一种RGD修饰树状大分子包裹的CuS纳米颗粒的制备方法与流程

本发明属于诊疗一体化纳米材料领域，特别涉及一种rgd修饰树状大分子包裹的cus纳米颗粒的制备方法。

背景技术：

癌症已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。降低死亡率及提高生存率首要解决的关键问题是早期诊断和高效治疗。近年来，纳米材料由于其在药物传递、分子影像以及治疗方面的潜在应用，受到越来越广泛的关注。尤其是其在光热治疗方面的应用，如纳米金星、硫化钼纳米颗粒以及硫化铜纳米颗粒，因为具有良好的化学稳定性、生物相容性和独特的光学性质，广泛应用在生物传感器、光热治疗和分子影像等领域，常被作为多模态治疗和诊疗一体化的明星纳米平台。

光热治疗方法(photothermaltherapy，ptt)利用近红外区域的光热转换试剂将光能转换成热能，成为一种潜在的治疗肿瘤的强有力手段。光热治疗一方面通过破坏细胞膜性结构、引起细胞核内的dna、rna和蛋白质变性而造成细胞不可逆的损伤；另一方面可促使肿瘤组织缺血再灌注和缺氧复氧的过程加剧，从而增强疗效。相比贵金属纳米颗粒(金、银、铂)，碳类材料(石墨烯、碳纳米棒)，有机染料物质(吲哚菁绿)及导电高分子材料(聚苯胺、聚吡咯)，硫化铜(cus)作为一种典型的铜基半导体纳米材料，以其制备简单、成本低以及表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，spr)吸收引起的光热性能等特性受到了较多的关注。纳米cus除了可以用于ct和光声造影剂及光热治疗剂外，还可以与其它材料复合达到诊疗一体化的目的。如将fe3o4和cus结合到一起，合成了fe3o4@cus纳米颗粒，其红外吸收范围可以达到700-1300nm，而且在808nm激光照射下可以有效地抑制肿瘤的生长(adv.funct.mater,2015,25,6527-6537)；还可以制备(⁶⁴cu)cus纳米颗粒，用于肿瘤micro-pet/ct双模态成像以及光热治疗的诊疗一体化(j.am.chem.soc.,2010,132,15351-15358)。因此，cus作为光热转换材料应用于癌症的光热治疗近年来得到了快速发展。

另外，单一治疗手段难以达到理想的治疗效果，因而需要两种或多种手段联合，发挥高效协同治疗的效果，将治疗效果最大化，如临床最常用的化疗/放疗联合治疗。另有研究表明，让药物到达目标部位后再释放能有效降低药物的毒副作用，提高药物的生物利用度，如利用肿瘤部位谷胱甘肽浓度相对较高的特性，已有文献设计含二硫键的药物修饰至纳米材料表面能有效提高药物的肿瘤治疗效果。

除了采用诊疗一体化和联合治疗外，高效输送造影剂或药物到肿瘤部位也是实现癌症的早诊断以及高效治疗的必要条件。理想的造影剂或药物应该能够区分正常组织和肿瘤组织以及在肿瘤部位保持足够的浓度和作用时间。临床用的造影剂和治疗药物通常在递送到实体瘤细胞的过程中，面临复杂的生物环境和多重生物屏障，很容易被网状内皮系统(reticuloendothelialsystem,res)所清除，血液循环时间过短，因而缺乏特异性。为实现高效输送，需要设计合适尺寸和表面特性的药物载体，能克服被res清除，具有延长的血液循环时间。如在纳米分子表面修饰两性离子减少非特异性蛋白吸附，或者利用靶向基团特异性靶向特定细胞，达到在肿瘤部分富集的目的。此外通过特定化学键修饰两性离子至载体表面，实现到达肿瘤部位后载体ph响应性电荷反转，从电中性变至正电而促进细胞对材料的吸收，这些因素都有利于提高肿瘤的诊疗效果。

