulysileasnmetlys

450455460

lystyrcyslyslysasptyralavalglnilehisileleulysala

465470475480

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485490495

tyrlysglnglythrserargileargargglyaspglnserleutrp

500505510

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515520525

lyslystyrleuleuleuglyasnalagluaspserproaspglnser

530535540

glyilevalalaasplysserserleuvalileglntrpargaspthr

545550555560

trpalaargargleuarglyspheglnglnargglulyslysglylys

565570575

cyslyslysala

580

<210>14

<211>1815

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人netrin-1cdna序列

<400>14

atgatgcgcgcagtgtgggaggcgctggcggcgctggcggcggtggcgtgcctggtgggc60

gcggtgcgcggcgggcccgggctcagcatgttcgcgggccaggcggcgcagcccgatccc120

tgctcggacgagaacggccacccgcgccgctgcatcccggactttgtcaatgcggccttc180

ggcaaggacgtgcgcgtgtccagcacctgcggccggcccccggcgcgctactgcgtggtg240

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aaggcgcacccgcccgccttcctcaccgacctcaacaacccgcacaacctgacgtgctgg360

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aagttcgaagtgacctacgtgagcctgcagttctgctcgccgcggcccgagtccatggcc480

atctacaagtccatggactacgggcgcacgtgggtgcccttccagttctactccacgcag540

tgccgcaagatgtacaaccggccgcaccgcgcgcccatcaccaagcagaacgagcaggag600

gccgtgtgcaccgactcgcacaccgacatgcgcccgctctcgggcggcctcatcgccttc660

agcacgctggacgggcggccctcggcgcacgacttcgacaactcgcccgtgctgcaggac720

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aacgaggacgactcggagctggcgcgcgactcgtacttctacgcggtgtccgacctgcag840

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agcctggtgtgcgactgcaggcacaacacggccggcccggagtgcgaccgctgcaagccc960

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gggcgcaagagcggaggtgtctgcctcaactgtcgccacaacaccgccggccgccactgc1140

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ggccagtgtccctgcaaggacggcgtgacgggtatcacctgcaaccgctgcgccaaaggc1320

taccagcagagccgctctcccatcgccccctgcataaagatccctgtagcgccgccgacg1380

actgcagccagcagcgtggaggagcctgaagactgcgattcctactgcaaggcctccaag1440

gggaagctgaagattaacatgaaaaagtactgcaagaaggactatgccgtccagatccac1500

atcctgaaggcggacaaggcgggggactggtggaagttcacggtgaacatcatctccgtg1560

tataagcagggcacgagccgcatccgccgcggtgaccagagcctgtggatccgctcgcgg1620

gacatcgcctgcaagtgtcccaaaatcaagcccctcaagaagtacctgctgctgggcaac1680

gcggaggactctccggaccagagcggcatcgtggccgataaaagcagcctggtgatccag1740

tggcgggacacgtgggcgcggcggctgcgcaagttccagcagcgtgagaagaagggcaag1800

tgcaagaaggcctag1815