一种用于胆管修复的3D打印支架及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种用于胆管修复的3d打印支架及其制备方法。

背景技术：

胆道手术是外科手术的难点，术中损伤胆管的修复、修复后发生再狭窄以及胆道恶性狭窄的治疗一直是腹部外科的难题。近年来，随着临床对胆道远端oddi括约肌功能的逐步重视，各种形式的胆道修复术得到了发展。目前国内外开展的多为自体组织修复，如带血管蒂胆囊瓣、胃瓣、空肠瓣等胆道修复。但由于自体组织必须取自健康部位，增加了创伤，且远期疗效尚不肯定，而同种异体或异种移植又存在难以避免的免疫排斥，人工材料因此成为克服组织缺损的第三种选择。20世纪80年代组织工程学的出现，为人类修复器官缺损带来了新的希望。

组织工程的三个关键要素是支架材料、种子细胞以及细胞和材料的复合。支架在组织工程策略中扮演着一个关键角色。支架不仅应为细胞提供物理支持，还应使细胞能够形成高度有序的有功能的组织。早期的研究报道用于替代胆管的不可降解型支架材料包括涤纶、聚四氟乙烯、氟橡胶等，这些不可降解材料会不可避免地引起机体的纤维细胞增生反应，对胆管上皮细胞的黏附生长以及细胞外基质的沉积造成影响。因此，不可降解材料胆管只能起到暂时替代的功用，而以可降解材料为基础的组织工程化胆管成为研究的热点。

聚己内酯(pcl)是一种半结晶性的线性疏水聚合物，具有良好的生物相容性及力学性能，降解产物于人体无害，其降解过程主要是水解及断裂过程，具有一定的抗快速降解性，是一种理想的生物医用材料。但由于pcl表面缺乏细胞亲和位点且降解速度较慢，因此该材料在应用中仍需进一步改性。

水凝胶是一种由亲水性集团相互交联构成的网络支架材料，因其与细胞外基质(ecm)具有诸多相似性，能够良好的支持附着于其表面、或包裹于其中的细胞的各项生物学行为，已被广泛用于牙周组织工程支架的研究。近年来开发出的一种新型光敏水凝胶—甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)得到了学者们的广泛青睐，其优点包括：结构上具有细胞粘附位点及基质金属蛋白酶水解位点，故可良好支持细胞的增殖及迁徙；甲基丙烯酸酐基团的存在使其具有光敏性，能够在紫外光照射下快速交联；理化性能灵活可调；能够通过诸多微制造工艺，如生物打印、光刻技术、自组装、微流体技术等，制造出具有独特形貌特点的结构单元等。gelma水凝胶在已被证实其在骨、软骨、心肌、血管等组织再生方面的独特优势，并且在基础细胞研究、细胞信号传导、药物/基因控释及生物感应等领域亦取得了较好的结果。gelma水凝胶虽然容易被生物降解，且无抗原性，具有良好的组织相容性，然而其力学性能较差。

超小型氧化铁颗粒(uspio)构建分子探针用于临床医学诊断、靶向药物输送并取得较好的效果。uspio是t2负性造影剂，使病灶与正常组织之间对比度更加显著。uspio主要成分为fe3o4或fe2o3，粒子直径小(小于30nm)，血浆半衰期长，生物相容性高。作为网状内皮系统特异性造影剂，uspio进入体内后不会被巨噬细胞吞噬，细胞代谢后进入人体正常血浆铁池进一步代谢，毒副作用低。

骨髓间充质干细胞(bmsc)具有强大的增殖能力及多向分化潜能，在体内、外均有向神经细胞分化的潜能；且具有来源广泛、易于培养和自体移植不引起排斥反应；不涉及伦理问题等特点，是目前神经组织工程理想的种子细胞。

可见，有必要对制备一种具有mri成像功能，能够负载骨髓间充质干细胞(bmsc)的复合管状支架，提高细胞与支架的融合度，改善支架材料的生物相容性，对胆管进行诊疗一体化修复。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于胆管修复的3d打印支架及其制备方法，该支架具有mri成像功能以及良好的生物相容性，能够负载骨髓间充质干细胞，且细胞与支架的融合度高，可对胆管进行诊疗一体化修复。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种用于胆管修复的3d打印支架，其特征在于，所述支架为复合管状支架，包括pcl管状支架，gelma包覆在pcl管状支架的表面形成gelma外壳，所述gelma外壳中含有多肽和mri成像剂。

