一种脂质过氧化物生成器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种脂质过氧化物生成器及其制备方法和应用，属于脂质体技术领域。

背景技术：

癌症是一种严重威胁人类健康的疾病，《2018年全球癌症报告》数据显示全球新增癌症病例1810万例，死亡人数达960万，全球癌症负担进一步加重。目前临床常用的治疗手段为手术治疗，放射性治疗，化学治疗。其中，化学治疗大多通过凋亡、坏死、自噬的方式实现肿瘤细胞的杀伤。但是大部分化疗药物存在溶解度低，稳定性差，毒副作用强，长期用药容易产生多药耐药等缺陷。因此发现并利用一种新的细胞死亡方式是实现癌症治疗的新途径。

2012年，stockwell等人将铁依赖性的脂质过氧化物（lipidperoxidation,lpo）的积累而导致的细胞程序性死亡过程定义为铁凋亡。与已知的凋亡、坏死、自噬不同，铁凋亡发生的主要特征为大量的、铁离子依赖的lpo的堆积，破坏了细胞中氧化还原平衡，导致细胞发生死亡。铁离子依赖的脂质过氧化是铁凋亡的主要下游特征，lpo是引发细胞发生铁凋亡的重要原因。作为铁凋亡发生的关键因素，机体内循环铁通常与转铁蛋白结合，以fe³⁺的形式存在。fe³⁺通过膜蛋白转铁蛋白受体1(transferrinreceptor1,tfr1)进入细胞，并存在于内涵体(endosome)中，在内涵体中fe³⁺被铁氧化还原酶(ironoxidereductase,alsotermedsteap3)还原为fe²⁺。最后，fe²⁺转运体1(divalentmetaltransporter1,dmt1)介导fe²⁺从内体中释放到细胞质中的动态铁库中，过量的铁则储存在铁蛋白(ferritin)中。细胞膜及细胞器膜上含有大量的不饱和脂质，可以被脂氧合酶（lipoxygenase,loxs）和ros等氧化形成lpo。当组织细胞内的铁稳态被破坏时，过量的铁通过芬顿反应与h2o2生成羟基自由基，进一步引起细胞内不饱和脂质发生过氧化，造成大量的lpo堆积在肿瘤细胞内，最终引起铁凋亡。据报道lpo通过两种途径发挥毒性作用：首先因为脂质负责维持细胞膜的完整性，大量的脂质发生过氧化会改变脂质的结构、组成、组装和脂质的流动性。此外作为高活性化合物，lpo的降解产物如丙二醛(malonaldehyde,mda)和4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal,hne)等，可以使细胞膜蛋白发生交联，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的改变，最终引起细胞死亡。

由于铁凋亡在肿瘤治疗中具有较大的潜力，近年来出现了大量的以芬顿反应引发脂质过氧化为基础的载铁纳米递送体系，通过二价铁离子与肿瘤细胞内的过氧化氢（hydrogenperoxide,h2o2）发生芬顿反应生成羟基自由基，进而将细胞膜及细胞器膜上的不饱和脂质氧化为脂质过氧化物，最终引发铁凋亡。

然而，尽管肿瘤微环境ph为弱酸，但很难满足芬顿反应所需的最佳反应条件（ph=3-4）；并且肿瘤细胞内h2o2含量有限，极大地限制了芬顿反应的效率，通常需要加入大量的铁、引入外源性h2o2或刺激内源性h2o2的生成用于提高芬顿反应。基于铁离子依赖的脂质过氧化物是铁凋亡的主要执行者，而一般的铁凋亡递送体系不能有效实现芬顿反应引发的脂质过氧化，因此，开发一种能够克服芬顿反应效率低的局限、并可产生大量脂质过氧化物的铁凋亡递送体系对于提高肿瘤铁凋亡治疗具有重要意义。

技术实现要素：

目的：本发明提供一种脂质过氧化物生成器及其制备方法和应用，通过铁氧化还原对催化脂质发生氧化反应生成脂质过氧化物，以克服芬顿反应效率低的局限，提高肿瘤铁凋亡治疗效果。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种脂质过氧化物生成器，所述脂质过氧化物生成器包括脂质和铁源，通过脂质体的制备方法将铁源包裹在脂质中形成脂质体；