检索国内外文献，尚没有发现关于具有ph响应性电荷反转以及谷胱甘肽响应性药物释放的纳米材料的相关报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种rgd修饰树状大分子包裹的cus纳米颗粒的制备方法，该方法制备的功能化硫化铜纳米颗粒具有良好的单分散性、胶体稳定性、生物相容性以及极强的抗非特异性蛋白吸附性，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。

本发明提供了一种rgd修饰树状大分子包裹的cus纳米颗粒的制备方法，包括：

(1)将cooh-peg-6-m溶解于dmso中，然后加入溶解于dmso中的巯基封端的rgd，搅拌反应1～2天，透析，冷冻干燥，得到cooh-peg-rgd，利用edc/nhs活化2～4h；将g5.nh2分散于dmso中，然后加入经过活化的cooh-peg-rgd溶液，搅拌反应2～4天，透析，冷冻干燥，得到g5.nh2-peg-rgd；

(2)制备两性离子试剂巯基-n,n-二甲基-半胱胺-羧酸甜菜碱cbt，并与化合物7反应得到含对苯醛基末端的cbt

(3)将含对苯醛基末端的cbt溶解于甲醇中，加入同样溶解于甲醇中的g5.nh2-peg-rgd，室温搅拌反应2～4h，透析，冷冻干燥，得到g5.nh2-peg-rgd-cbt；

(4)制备3’3-二硫代二丙酸-阿霉素；将3’3-二硫代二丙酸-阿霉素溶解于dmso中，利用edc/nhs活化2～4h后加入到g5.nh2-peg-rgd-cbt的dmso溶液里，搅拌反应2～4天，透析，冷冻干燥，得到g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox；

(5)将g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox溶于超纯水中，加入cucl2·2h2o的水溶液室温搅拌0.5～2h，然后将反应液转移至37℃水浴锅中，再加入na2s·9h2o的水溶液，搅拌反应6～8h；最后先后滴加三乙胺和乙酸酐继续进行反应，将得到的混合溶液透析，冷冻干燥，得到最终产物{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}(简写为t)。

所述步骤(1)中的巯基封端的rgd与cooh-peg-6-m的摩尔比为1～1.2:1；所述cooh-peg-6-m的分子量为2000。

所述步骤(1)中的cooh-peg-rgd与g5.nh2的摩尔比为5～6:1。

所述步骤(2)中的cbt与化合物7的摩尔比为1:1～1.2。

所述步骤(2)中的cbt的制备步骤如下：

将双(2-二甲氨基乙基)二硫化物二盐酸盐(化合物1)和三乙胺溶解在无水甲醇中，室温下搅拌反应30～60min；然后将丙烯酸和对苯二酚加入到混合溶液中，50～60℃搅拌18～20h，减压蒸馏得到油状液体；再加入甲基叔丁基醚，室温搅拌12～14h，将得到的粗品抽滤、洗涤和干燥，得到白色粉末化合物(化合物2)；然后将白色粉末化合物溶解在无水甲醇中，将dtt加入到溶液中，然后室温搅拌12～14h；将反应液减压浓缩至油状液体，最后采用甲醇/甲基叔丁基醚体系重结晶，得到固体沉淀，抽滤、洗涤和干燥，得到cbt。

所述化合物1、三乙胺和丙烯酸的摩尔比为1:2:20；所述化合物1与dtt的摩尔比为1:1～1.2。

所述步骤(2)中的化合物7的制备步骤如下：

①将对醛基苯甲酸(化合物3)与hobt溶解于重蒸的二氯甲烷中，冰浴搅拌5min。然后将edci加入上述溶液中，撤去冰浴，室温搅拌1h。取beta-丙氨酸甲酯盐酸盐(化合物4)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)滴加入混合溶液中，室温搅拌6h。加入水淬灭反应，后用二氯甲烷(dcm)萃取。每次萃取时，加入1m的hcl，调节有机层的ph为7。收集有机层，用无水硫酸钠干燥。柱层析分离，得到白色固体粉末(化合物5)。