本发明利用聚己内酯(pcl)作为支架内层，甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)作为支架外壳，并加入多肽和mri成像剂，利用3d打印技术开发出一种新型的复合管状支架材料。gelma水凝胶与pcl复合，能够增强细胞黏附，改善pcl的亲水性和调节pcl的降解速度，具有良好的机械强度使该复合管状支架材料能够负载骨髓间充质干细胞(bmsc)，对胆管进行修复。此外，多肽能够促进细胞的粘附和增殖，同时加入mri成像剂，使该复合管状支架具有优异的mri成像性能，从而实现胆管修复的诊疗一体化。

优选地，所述多肽包括ikvav多肽、max1多肽、rad16-ii多肽、yigsr多肽中的至少一种，促进细胞的粘附和增殖。

优选地，所述mri成像剂包括uspio粒子、mno纳米粒子、nagdf4纳米粒子中的至少一种，使得支架具有mri成像功能。

本发明还提供了上述用于胆管修复的3d打印支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用3d打印技术，将pcl逐层打印得到pcl多孔管状支架；

(2)将pcl多孔管状支架置于含有gelma、多肽和mri成像剂的混合溶液中充分浸润后，在外加光源照射下完成固化，得到所述用于胆管修复的3d打印支架。

优选地，所述步骤(1)中，将pcl颗粒放入3d打印机料筒内，对腔体和喷嘴进行加热，熔融pcl颗粒；待pcl颗粒熔融后，开启气压，调节气压和电压，待喷嘴稳定出丝后，将pcl丝打印到金属旋转轴上，通过控制喷嘴与金属棒的距离、喷嘴的旋转速率和移动速率、支架的打印层数，得到pcl管状支架；

3d打印的工艺参数具体为：腔体温度为50～100℃，优选为70℃；喷嘴温度为50～150℃，优选为95℃；加热时间为1～3h，优选为2h；金属轴直径为1～10mm，优选为5mm；喷嘴与金属棒的距离为1～6mm；优选为2mm；喷嘴的旋转速率和移动速率为500～2000mm/min，优选为1000mm/min；打印层数为50～150层，优选为100层。本发明通过优选上述3d打印的工艺参数，打印得到的支架具有菱形多孔结构，具有良好的性能；尤其当腔体温度为70℃；加热时间为2h；金属轴直径为5mm；喷嘴的旋转速率为1000mm/min；打印层数为100层，打印得到的支架置于含gelma、多肽和mri成像剂的混合溶液充分浸润后，成胶效果最好；当喷嘴温度为95℃；喷嘴与金属棒的距离为2mm；喷嘴移动速率为1000mm/min，打印得到的支架丝径均一，不变形，具有较好的外观、直径和性能，符合本发明的生物研究要求。

优选地，所述含有gelma、多肽和mpi成像剂的混合溶液的制备方法，包括以下步骤：

(2.1)在pbs溶液中加入gelma，水浴加热使其充分溶解，得到gelma溶液；

(2.2)在gelma溶液中加入多肽粉末，充分混匀，得到含gelma和多肽的溶液；

(2.3)将含gelma和多肽的溶液与mri成像剂混合均匀，得到含gelma、多肽和mri成像剂的混合溶液。

优选地，所述步骤(2.1)中，gelma溶液中gelma的浓度为1～10w/v％，优选为5w/v％；水浴加热的温度为30℃～40℃；优选37℃，水浴加热的时间为20～40min，优选为30min。

优选地，所述含gelma和多肽的溶液中多肽的浓度为80-800μg/ml，优选为400μg/ml，更有利于骨髓间充质干细胞粘附生长。

优选地，所述步骤(2.3)中含gelma和多肽的溶液与mri成像剂的体积比为1:1～10:1，优选为5:1，mri成像的效果较好，且细胞毒性小。

本发明通过确定混合溶液中gelma、多肽和mri成像剂复配比例，制备得到复合管状支架材料具有良好的生物相容性，能够负载骨髓间充质干细胞，并具mri成像功能。

优选地，所述步骤(2)中，外加光源的波长为365～455nm，优选为405nm；光照功率为1～4w，优选为3w；光照时间为10～100s，优选为50s，成胶效果较好。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用具有良好力学性能的聚己内酯作为复合管状支架的内层，增强了复合支架的力学性能，有利于维持支架形状；利用gelma作为支架外壳，提高复合支架的生物相容性；加入多肽促进了细胞的粘附与增殖；mri成像剂使得复合管状支架具有mri成像功能。该复合管状支架具有优异的胆管修复效果，为胆管修复的诊疗一体化提供了新思路。