所述脂质的脂肪链上含有一个或多个不饱和键；所述铁源的价态为二价、三价或二价与三价同时存在；通过铁氧化还原对催化脂质发生氧化反应生成脂质过氧化物。

所述脂质过氧化物生成器，通过铁氧化还原对催化脂质过氧化的原理将不饱和脂质氧化为脂质过氧化物。

所述不饱和脂质选自所述脂质选自磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,pc），磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,pe），鞘磷脂（sphingomyelin,sm），磷脂酸（phosphatidicacid,pa），磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol,pg），磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,pi），磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,ps），糖脂，脂酰甘油中的一种或多种，且每一种脂质具有不同饱和度的脂肪链。

所述铁盐选自柠檬酸铁铵、硝酸铁、右旋糖酐铁、山梨醇铁、蔗糖铁、磷酸铁、焦磷酸铁、碳酸铁、氯化铁、氯化亚铁、柠檬酸铁、柠檬酸亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、酒石酸铁、酒石酸亚铁、富马酸铁、富马酸亚铁、琥珀酸铁、琥珀酸亚铁、乙二胺四乙酸铁钠盐、亚铁氰化铁、二茂铁、醋酸亚铁。

所述含铁纳米颗粒选自普鲁士蓝纳米颗粒、中空介孔普鲁士蓝纳米颗粒、三氧化二铁纳米颗粒、四氧化三铁纳米颗粒、锰铁氧纳米颗粒、铁硫铜纳米颗粒、铁铂纳米颗粒。

所述脂质过氧化物生成器的制备方法，包括：

（1）将铁源溶于水或水溶液中，得到水相；

（2）将脂质溶于有机溶剂中，得到有机相；

（3）通过脂质体的制备方法，将水相和有机相结合；

（4）使用截留分子量为0.5-14kda的透析袋在水、磷酸缓冲盐溶液pbs或生理盐水中透析，除去有机溶剂及未包裹的铁源后得到脂质体。

根据本发明的另一方面，提供一种脂质过氧化物生成器与药物的复合物，包括脂质、铁源和药物，通过脂质体的制备方法将铁源和药物包裹在脂质中形成脂质体；

所述脂质的脂肪链上含有一个或多个不饱和键；所述铁源的价态为二价、三价或二价与三价同时存在；通过铁氧化还原对催化脂质发生氧化反应生成脂质过氧化物；

所述药物为水溶性药物、疏水性药物中的一种或几种，选自铁凋亡诱导剂、免疫治疗药物、化学治疗药物、放射治疗药物、光动力治疗药物、光热治疗药物。

所述铁凋亡诱导剂选自l-丁硫氨酸亚砜胺、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸、索拉菲尼、erastin、rsl-3、rsl-5中的一种或几种。

所述免疫治疗药物选自抗pd-1、抗pd-l1、抗ctla-4抗体中的一种或几种。

所述化学治疗药物选自阿霉素、丝裂霉素、柔红霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、紫杉醇、长春新碱中的一种或几种。

所述放射治疗药物选自32p、89sr、90y、131i、153sm、188re、117msn、117lu中的一种或几种。

所述光动力治疗药物选自二氢卟吩e6、血卟啉衍生物、血红素、吲哚菁绿、亚甲基蓝、光敏素ii，苯并卟啉衍生物单酸环a，维替泊芬，5-氨基酮戊酸，卟吩姆钠、金属酞菁类中的一种或几种。

所述光热治疗药物选自金纳米颗粒、普鲁士蓝纳米颗粒、聚多巴胺中的一种或几种。

所述的脂质过氧化物生成器与药物的复合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将铁源或铁源与水溶性药物加入水或水溶液进行混合，得到水相；

（2）将脂质或脂质与疏水性药物加入有机溶剂进行混合，得到有机相；

（3）通过脂质体的制备方法，将水相和有机相结合；

（4）使用截留分子量为0.5-14kda的透析袋在水、磷酸缓冲盐溶液pbs或生理盐水中透析，除去有机溶剂及未包裹的铁源、药物后得到脂质过氧化物生成器与药物的复合物。