②将制备的化合物5用5ml混合溶剂(dcm:tfa＝4:1)溶解，室温搅拌2h，减压除去有机溶剂，得到黄色油状液体。将6-马来酰亚氨基己酸(化合物6)与hobt溶解于重蒸的二氯甲烷中，冰浴搅拌5min。后将edci加入上述溶液中，撤去冰浴，室温搅拌1h。将上一步的黄色液体和dipea滴加入混合溶液中，室温搅拌6h。加入水淬灭反应，后用二氯甲烷(dcm)萃取。每次萃取时，加入1m的hcl。调节有机层的ph为7。收集有机层，用无水硫酸钠干燥。柱层析分离得到白色固体粉末(化合物7)。

所述化合物3与化合物4的摩尔比为1:1～1.2。

所述化合物5与化合物6的摩尔比为1:1～1.2。

所述步骤(2)中的含对苯醛基末端的cbt的制备步骤如下：

将化合物7加入到梨形瓶中，加入6ml混合溶剂(甲醇:二氯甲烷＝2:1)溶解，然后加入cbt和三乙胺于混合溶液中，室温搅拌4h。减压除去有机溶剂，后加入少量甲醇溶解，加入乙醚析出。后离心得到白色油状液体。后加入水溶解，冷冻干燥得到白色粉末化合物8，即含对苯醛基末端的cbt。

所述步骤(3)中的含对苯醛基末端的cbt与g5.nh2-peg-rgd的摩尔比为1:25～30。

所述步骤(4)中的g5.nh2-peg-rgd-cbt与3’3-二硫代二丙酸-阿霉素的摩尔比为1:10～12。

所述步骤(4)中的3’3-二硫代二丙酸-阿霉素的制备步骤如下：

在dmso中，利用edc/nhs活化3’3-二硫代二丙酸2～4h，然后将活化好的3’3-二硫代二丙酸加入阿霉素dox的dmso溶液中，室温搅拌反应2-4h，柱层析分离，得到3’3-二硫代二丙酸-阿霉素。

所述步骤(5)中的g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox与cucl2·2h2o的摩尔比为1:100；cucl2·2h2o与na2s·9h2o的摩尔比为1:1～5。

所述步骤(5)中的{(cus)-g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox}与三乙胺的摩尔比为1：500～600；三乙胺和乙酸酐的摩尔比为1:1～1.5。

所述步骤(1)～(5)中透析的条件均为：截留分子量为8000-14000的透析袋透析三天。

本发明首先合成聚乙二醇-rgd复合物、含对苯醛基的两性离子cbt以及含二硫键并拥有羧基末端的阿霉素，然后依次修饰到第五代树状大分子表面，最后再在其内部包裹cus纳米颗粒，形成集光热治疗与化疗与一体的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒，并且此纳米体系具有抗非特异性蛋白吸附性能、电荷反转以及谷胱甘肽响应性药物释放等特点。

本发明操作简单易行，原材料成本较低，不使用表面活性剂，对环境无污染。制备得到的复合物表现出良好的单分散性、胶体稳定性和生物相容性。借助于靶向基团rgd的修饰，纳米材料在体外癌细胞和体内肿瘤模型的治疗效果均大大增强，能有效地抑制肿瘤生长。

本发明使用紫外可见吸收光谱(uv-vis)、核磁共振氢谱(¹hnmr)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(icp-aes)、zeta电势及动态光散射(dls)和透射电子显微镜(tem)等方法表征制备的纳米颗粒，并评价了该纳米材料作为光热治疗试剂在近红外激光照射下的升温效果，药物缓释效果，利用cck8法来评价纳米材料的细胞毒性，利用裸鼠体内原位肿瘤模型进行化疗/光热联合治疗实验，考察{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒的治疗效果。此外，通过组织分布实验研究{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒在动物体内的代谢情况。

有益效果

(1)本发明利用苯亚胺连接两性离子和树状大分子，使得整个纳米材料能够拥有抗非特异性蛋白吸附性能的同时可以在微酸肿瘤细胞外间质电荷反转，促进细胞对材料的吞噬。因为苯亚胺在ph为6.5-6.8内可断裂，从而由电中性的末端变回树状大分子本来的氨基末端，使得电荷反转；