附图说明

图1纯pcl管状支架和pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架及电镜图(a，b，c为纯pcl管状支架及电镜图；e，d，f为pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架及电镜图)。

图2pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架力学性能。

图3pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架的细胞增殖。

图4pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架负载bmsc细胞形态检测。

图5pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架的(a)横截面和(b)纵截面的mri图。

图6不同浓度的ikvav多肽对bmsc细胞粘附的影响。

图7含有不同浓度uspio的gelma水凝胶对bmsc细胞毒性作用。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：纯pcl支架的制备

首先将2g的pcl颗粒放入高压近场直写3d打印机料筒内，然后将加热腔温度设置为70℃，喷嘴温度设置为95℃，加热2h，熔融pcl颗粒。待pcl熔融后，开启气压，调节为7kpa，同时施加电压4kv，待喷嘴稳定出丝后，将pcl丝打印到5mm直径的金属旋转轴上，喷嘴距离金属棒表面2mm，旋转速度为1000mm/min，同时喷嘴移动，移动速度为1000mm/min，打印100层。

实施例2：纯pcl支架的制备与表征

首先分别将1～5g的pcl颗粒放入高压近场直写3d打印机料筒内，然后将加热腔温度设置为70℃，喷嘴温度设置为95℃，加热1～3h，熔融pcl颗粒。待pcl熔融后，开启气压，调节为7kpa，同时施加电压4kv，待喷嘴稳定出丝后，将pcl丝打印到5mm直径的金属旋转轴上，喷嘴距离金属棒表面2mm，旋转速度为1000mm/min，同时喷嘴移动，移动速度为1000mm/min，打印100层。

综合考虑支架的外观、直径、性能，取最佳的pcl投料以及加热时间(2gpcl，加热2小时)制备的支架，利用扫描电镜对其进行表征，如图1所示，pcl管状支架具有均匀的菱形多孔结构，且丝径均一，约在5-7μm，有利于细胞粘附生长。

实施例3：pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架制备及表征

(1)用pbs将gelma配置成5w/v％溶液，37℃水浴加热30min，期间震荡3次，让其充分溶解，备用；

(2)称取一定量的ikvav粉末，加入(1)中的gelma溶液，ikvav最终浓度为400μg/ml，用高速旋涡混匀器充分混匀ikvav，备用；

(3)将(2)中制备好的gelma/ikvav溶液与制备好uspio按照体积比5(gelma/ikvav):1(uspio溶液)混合，并用高速旋涡混匀器充分混匀，制备最终gelma/ikvav/uspio溶液，备用；

(4)将实施例1中的pcl管状支架，充分与(3)中的gelma/ikvav/uspio溶液浸润，然后用405nm，3w光源光照50秒，充分固化gelma/ikvav/uspio溶液，最终制备出gelma/ikvav/uspio溶液复合管状支架。

利用扫描电镜对本实施例制备的pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架进行表征，如图1所示，gelma/ikvav/uspio凝胶均匀填充了pcl管状支架的孔隙，同时pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架表面具有微孔结构，利于细胞粘附生长。

实施例4：pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架力学性能检测

将实施例3中制备的pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架剪成5cm×1cm(长×宽)的矩形样品，并测量厚度；将样品夹持在水凝胶压力仪上，夹持长度为1cm，以10mm/min的速度拉伸直到样品断裂；根据上述测试条件，获得应力-应变曲线，并根据此获得样品相关机械性能。如图2所示，支架抗压强度可以达到45kpa，杨氏模量可达56.75kpa，证明pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架具有良好的力学性能。

实施例5：pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架消毒及bmsc细胞种植

首先将实施例3中制备的pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架依次用75％酒精、无菌pbs、无菌dmem/f12+glutamax细胞培养浸泡各1小时，对支架进行消毒备用。然后，用密度为1×10⁵个/毫升的bmsc细胞悬液滴加在消毒后的pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架表面后进行常规细胞培养，连续培养13天，期间对细胞进行相应的细胞学表征。

实施例6：pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架细胞增殖检测

通过cck-8法对实施例3的pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架进行细胞增殖检测。本实验所用的细胞是成骨髓间充质干细胞(bmsc)，而培养该细胞所用的培养液是含有10％的胎牛血清和1％的双抗(青霉素和链霉素的混合液)的dmem的培养液，并且培养条件是在温度为37℃和co2浓度为5％的培养箱中。在培养的过程中，每两天要给细胞换一次培养液，换细胞培养液的目的是为细胞增加新的营养物质、去除不贴壁的细胞以及细胞的代谢物。首先在96孔板中分别植入两组支架，取培养第3代的bmsc细胞，以2×10⁴/ml的密度，各取200μl接种到之前植入支架的96孔板中，在培养至第1、4、7、10天后各组分别选取6孔，去除培养基，分别加入cck-8试剂，按照1:10的比例加入，也就是说100μl的培养液加入10μl的cck-8试剂，继续培养2-4h。在450nm波长的条件下，使用酶标仪读取每个孔的吸光光度值。如图3所示，培养一天时，细胞的增殖率仅为20％左右，当培养至第七天时，细胞增殖率达到80％多，证明pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架具有良好的细胞相容性且与细胞的融合度很好。

