一种芬苯达唑在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种芬苯达唑在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

肿瘤是引起人类死亡的主要原因之一，其发病率与致死率总体呈逐年上升的趋势。在我国，随着城市化进程的加快，肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中长期居于首位。虽然关于肺癌的研究取得了很多进展，包括筛查和治疗方面，但肺癌患者的总体生存率仍然较低，肿瘤复发率目前仍保持不变。肺癌复杂的发病机制、治疗拮抗的发生、高发的复发转移且抗肿瘤治疗毒副作用大、精准性差等因素均是导致总体治疗效果不佳的重要原因。因此，开发新型的抗肿瘤药物是控制肺癌进展的重要方向。

芬苯达唑，是苯并咪唑类驱虫剂，分子式为c15h13n3o2s，结构如式(i)所示。研究表明，其对胃肠道寄生虫的成虫及幼虫都有高度驱虫活性，并有极强的杀虫卵作用。芬苯达唑的驱虫机制可能与扰乱微管形成，破坏动力微管，诱导胚胎发育停滞有关。同时，有报道称芬苯达唑还能参与许多细胞的代谢组学，干扰这些细胞的糖脂代谢。

技术实现要素：

本发明提供了一种芬苯达唑在药物制备中的应用，实验结果表明，芬苯达唑具有一定的抗肿瘤效果，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物。

一种芬苯达唑在药物制备中的应用，所述的药物为抗肿瘤药物。

作为优选，所述的抗肿瘤药物用于治疗肺癌。

作为优选，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞pc9、肺癌细胞h460或肺癌细胞a549。

作为优选，所述的抗肿瘤药物包括活性组分；

所述的活性组分由芬苯达唑和姜黄素组成。

作为优选，所述的姜黄素与所述的芬苯达唑的摩尔比为5～10:0.25～0.75。

作为进一步优选，所述的姜黄素与所述的芬苯达唑的摩尔比为5:0.25～0.5，在该摩尔比范围之内，两者具有较强的协同作用，能够显著增加抗癌效果。

作为优选，所述的抗肿瘤药物用于抑制肺癌细胞的增殖，限制肺癌细胞集落的形成。

作为优选，所述的抗肿瘤药物用于诱导肺癌细胞g2/m期阻滞

作为优选，所述的抗肿瘤药物用于诱导肺癌细胞发生细胞凋亡。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明开发了芬苯达唑新的抗癌用途，尤其是作用于肺癌；

(2)本发明通过芬苯达唑与现有抗肺癌药物姜黄素的联用，两者之间可以产生强协同作用，提高抗癌效果，降低药物用量。

附图说明

图1为实施例1中mtt实验中芬苯达唑对肺癌细胞增殖的抑制作用；

图2为实施例1中集落形成实验中芬苯达唑对肺癌细胞集落形成的抑制作用；

图3为实施例2中芬苯达唑肺癌细胞g2/m期阻滞的影响；

图4为实施例3中芬苯达唑诱导pc-9、h460和a549细胞凋亡的具体活性的结果图；

图5为实施例3中芬苯达唑诱导肺癌细胞核固缩，核碎裂，引起细胞凋亡的结果图；

图6为实施例4中芬苯达唑与姜黄素协同抑制pc-9细胞的结果；

图7为实施例4中芬苯达唑与姜黄素协同抑制h460细胞的结果；

图8为实施例4中芬苯达唑与姜黄素协同抑制a549细胞的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1细胞增殖和集落形成实验

通过mtt实验进行肿瘤细胞增殖实验，分析芬苯达唑对细胞增殖的影响。在96孔板中按3000个/孔铺入细胞，待细胞贴壁后加入不同药物浓度(0.05-200μm)的芬苯达唑，药物作用48h后加入25μl/孔mtt溶液(5mg/ml)。继续孵育4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150uldmso溶解结晶物。用酶联免疫监测仪在490nm波长上测定各孔光吸收值，计算ic50值，结果如图1所示。结果显示：药物作用48h后能够剂量依赖性地抑制肺癌细胞株的增殖，其中pc9的ic50最低，药物最敏感。