脂质体的制备方法包括：薄膜分散法、过膜挤压法、french挤压法、逆相蒸发法、化学梯度法等。

根据本发明的另一方面，还提供上述的脂质过氧化物生成器、上述的脂质过氧化物生成器与药物的复合物在制备预防和/或治疗与肿瘤相关疾病的药物中的应用。

本发明优选一种脂质过氧化物生成器的制备方法，包括以下步骤：使用过膜挤压法，在涡旋状态下将溶有不饱和脂质的乙醇溶液逐滴加入到铁源的生理盐水溶液中，使用截留分子量为0.5-14kda的透析袋在生理盐水水溶液中透析过夜，除去有机溶剂及未包裹的铁源；使用脂质体挤出器挤出，制备得到粒径较小且均一的脂质过氧化物生成器。

本发明优选另一种脂质过氧化物生成器与药物的复合物的制备方法，薄膜分散法，包括以下步骤：首先将脂质与疏水性药物进行混合，得到有机相，旋蒸除去有机溶剂，得到脂质薄膜；然后将铁源与水溶性药物进行混合，得到水相，加入上述脂质薄膜中进行水化；使用截留分子量为0.5-14kda的透析袋在水（pbs或生理盐水）中透析除去游离药物后，制备得到脂质过氧化物生成器与药物的复合物。

本发明以铁凋亡为治疗手段设计一种脂质过氧化物生成器，基于铁氧化还原对触发脂质过氧化反应是一种不依赖于芬顿反应而引发的脂质过氧化方式。

一优选的，选用含有不饱和脂质的注射用大豆卵磷脂，及小分子铁源柠檬酸铁铵（fac）制备载铁脂质体（lip@fac），fac在肿瘤细胞内较高的gsh的作用下还原为fe²⁺，生成的铁氧化还原对可以催化卵磷脂中的不饱和脂质发生脂质过氧化，造成大量的脂质过氧化物堆积在肿瘤细胞内，实现肿瘤铁凋亡治疗。

另一优选的，选用含有不饱和脂质的注射用大豆卵磷脂，及小分子铁源硫酸亚铁（feso4）制备载铁脂质体（lip@feso4），feso4在肿瘤细胞内金属氧化酶以及较高的h2o2的作用下氧化为fe³⁺，生成的铁氧化还原对可以催化卵磷脂中的不饱和脂质发生脂质过氧化，造成大量的脂质过氧化物堆积在肿瘤细胞内，实现肿瘤铁凋亡治疗。

有益效果：本发明提供的脂质过氧化物生成器与现有技术相比，具有以下优点：

该发明的制备方法简单，创新性地应用了铁氧化还原对触发脂质过氧化反应的原理制备了脂质过氧化物生成器用于芬顿反应非依赖的肿瘤铁凋亡治疗；本发明使用小分子fac作为铁源，可以在酸性溶酶体环境（ph4.5-5.5）中快速大量释放，导致细胞内铁离子急剧升高，可以有效提高铁氧化还原对触发脂质过氧化反应的效率；该载铁脂质体具有安全性高、稳定性强、ph响应性释放的优势，并克服了芬顿反应效率低的缺陷。该铁凋亡递送体系极大地拓展了脂质体作为纳米载体的功能和应用范围，为实现肿瘤的安全、稳定、高效递送搭建了实用的平台。

附图说明

图1为实施例1中向fac中加入不同浓度的gsh，二价铁的产生量，结果验证了gsh可以将三价铁还原为二价铁。

图2为实施例2中将lip及lip@fac分别与：(1)gsh，(2)fe²⁺混合，不同条件下的脂质体外观。

图3为实施例2中将lip及lip@fac分别与：(1)gsh，(2)fe²⁺混合，不同条件下产物的质谱图。

图4为实施例4中lip@fac脂质体的透射电镜图。

图5为实施例5中在不同ph值的pbs溶液中lip@fac的释放行为。

图6为实施例6中使用流式细胞仪测定lip@c6在4t1细胞上的摄取量。

图7为实施例7中lip@fac对肿瘤细胞株mcf-7/adr、mcf-7、4t1及正常细胞株l02的细胞毒性，细胞存活率的降低证明了该发明良好的抗肿瘤效果。

图8为实施例8分别加入fer-1,dfo,apo,nec-1,aut,ve,vc,等处理的lip@fac对4t1细胞的细胞毒性。

图9为实施例9中使用生物电镜观测lip@fac处理后的细胞的线粒体形态。

图10为实施例10中细胞内活性氧的水平的表征。

图11为实施例11中使用bodipy-c11测定细胞内脂质过氧化物结果图。

图12为实施例12中在激光共聚焦下观察各实验组脂质过氧化物的荧光强度。

图13为实施例13中测定细胞内丙二醛的量。

图14为实施例14中lip@c6在肿瘤球中的渗透性。

图15为实施例15中lip@fac对荷瘤小鼠的抗肿瘤效果评价。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1