实施例7：pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架负载bmsc细胞形态检测

首先将bmsc细胞按照实施例5种植在pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架上。然后，当细胞在材料上培养5天后，吸出培养基，用pbs清洗2次，加入4vol.％的多聚甲醛溶液在室温固定30min。然后用pbs清洗1次，加入0.1vol.％tritonx-100溶液避光浸泡5min，使细胞膜通透，pbs清洗3次，加入5wt.％bsa/pbs溶液浸泡2h进行封闭，pbs清洗2次，加入f-肌动蛋白染色剂浸泡染色1h，pbs清洗3次后，加入dapi染细胞核5min，最后用pbs洗3次，去除残留的染色剂。使用激光共聚焦显微镜(confocallaserscanningmicroscope，clsm)观察细胞骨架和细胞核并拍照，如图4所示，培养至13天时，细胞在各组样品中均能很好的黏附铺展，从细胞骨架和核染色图中可见细胞在材料上伸出伪足，黏附在材料表面，细胞长满纵向贯通孔周围，长入孔内部。结果证明pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架是一种良好的细胞粘附材料。

实施例8：pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架的mri成像能力检测

首先将pcl/gelma/ikvav/uspio复合管状支架放入离心管中，然后在临床3t全身磁共振扫描仪(philipsachieva，best，thenetherlands)中，对所有复合管状支架进行t2加权成像(t2wi)，t2wi采集参数为：tr＝5000ms，te＝5.8ms，fov＝8mm×8mm，矩阵尺寸＝64×64，面内分辨率＝125mm×125mm，切片厚度＝0.8mm。其结果如图5所示，纵截面和横截面的mri成像结果显示，复合管状支架具有良好的mri造影性能，为胆管修复的诊疗一体化提供了可能性。

实施例9：不同浓度的ikvav多肽对骨髓间充质干细胞粘附率影响的检测

粉状ikvav溶于pbs，配成五个浓度(80、100、200、400和800μg/ml)待用。将未做过任何化学处理的圆形盖玻片用75％的医用酒精浸泡4小时，晾干后放入12孔板中，用几种浓度的ikvav多肽溶液包被，放入培养箱孵育4小时，pbs轻轻洗一次后接种浓度为4×10⁵/ml的骨髓间充质干细胞，每孔接种细胞数为4×10⁵个，让细胞粘附24h后进行消化计数并分析。如图6所示，几种浓度下细胞的贴壁率，细胞的贴壁率等于细胞的贴壁数除以接种数量再乘以100％，其中400μg/ml的浓度相比其它浓度更适合细胞的贴壁，在此浓度下细胞存活率更高，为此本研究优选ikvav的浓度为400μg/ml。

实施例10：不同浓度的uspio对骨髓间充质干细胞活性的影响

参照实施例3的方法，制备含有不同浓度uspio的gelma水凝胶(gelma:uspio＝1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1)。然后取培养第3代的bmsc细胞，以1×10⁴/ml的密度，各取100μl接种到96孔板中，待细胞贴壁后加入含有不同浓度uspio的gelma水凝胶。培养24h后，去除培养基，分别加入cck-8试剂，按照1:10的比例加入，也就是说100μl的培养液加入10μl的cck-8试剂，继续培养2-4h。在450nm波长的条件下，使用酶标仪读取每个孔的吸光度。如图7所示，当gelma水凝胶与uspio的体积比为5:1时细胞的存活率最高，当体积比小于5:1时，表现出对细胞的毒性作用。uspio的浓度越大则mri成像的效果越好，为此在保障细胞存活率情况下，选择含有较大浓度uspio的gelma水凝胶，即优选的uspio与gelma体积比为5:1。

上述实施例中可将ikvav多肽替换为max1多肽、rad16-ii多肽、yigsr多肽，也具有促进细胞的粘附和增殖的效果。

上述实施例中可将uspio粒子替换为mno纳米粒子、nagdf4纳米粒子，也能够使得支架具有mri成像功能。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。