(2)本发明制备的rgd修饰树状大分子包裹的cus纳米颗粒拥有谷胱甘肽响应性释放药物的性能，使得载药的纳米颗粒到达肿瘤细胞内后可从树状大分子上脱落下来，从而杀死肿瘤细胞。

(3)使用37℃水浴法合成的rgd修饰树状大分子包裹的cus纳米颗粒不仅尺寸分布均一，而且整个材料具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和特定细胞的靶向性。体外和体内实验结果均显示该多功能化的cus纳米颗粒可以发挥很好的光声成像、光热成像及化疗/光热治疗效果。可以预见，本发明制备的多功能化的cus纳米颗粒在肿瘤的治疗领域有着潜在的应用价值。

附图说明

图1是本发明的合成步骤示意图；

图2是本发明制备的peg-rgd(a)，cbt(b)，化合物5(c)，化合物7(d)，含对苯醛基的cbt(e)以及3’3-二硫代二丙酸-阿霉素(f)的核磁共振分析图谱(¹hnmr)；

图3是本发明制备的g5.nh2-peg-rgd(a)，g5.nh2-peg-rgd-cbt(b)以及g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox(c)的核磁共振分析图谱(¹hnmr)；

图4是本发明制备的中间产物以及最终产品的uv-vis图；

图5是本发明制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}高分辨透射电镜图片(a)以及其在ph为6.5的缓冲溶液中放置不同时间后的表面电势变化图；

图6是本发明制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}在不同样品浓度时激光照射下的温度变化图(a)，同一样品浓度(1200μm)下连续五个循环照射下的温度变化图(b)，cus为最高浓度时(1200μm)材料经激光照射5min并自然冷却的温度变化曲线图(c)以及{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}在不同条件下的药物缓释图(d)(激光：1064nm，0.6w/cm^-1，每次照射五分钟)；

图7是本发明制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}或者pbs对4t1细胞进行不同处理24h后的cck-8细胞活力分析结果图(a)，pbs、实施例2制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的pbs溶液(100μl，[cu]＝45mm)经尾静脉注射小鼠24h后，在肿瘤部位用1064nm激光照射和无激光照射处理的12天内肿瘤的体积(b)和体重(c)以及36天内的小鼠存活率(d)变化图；

图8a-b是实施例7中小鼠尾静脉注射实施例2制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的pbs溶液(100μl，[cu]＝45mm)24h后，在肿瘤部位用1064nm激光照射5min并用光热成像仪记录的小鼠肿瘤部位热成像效果图，其中尾静脉注射pbs组为对照组；

图9a-c是实施例9中小鼠尾静脉注射实施例2制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的pbs溶液(100μl，[cu]＝45mm)24h后，用光声成像仪检测的小鼠肿瘤部位光声成像效果；

图10是实施例10中尾静脉注射实施例2制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的pbs溶液(100μl，[cu]＝45mm)后不同时间点，cu元素在小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤的组织分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)取20mgcooh-peg-6-m溶于5mldmso中，然后将充分溶解于2mldmso中的6.91mgrgd逐滴加入到cooh-peg-6-m的dmso溶液中，搅拌反应1天，用截留分子量1000的透析袋透析三天，然后冷冻干燥，即得cooh-peg-rgd。取5mg合成的cooh-peg-rgd溶于氘代水中进行核磁共振分析(1hnmr)(见图2a)。从图中可以看出，在7.3和7.4ppm处出现的谱峰证明rgd成功连接到peg上，并通过峰面积积分可知，每一个peg上连接0.7个rgd。