使用邻菲罗啉试剂检测fe²⁺，首先向fac溶液中加入一系列浓度的gsh与邻菲罗啉检测试剂，涡旋摇匀后在37^oc恒温摇床反应24h，使用酶标仪检测510nm处的吸光值。图1为本实施例中向fac中加入不同浓度的gsh，二价铁的产生量，结果验证了gsh可以将三价铁还原为二价铁。结果显示：随着gsh浓度增加，混合物在510nm处的吸光值逐渐增加，并且当gsh大于1mm时，混合物吸收值与阳性对照组feso4相同，由此说明fac在具有高浓度gsh的肿瘤细胞内可以被有效还原为fe²⁺，进而两种价态的铁离子同时存在形成铁氧化还原对。

实施例2

首先向lip及lip@fac中加入fe²⁺，在37^oc恒温摇床内反应过夜，空白脂质体lip溶液在加入fe²⁺前后均澄清透明，外观没有明显的变化，同时lip@fac溶液过夜后外观也并没有明显的变化。当向lip@fac溶液中加入fe²⁺，反应过夜后溶液中出现黄色沉淀。然后向lip及lip@fac中分别加入gsh，lip溶液在加入前后并没有发生明显的变化，而lip@fac在加入gsh前后出现了大量的黄色沉淀；如图2所示。对以上物质进行质谱分析，如图3所示，结果显示lip在加入fe²⁺,gsh前后以及lip@fac自身，分子量并没有明显变化，均出现了804的分子离子峰，但以上出现黄色沉淀的组别均出现836的分子离子峰，分子量增加32，这提示黄色沉淀中的氧化产物含有脂质过氧化物。进而说明，fac可以被gsh还原为fe²⁺，进而在fac/fe²⁺同时存在的条件下将大豆卵磷脂中的不饱和脂质氧化。

实施例3

本实验使用过膜挤压法，在涡旋状态下将大豆卵磷脂的乙醇溶液逐滴加入到fac生理盐水溶液中，使用截留分子量为14kda的透析袋在生理盐水中透析过夜，除去乙醇及未包裹的fac；在此基础上进一步使用脂质体挤出器，制备得到粒径较小且均一的脂质体。

实施例4

使用透射电子显微镜观察lip@fac的物理形态。取lip@fac溶液少许，滴至电镜用铜网上，自然干燥后，置于透射电镜中进行观察并拍照，图4为本实施例中lip@fac脂质体的透射电镜图，结果显示该脂质体具有规则的球形结构，为均匀分布的单分散体。

实施例5

使用透析袋法测定lip@fac的释放行为。将已知含量的lip@fac溶解于不同ph值（7.4、6.5、5.5）的磷酸盐缓冲液及ph4.5的醋酸盐缓冲液中，然后加至截留分子量为14kda的透析袋中两端结扎。在满足漏槽条件的前提下，将装有lip@fac溶液的透析袋放置到对应ph值的pbs释放介质中，分别在1、2、4、6、8、12、24h取出3ml释放介质，并补加等体积的释放液，最后计算fac在不同ph条件下的累计释放度。图5为本实施例中在不同ph值的pbs溶液中lip@fac的释放行为，结果显示fac在ph7.4的中性环境及肿瘤弱酸ph6.8的微环境中释放缓慢；而随着释放介质酸性的增加，fac呈现ph响应性的快速释放：在模拟细胞内溶酶体的ph4.5和细胞内内涵体ph5.5的环境中，24h内药物的累计释放度可以分别达到49.05%和31.17%，具有ph响应性释放的性质，以上结果说明lip@fac在肿瘤细胞的酸性环境中更容易释放出fac，游离的fac有利于脂质过氧化。