肿瘤细胞能够无限增殖形成细胞集落，通过集落形成实验，我们可以了解药物对细胞增殖的影响。在6孔板中按1000个/孔将细胞均匀铺入，待细胞贴壁后加入一系列浓度的药物，作用24h后撤去药物，加入新鲜培养基继续培养，待细胞形成肉眼可见的集落，用4％多聚甲醛固定之后用结晶紫染色，比较各孔间集落的大小和数量，结果见图2。结果显示，芬苯达唑能浓度依赖性地限制肿瘤细胞集落形成。

实施例2

细胞周期是一个受严密调控的有序发生的事件，基因组dna完成复制，随后基因组均等地分裂成两个相似的细胞。细胞周期可分为四期：g1，s，g2和m期。当细胞接收到信号说现在不利于分裂，或者时机不成熟，细胞就会在细胞周期的checkpoint停下来，进行检查。当时机成熟时，就继续分裂。当检查发现出现无法修复的错误时，细胞就会启动凋亡程序。在6孔板中均匀铺入细胞，待细胞贴壁后加入不同浓度的芬苯达唑(0.5-2μm)，作用24h后收集细胞，加入预冷的75％乙醇-20℃固定。之后离心收集细胞，以1ml的pbs洗细胞一次，加入500ul溴化乙锭(pi)避光孵育10分钟后流式细胞仪上机检测细胞的周期分布，结果见图3。结果表明，芬苯达唑能诱导肺癌细胞g2/m期阻滞。

实施例3

将肺癌细胞均匀铺入6孔板中，不同浓度的芬苯达唑(0.5-2μm)作用48h后，利用annexinv-fitc/pi双染法在流式细胞仪上检测芬苯达唑诱导肺癌细胞凋亡的效果。发现芬苯达唑作用48h后能够剂量依赖性的诱导pc-9、h460和a549细胞产生凋亡，结果见图4。图4的结果表明芬苯达唑能显著诱导肺癌细胞发生细胞凋亡。

利用hoechst33258凋亡染色试剂盒染细胞核，通过观察细胞核的荧光染色情况判断细胞核形变程度，从而反映细胞凋亡的情况。发现不同浓度的芬苯达唑作用pc-9和h460细胞24h后，其细胞核发生核固缩核碎裂等凋亡表征，显示为高荧光强度或碎裂的荧光小点，表明细胞发生凋亡(图5)。

实施例4芬苯达唑与姜黄素的协同试验

在96孔板中按3000个/孔铺入细胞，待细胞贴壁后加入不同药物浓度的芬苯达唑，姜黄素单药或两者的联合(溶剂为dmso)，药物作用48h后加入25ul/孔mtt溶液(5mg/ml)。继续孵育4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150uldmso溶解结晶物。用酶联免疫监测仪在490nm波长上测定各孔光吸收值，计算联合系数(ci)，结果见图6-图8。图6-图8中的横坐标药物浓度单位为μm，溶剂为dmso；纵坐标为存活率。

根据ci值可以判断两者之间的相互作用，当0.9≤ci≤1.1，表示两者为叠加作用；当0.8≤ci<0.9，表示两者为低度协同作用；当0.6≤ci<0.8，表示两者为中度协同作用；当0.4≤ci<0.6，两者为高度协同作用；当0.2≤ci<0.4，两者为强协同作用。

结果显示，当采用不同浓度的芬苯达唑(fen)与姜黄素(cu)进行联合处理时，表现出不同的协同作用。

针对pc-9细胞，5μm的姜黄素与0.25μm的芬苯达唑组合，药物联合指数为0.360，两者为强协同作用；5μm的姜黄素与0.5μm、0.75μm的芬苯达唑组合，药物联合指数为0.429和0.569，两者为高度协同作用；10μm的姜黄素与0.25μm、0.5μm和0.75μm的芬苯达唑组合，药物联合指数分别为0.471、0.552和0.541，两者为高度协同作用。

针对h460细胞，5μm的姜黄素与0.25μm的芬苯达唑组合，药物联合指数为0.417，两者为高度协同作用；其他比例的组合，也都基本为协同作用。

针对a549细胞，5μm的姜黄素与0.25μm、0.5μm的芬苯达唑组合，药物联合指数分别为0.523和0.537，两者为高度协同作用；其他比例的组合，也都基本为协同作用。

由此可见，芬苯达唑与姜黄素有协同作用，两药联合能降低药物起效的浓度，明显抑制肺癌细胞增殖。