(2)将双(2-二甲氨基乙基)二硫化物二盐酸盐(化合物1)(10.1g，35.9mmol)和三乙胺(10.0ml，71.7mmol)溶解在无水甲醇(100ml)中，上述混合液在室温下搅拌30min。然后将丙烯酸(48.3ml，710mmol)和对苯二酚(500mg，4.54mmol)加入到混合溶液中，50℃搅拌18h。减压蒸馏得到油状液体。加入甲基叔丁基醚(500ml)，室温搅拌12h，将得到的粗品抽滤、洗涤和干燥，得到白色粉末化合物2(11.6g)，产率92％。将化合物2(3.2g，9.08mmol)溶解在无水甲醇(50ml)中。将dtt(1.47g，9.53mmol)加入溶液中，然后室温搅拌12h。反应液减压浓缩至油状液体。后采用甲醇/甲基叔丁基醚体系重结晶，得到固体沉淀。抽滤、洗涤和干燥，得到白色固体粉末cbt(1.37g)，产率85％。取5mgcbt并将其溶于氘代水中进行核磁共振分析(h1nmr)，如图2b，2.97处为两甲基上的质子峰，可作为特征峰用于接下来的定量计算。

(3)将对醛基苯甲酸(化合物3)(500mg，3.3mmol)与hobt(0.54g，4.0mmol)溶解于重蒸的二氯甲烷(50ml)中，冰浴搅拌5min。然后将edci(1g，5.2mmol)加入到上述溶液中，撤去冰浴，室温搅拌1h。取化合物4(0.5ml，3.1mmol)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)(1ml)滴加入混合溶液中，室温搅拌6h。加入水(50ml)淬灭反应，后用二氯甲烷(dcm)(30ml*3)萃取。每次萃取时，加入1m的hcl(2ml)。调节有机层的ph为7。收集有机层，用无水硫酸钠干燥。柱层析分离(dcm:meoh＝50:1)得到白色固体粉末(化合物5)770mg，产率85％。化合物5溶于氘代氯仿中的核磁如图2c所示，10.08处为其醛基的质子峰，8.0附近为苯环上的质子峰，1.43处出现的吸收峰为末端三个甲基的质子特征峰。

(4)将化合物5(200mg，0.68mmol)用5ml混合溶剂(dcm:tfa＝4:1)溶解，室温搅拌2h，减压除去有机溶剂，得到黄色油状液体。将化合物6(172mg，0.82mmol)与hobt(110mg，0.82mmol)溶解于重蒸的二氯甲烷(20ml)中，冰浴搅拌5min。后将edci(195.5mg，1mmol)加入上述溶液中，撤去冰浴，室温搅拌1h。将上一步的黄色液体和dipea(0.5ml)滴加入混合溶液中，室温搅拌6h。加入水(50ml)淬灭反应，后用二氯甲烷(dcm)(30ml*3)萃取。每次萃取时，加入1m的hcl(2ml)。调节有机层的ph为7。收集有机层，用无水硫酸钠干燥。柱层析分离(dcm:meoh＝100:1)得到白色固体粉末(化合物7)175.4mg，产率67％。称取5mg化合物7溶于氘代氯仿中的核磁图如2d所示，1.43处原本的甲基上的质子吸收峰消失，并在1-2.5ppm处出现额外增强的吸收峰，此为化合物7中新增的亚甲基的特征峰。

(5)将化合物7(200mg，0.26mmol)加入到10ml的梨形瓶中，加入混合溶液(甲醇:二氯甲烷＝2:1)6ml溶解，后加入cbt(40mg，0.22mmol)和三乙胺(2d，催化当量)于混合溶液中，室温搅拌4h。减压除去有机溶剂，后加入少量甲醇溶解，加入乙醚析出。后离心得到白色油状液体。后加入水(5ml)溶解冷冻干燥得到白色粉末化合物8(117mg)，产率94.5％。称取5mg化合物8溶于氘代水中进行核磁测试(图2e)，醛基上的质子峰由图2c中的10.08偏移至9.86，cbt末端处的甲基质子峰依旧在2.97处，证明含对苯醛基的cbt的成功合成。