实施例6

制备载c6的脂质体，并采用流式细胞仪测定lip@c6在4t1肿瘤细胞上的摄取情况，可以反映lip@fac在肿瘤细胞上的摄取行为。将对数生长期的4t1细胞接种到24孔板中，每孔铺板密度为1.0×10⁵/1ml，在细胞培养箱中培养过夜。待细胞生长至孔板面积的80%，分别给予0.1μm、0.2μm的游离c6和lip@c6，并分别在给药培养1h，2h，4h，6h后使用冷pbs清洗三次，然后加200μl胰酶适度消化细胞，随后立即吸走胰酶并加入500μl不完全培养基收集细胞。用尼龙纱布过滤掉细胞液中的大颗粒杂质后，使用流式细胞仪测定游离c6和lip@c6在4t1细胞上的摄取量，如图6所示，c6及lip@c6的摄取均随着两种物质的孵育时间及给药剂量的增加而增加，即两种物质的摄取呈现时间和剂量依赖性，并且lip@c6的摄取量高于游离c6。这提示载fac脂质体相对于游离fac具有更高的摄取量，较高的提高了fac的生物利用度，为发挥铁凋亡提供有力的条件。（bd，fl1通道）

实施例7

采用mtt法测定lip@fac对不同类型的细胞增殖的抑制率。选用三株肿瘤细胞及一株正常细胞：mcf-7/adr、mcf-7、4t1、l02，将对数生长期细胞接种到96孔板中，每孔的细胞密度是1.0×10⁴/200μl，在细胞培养箱培养过夜。待细胞生长至孔板面积的80%开始给药，实验设置control组、fac组、lip组、lip@fac组，各组中相应的fac给药浓度为10、15、20、25、30、35μm，相应的lip给药浓度为20、30、40、50、60、70μm，给药48h后，在避光条件下加入20μl的5mg/ml的mtt，在细胞培养箱中继续培养4h。用1ml注射器吸走96孔板中的溶液，加入150μldmso，在37℃摇床中振摇15min，使用酶标仪在570nm处检测各孔的吸光值（a），计算细胞生存率。如图7所示，为本实施例中lip@fac对肿瘤细胞株mcf-7/adr、mcf-7、4t1及正常细胞株l02的细胞毒性，细胞存活率的降低证明了lip@fac良好的抗肿瘤效果。

实施例8

采用mtt法测定lip@fac处理的细胞在加入不同抑制剂后的细胞毒性的变化。将对数生长期4t1细胞接种到96孔板中，每孔的细胞密度是1.0×10⁴/200μl，在细胞培养箱培养过夜。待细胞生长至孔板面积的80%，首先给予最终制剂lip@fac（fac的终浓度为20μm），然后分别加入抑制剂，本实验选用铁凋亡抑制剂：ferrostatin-1（fer-1，2μm），去铁胺（dfo，100μm），凋亡抑制剂：z-vad-fmk（apo，160μm）；坏死抑制剂：necrostatin-1（nec-1，1μm）；自噬抑制剂，三甲基腺嘌呤（atu，60μm）；水溶性活性氧抑制剂：维生素c（vc，200μm）；脂质活性氧抑制剂：维生素e（ve，200μm）。为考察铁氧化还原对的重要性，本实验制备了pc与氯化锌的混合物（zn²⁺，20μm），为考察不饱和脂质的重要性，制备了二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（dmpc，40μm）与fac的混合物。培养48h后，在避光条件下加入20μl的5mg/ml的mtt，在细胞培养箱中继续培养4h。用1ml注射器吸走96孔板中的溶液，加入150μldmso，在37℃摇床中振摇15min，使用酶标仪在570nm处检测各孔的吸光值（a），计算细胞生存率，结果如图8所示，lip@fac进入细胞后可通过铁离子依赖的氧化还原方式将lip中的不饱和脂质氧化为lpo，进而引起铁凋亡，其中铁和不饱和脂质均为不可缺少的关键因素。