(6)在5mldmso溶剂中，利用edc/nhs活化3’3-二硫代二丙酸(5.4mg)2～4h，然后将活化好的3’3-二硫代二丙酸逐滴加入阿霉素dox的dmso溶液中(10mg，2ml)，室温搅拌反应2-4h，柱层析分离(dcm/meoh＝30:1)得到3’3-二硫代二丙酸-阿霉素,产率93.4％。称取5mg3’3-二硫代二丙酸-阿霉素溶于氘代dmso中进行核磁测试，其结果如图2f所示，14.01处的特征峰为产物中末端羧基上的质子峰。

实施例2

(1)取实施例1中制备的13.75mgcooh-peg-rgd、8.16mgedc和4.80mgnhs混合溶解于5mldmso后，搅拌活化3.5h，然后将混合溶液逐滴加入到g5.nh2的dmso溶液中(20mg，5ml)，搅拌反应2～4天，透析冻干干燥，得到g5.nh2-peg-rgd。取5mg制备的g5.nh2-peg-rgd溶于氘代水中进行核磁共振分析(1hnmr)(见图3a)并通过峰面积积分可知，平均每个g5.nh2上连接了5.3个peg-rgd。

(2)取实施例1中制备的含苯醛基末端的cbt充分溶于甲醇溶剂中(22mg，5ml)，然后将其逐滴加入到g5.nh2-peg-rgd的甲醇溶液中(52mg，10ml)室温下搅拌反应2-4h，透析冷冻干燥得到g5.nh2-peg-rgd-cbt。取5mg制备的g5.nh2-peg-rgd-cbt溶于氘代水中进行核磁共振分析(1hnmr)(见图3b)，通过峰面积积分可知，平均每个g5.nh2-peg-rgd连接上了21.5个cbt。

(3)取实施例1中制备的3’3-二硫代二丙酸-阿霉素溶于dmso溶液中(8.1mg)、edc(20.18mg)以及nhs(12.21mg)混合溶解于3mldmso后，搅拌活化3.5h，然后将混合溶液逐滴加入到g5.nh2-peg-rgd-cbt的dmso溶液中(42mg，10ml)，室温下搅拌反应3天，透析冷冻干燥。取5mg制备的g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox溶于氘代水中，进行核磁共振分析(1hnmr)(见图3c)。

(4)取g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox(56.7mg)溶于10ml超纯水中，然后向其滴加cucl·2h2o的水溶液(22.28mg，2ml)室温搅拌0.5h，然后将装置转移至37℃水浴中，向混合溶液中滴加na2s·9h2o的水溶液(156.84mg，5ml)，搅拌反应3h。最后加入117.45μl三乙胺搅拌反应半小时后再加入乙酸酐79.8μl搅拌反应12h。将最终溶液透析冻干得到{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}(简写为t)。

实施例3

取实施例2中制备的g5.nh2-peg-rgd、g5.nh2-peg-rgd-cbt、g5.nh2-peg-rgd-cbt-dox、{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}和g5.nh2分别1mg溶于2ml水溶液中，超声均匀，测量紫外吸收(见图4)。紫外结果表明，dox成功连接至树状大分子上，并且吸收峰在500nm左右，相较于纯dox的480nm处的吸收峰，有一定的偏移。形成的cus具有较强的近红外吸收，随着波长的延长吸收值越来越强，直至测量最高限值1100nm，这也充分说明了cus纳米颗粒的成功合成。

取实施例2中制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}溶于1ml超纯水中(1mg)，然并将纳米颗粒悬浮液5μl滴在铜网表面，在空气中晾干后用于tem测试(见图5a)。高分辨率tem测试结果表明cus纳米颗粒的形貌为球形，且分散均匀。分别随机测量300个cus纳米颗粒的直径,计算得到其直径为3.6±0.7nm。

取实施例2中制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}溶于1ml超纯水中(1mg)用于测表面电势和水动力直径。测定结果表明，纳米颗粒的表面电势为+0.9mv，水动力学直径为138.2nm。然后再取7mg{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}溶于7mlph为6.5的缓冲液中，分别在静置0.25h、0.5h、1h、2h、4h、12h和24h后取1ml溶液于超滤离心管中离心(8000rpm，5min)并加2ml超纯水重悬，分别测定其表面电势(图5b)。随着时间的推移，材料表面电势由电中性反转至带正电荷，在4h时材料表面电势达到了9.0mv，12h材料表面电势达到了9.5mv，并最终维持在9mv左右。

实施例4

在ep管中配制不同浓度的500μl{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}溶液([cu]＝300，600，800，1000和1200μm)，以等体积的水作对照，用1064nm的激光器照射，输出功率密度为0.6w/cm²，照射时间为5min，每5秒钟记录一次温度示数(图6a)。随后对浓度为1200μm的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}溶液用输出功率为0.6w/cm²的1064nm激光器循环照射5次，观测材料的循环升温效应以及热稳定性(图6b)。测试结果表明，在输出功率密度0.6w/cm²的1064nm激光照射下，{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的升温效应随着浓度增加而增加。当cu浓度为1200μm时，溶液温度升高至56.7℃，而作为对照的水只升至33.4℃，表明所制备的材料具有良好的光热性能。而且在循环照射升温和降温过程中，材料的溶液均能稳定地上升至56.7℃附近，随后在相似地时间长度内恢复至室温，表现出很好的稳定性。通过计算单个循环升温降温曲线(图6c)，可得{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的热转化效率为55.05％，说明cus纳米颗粒可以很好地将光能转化为热能。

实施例5

分别配置浓度为0.0025mg/ml,0.005mg/ml,0.01mg/ml,0.02mg/ml,0.04mg/ml的dox.hcl的pbs溶液(ph＝7.4)，弱酸溶液(ph＝5.5)，然后测量其紫外吸收值，制定在不同ph条件下dox的拟合标准曲线。

取{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}分别用ph＝7.4和ph＝5.5的缓冲液配置成浓度为1mg/ml的溶液，取1ml溶液放入透析袋中并置于含有9ml相应缓冲液的50mlep管中，每种缓冲液中的样品分成三组(无激光照射并且缓冲液中未加谷胱甘肽；无激光照射但有加谷胱甘肽至终浓度为10mm；在1064nm激光下照射5min并且缓冲液中有10mm的谷胱甘肽)，之后放入37℃摇床中振荡，六组实验分别命名为：tph7.4、t+谷胱甘肽ph7.4、t+谷胱甘肽+激光照射ph7.4、tph5.5、t+谷胱甘肽ph5.5和t+谷胱甘肽+激光照射ph5.5。然后分别在1、2、4、12、24、36、48和72h后取透析袋外液体1ml，用紫外-可见分光光度计测定其在480nm处的吸光值，并再向透析袋外加入1ml相应的缓冲液，其中光照组在激光照射5min后需要在480nm处测一次吸光值。结果显示加入谷胱甘肽后，药物释放效果显著提高，光照以及低的ph缓释环境也会在一定程度上提高药物释放。未加谷胱甘肽组，药物释放较低，72h药物释放量最高为19.6％，而当ph为5.5，缓冲液中含有谷胱甘肽(10mm)并光照情况下(1064nm的激光器照射，输出功率密度为0.6w/cm²，照射时间为5min)，药物释放效率在10h后可达48.6％，72小时后可到61.2％(如图6d)，这说明{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒表现出良好的谷胱甘肽响应性药物释放效果。

实施例6

以4t1细胞为模型细胞评价{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒在1064nm激光(功率0.6w/cm²)下照射10min后的化疗和光热消融联合效果。将4t1细胞种植于96孔板(0.8×10⁴个/孔)，用100μl的dmem培养基(含10％胎牛血清和1％双抗)在5％co2和37℃下培养过夜。将细胞分成4组：pbs、pbs+激光照射、{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}和{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}+激光照射组。孵育材料组的4t1细胞用含不同浓度的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}(0、50、100、200、400和600μg/ml)的dmem培养基培养24h，每个梯度做5个平行孔，以pbs作为空白对照。培养结束后用100μl的pbs清洗3次，每孔加100μl无血清培养基，然后按照之前的分组，对需要光照的组进行光照处理，即使用1064nm激光(功率0.6w/cm²)照射10min。之后在每组孔中加入10μl/孔的cck8溶液，37℃孵化3h，用酶标仪检测450nm处吸光度值，各实验组的吸光值(每组5个平行)与对照组(每组5个平行)的比值即为细胞的存活率(如图7a)。结果显示，在未经光照的实验组中，当材料总浓度达600μg/ml时，细胞存活率为27.8％，光照后，细胞存活率仅为1.6％。在实验浓度0-600μg/ml范围内，激光照射5分钟对4t1细胞的存活率均有显著性影响。