实施例9

将对数生长期细胞接种到6孔板中，每孔的细胞密度是2.5×10⁵/2ml，在细胞培养箱培养过夜。待细胞生长至孔板面积的80%给予最终制剂lip@fac（fac的终浓度为20μm），给药48h后弃去培养液，不经漂洗便迅速加入电镜固定液(2.5%戊二醛溶液，1ml)对细胞进行固定，用洁净细胞刮轻轻刮下细胞并收集到离心管内（不可以用胰酶消化细胞），1500rpm离心3min收集一定量的细胞（要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小），弃去固定液后加入新的电镜固定液用移液枪吹打重悬，室温固定2h后转移至4°c冰箱保存。之后用四氧化锇进行后固定，然后醋酸双氧铀进行块染，用连续浓度的乙醇（30~100%）由低浓度到高浓度脱水。接下来用环氧丙烷与spurr’s树脂（包埋剂）浸透，使包埋剂逐步渗透入组织细胞内，最终嵌入的包埋剂在70^oc条件下过夜，使树脂聚合固化。然后将样品切片，并置于铜网上。最后进行醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，最后使用生物电镜观察线粒体的状态，结果如图9所示，control组的线粒体形态均一，线粒体膜与线粒体脊膜清晰可见。如图中黑色箭头所指，经过lip@fac处理后的线粒体膜密度增大，线粒体脊膜变厚，轮廓不清晰，线粒体变小并有破裂的现象。以上线粒体的变化符合铁凋亡引起的细胞变化，因此可以进一步验证给予lip@fac的4t1细胞发生了铁凋亡。

实施例10

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf，本实验使用dcfh-da检测细胞内活性氧的水平。将对数生长期细胞接种到24孔板中，每孔的细胞密度是1.0×10⁵/1ml，在细胞培养箱培养过夜。待细胞生长至孔板面积的80%开始给药，实验设置control组、fac组、lip组、lip@fac组，各组中相应的fac给药浓度为20μm，相应的lip的给药浓度为40μm。给药24h后弃去药液，使用不完全培养基将dcfh-da稀释至5μm，每孔加入500μl放置于细胞培养箱中染色30min。染色结束后弃去染料，用冷pbs清洗三次，然后加200μl胰酶适度消化细胞，随后立即吸走胰酶并加入500μl不完全培养基收集细胞。用尼龙纱布过滤掉细胞液中的大颗粒杂质后，使用流式细胞仪测定各实验组细胞中ros的含量，结果如图10所示，fac组与lip组的ros水平与control组相比无显著性差异，而lip@fac组相对于对照组具有高达16倍的ros水平。由此说明lip@fac可以使细胞内的ros水平显著提高，进而破坏了细胞内的氧化还原平衡，最终引起细胞死亡。（bd，fl1通道）

实施例11

将对数生长期细胞接种到24孔板中，每孔的细胞密度是1.0×10⁵/1ml，在细胞培养箱培养过夜。待细胞生长至孔板面积的80%开始给药，实验设置control组、fac组、lip组、lip@fac组，各组中相应的fac给药浓度为20μm，相应的lip的给药浓度为40μm。给药24h后弃去药液，使用不完全培养基将bodipy-c11稀释至5μm^[8]，每孔加入500μl放置于细胞培养箱中染色30min。染色结束后弃去染料，用冷pbs清洗三次，然后加200μl胰酶适度消化细胞，随后立即吸走胰酶并加入500μl不完全培养基收集细胞。用尼龙纱布过滤掉细胞液中的大颗粒杂质后，使用流式细胞仪测定各实验组细胞中脂质ros的含量，结果如图11所示，fac组及lip组的荧光强度与control组无显著性差异，而lip@fac组荧光强度较强，约为对照组的2倍。由此可以说明单独给予fac或lip并不能使细胞内的脂质ros升高，而lip@fac进入细胞后，其中的fac可以被较高浓度的gsh还原为fe²⁺，形成的铁氧化还原对将不饱和脂质氧化为脂质过氧化物，因此细胞中脂质ros升高。本实施例进一步证明lip@fac可以引起细胞发生铁凋亡。（bd，fl2通道）

实施例12

将对数生长期细胞接种到3.5cm的激光共聚焦皿中，每孔的细胞密度是3.0×10⁵/2ml，在细胞培养箱培养过夜。待细胞生长至激光共聚焦皿面积的80%开始给药，实验设置control组、fac组、lip组、lip@fac组，各组中相应的fac给药浓度为20μm，相应的lip的给药浓度为40μm。给药24h后弃去药液，使用不完全培养基将bodipy-c11稀释至5μm，每孔加入1ml放置于细胞培养箱中染色30min。弃去培养基并使用冷pbs清洗三次，然后加入即用型hoechst染色液（50μl稀释到10ml）继续在细胞培养箱中培养15-20min，pbs清洗三次后，浸润在不完全培养基中，在激光共聚焦下观察各实验组脂质过氧化物的荧光强度，结果如图12所示，control组，fac组及lip组脂质ros的荧光强度较小，而给予lip@fac后，细胞内的荧光强度显著增强，脂质ros均分布在细胞质内。本实施例进一步说明了lip@fac进入细胞后可以可明显升高脂质ros水平。

实施例13

不饱和脂质被氧化后生成脂质过氧化物，然后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括mda。本实验使用mda检测试剂盒测定细胞内mda的量，间接测定脂质过氧化物的水平。将对数生长期细胞接种到6孔板中，每孔的细胞密度是3.0×10⁵/2ml，在细胞培养箱培养过夜。待细胞生长至孔板面积的80%开始给药，实验设置control组、fac组、lip组、lip@fac组，各组中相应的fac给药浓度为20μm，相应的lip的给药浓度为40μm。给药24h后弃去药液，胰酶消化后加入不完全培养基中和，离心收集细胞，去上清后加入细胞裂解液在冰上裂解，每间隔5min涡旋使裂解均匀，重复三次后12000rpm离心5min，收集上清，然后按照mda试剂盒说明书进行检测，结果如图13所示，mda试剂盒检测到lip@fac处理的细胞中lpo的量为control的两倍，而fac组及lip组的mda含量均没有明显的变化。由此说明lip@fac可以引起细胞内脂质过氧化物含量升高，进而mda也随之升高。

实施例14

本实验使用以上制备的肿瘤球，吸去96孔板中培养基，分别给予游离c6和lip@c6，孵育24h后，弃去培养液，并用不完全培养基重复清洗三次，然后在激光共聚焦显微镜下观察c6在肿瘤球的渗透作用，结果如图14所示，游离c6在肿瘤球内的荧光强度较弱，而lip@c6在肿瘤球内的荧光强度较强，且断层扫描显示，其荧光可以渗透到肿瘤球内部。由此可知，lip@c6在4t1细胞肿瘤球上具有较好的摄取和渗透性，有利于药物充分分布于整个肿瘤组织，彻底杀伤肿瘤。

实施例15

抑瘤实验最终选用肿瘤体积为50-100mm³的荷瘤balb/c小鼠模型作为研究对象，随机分为4组，每组6只。4组实验小鼠分别给予100μl的生理盐水、fac(1mm/100μl)、lip(2mm/100μl)以及lip@fac(1mmfac-2mmlip)。以第一次给药时间计为第0天，则分别于第0,3,6,9,12，15，18天给药，并在每次给药前观察小鼠的生存状态，测定小鼠的体重和肿瘤体积。实验结束后，取出各组实验小鼠的肿瘤组织切片，使用bodipy-c11染色考察肿瘤部位的脂质过氧化物的生成量，然后进行苏木精-伊红（h&e）染色用于考察肿瘤细胞的死亡情况，结果如图15所示，在荷瘤小鼠体内连续给药7次后，fac组与生理盐水组相比无明显差异，说明单独给铁不能引起肿瘤组织的铁凋亡；lip组与生理盐水组相比同样没有显著性差异，说明单独给予空白脂质体也不能诱发铁凋亡；而最终制剂lip@fac组肿瘤体积明显变小，说明载铁脂质体可通过epr效应蓄积在肿瘤部位并渗透到肿瘤组织深部，当载铁脂质体通过内吞作用进入肿瘤细胞内，三价铁离子可以在细胞内gsh的作用下还原为二价铁，继而形成的铁氧化还原对可以催化脂质体形成脂质过氧化物，最终通过铁凋亡杀死肿瘤。bodipy-c11染色显示，与生理盐水组相比，fac组与lip组的荧光强度没有显著性差异，而lip@fac组则出现较强的荧光强度，说明尾静脉给予的lip@fac在肿瘤部位可以生成大量的lpo，进而可以引发铁凋亡。h&e染色显示lip@fac组出现了较多的死亡肿瘤细胞并伴随较多空泡，由此说明lip@fac可以有效引起肿瘤组织发生铁凋亡，产生较好的抑瘤效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。