实施例7

在裸鼠体内构建4t1原位瘤模型，尾静脉注射{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒的pbs溶液并在24h后使用激光照射肿瘤部位(1064nm激光，功率1.2w/cm²，照射5min)，同时利用光热成像仪记录裸鼠肿瘤部位升温趋势以及红外热成像图(图8)。以注射pbs的裸鼠作为空白对照。相比较于对照组，实验组升温趋势更快，并且pbs组肿瘤部位温度在照射5min后最终上升至38.9℃，材料组t上升至64.2℃，说明{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}在体内也具有良好的光热升温效果。

实施例8

在裸鼠体内构建4t1原位瘤模型，通过尾静脉注射来研究{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒对裸鼠肿瘤的化疗和光热治疗联合作用。将小鼠分为4组(每组5只)：尾静脉注射pbs(100μl)没有激光照射(组1)；尾静脉注射pbs(100μl)并暴露在1064nm激光照射(0.6w/cm²)下10min(组2)；尾静脉注射g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox-cus的pbs溶液(100μl，[cu]＝45mm)，没有激光照射(组3)；尾静脉注射{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的pbs溶液(100μl，[cu]＝45mm)，24h后用1064nm激光照射10min(组4)。通过实验结果发现，第3组的小鼠注射纳米材料后，肿瘤生长速率收到一定抑制(图7b)，第4组小鼠的肿瘤在经过光照处理后肿瘤体积得到有效控制并逐渐变小直至消失，第1和2组的小鼠肿瘤持续生长，第三天开始生长速度加快。通过监测小鼠的体重变化，发现小鼠并未出现较大体重变化(图7c)。统计的小鼠生存率折线图显示(图7d)，注射材料以及光照后的小鼠存活率在37天时仍为100％，而其他组在32天时，小鼠存活率为0％。只注射材料未经激光照射的实验组中小鼠存活率相对于pbs组有一定的提高，在17天时存活率为80％，而此时两组pbs组小鼠存活率均为0％。说明{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}具有良好的化疗效果，再加上激光照射后，集合化疗与光热治疗于一体，肿瘤治疗效果得到显著提高，同时不会产生明显生物毒性。

实施例9

在裸鼠体内构建4t1原位瘤模型，通过尾静脉注射来研究{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒在裸鼠肿瘤内的光声成像效果。分别利用光声成像仪对未注射材料与注射材料24h后的小鼠肿瘤部位扫描成像(图9)。24h后肿瘤部位出现了红色信号斑点，经测量得出光声强度信号值为0.16a.u.，想较于未注射材料时的0.11a.u.，肿瘤部位光声信号得到提高，材料{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒表现出良好的光声成像性能。

实施例10

以实施例7构建的4t1原位肿瘤模型裸鼠来研究实施例2制备的{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}纳米颗粒在生物体内各组织的分布代谢情况。向裸鼠尾静脉注射{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}的pbs溶液(100μl，[cu]＝45mm)，分别在注射12、24和48h后，处死小鼠，取出各个主要器官和肿瘤部位并称重并用王水消化，然后用icp-aes测定各个组织样品中cu的含量(图10)。注射后12h,肝脏和脾脏中的cu含量达到最高，而后随着时间的推移减少。但是注射24h后，肿瘤内cu的含量达到最高，随后降低。注射后72h，各组织内的cu含量均显著降低，说明{(cus)-g5.nhac-peg-rgd-cbt-dox}在小鼠体内能被逐渐正常代谢清除。