金黄色葡萄球菌脂磷壁酸在制备改善骨质疏松组合物的应用的制作方法

本发明涉及金黄色葡萄球菌来源的脂磷壁酸作为活性成分在制备促进动物骨量增加和改善骨质疏松及相关病症的组合物中的应用。

背景技术：

骨质疏松症是一种中老年人中常见的涉及内分泌系统及骨骼系统的代谢性骨病,以因骨量降低与骨微结构破坏导致骨脆性增加及骨折风险增大。国际骨质疏松基金会研究报告指出:中国骨质疏松症发病率约为7％,其中大于50岁的女性患病率高达50％,预估2020-2050年中国患有骨折疏松症人数约为2.9亿。临床上药物治疗主要为抗骨吸收药物、促进骨形成药物及双重作用药物联合治疗。尽管骨质疏松药物种类繁多，且在临床上取得一定的疗效，但其应用周期及剂量的维持仍然存在一定的局限性及副作用，因此迫切需要临床上研发出更高效且安全保障性更高的抗骨质疏松药物。

脂磷壁酸(lipoteichoicacid,lta)，是广泛存在于革兰阳性菌细胞壁表面的一种共有含磷酸甘油残基的分子，通过二酰基甘油固定在细胞膜上。不同细菌的lta在结构上有所差异，功能不尽相同^[1]。金黄色葡萄球菌来源的脂磷壁酸的化学结构式如下所示：

现有文献报道的lta的主要作用有：

1、促炎作用：lta是格兰阳性菌的细胞壁成分，被认为是细菌致病的重要组分。大剂量的lta可以诱导中性粒细胞和巨噬细胞产生大量炎性物质，常常被用于模拟格兰阳性菌导致的炎症^[2]。

2、抗肿瘤作用：金黄色葡萄球菌的lta能够诱导免疫细胞产生tnf-α和ifn-γ等细胞因子，具有一定的抗肿瘤作用^[3]。

3、调节作用：金黄色葡萄球菌的lta有较强的刺激机体巨噬细胞产生多种免疫活性因子的作用，可增强其吞噬以及细胞毒功能^[4]。

4、抗炎作用：从植物中提取的lta能够阻止nf-κb通路，抑制金黄色葡萄球菌诱导产生的tnf-α，从而发挥一定的抗炎作用^[5]。

5、抗衰老作用：双歧杆菌lta可通过加强大脑抗氧化活动，改善免疫功能及改变基因表达从而发挥抗衰老作用^[6]。

6、改善心肌缺血再灌注损伤：金黄色葡萄球菌来源的lta预处理后，可减少再灌注期间中性粒细胞的在心肌的积聚，从而改善心肌再灌注损伤^[7]。

至今为止，未有lta具有抗骨质疏松，促进骨量增加作用的相关报道，通过lta已知的性质无法推断其是否具有抗骨质疏松的作用。

参考文献

1.siegfriedmorath,sonjavonaulock,thomashartung.structure/functionrelationshipsoflipoteichoicacids.jendotoxinres2005；11(6):348-56.

2.hoogerwerfjj,devosaf,bresserp,etal.lunginflammationinducedbylipoteichoicacidorlipopolysaccharideinhumans.amjrespircritcaremed2008；178(1):34-41.

3.okamotom,oheg,oshikawat,furuichis,etal.enhancementofanti-cancerimmunitybyalipoteichoic-acid-relatedmoleculeisolatedfromapenicillin-killedgroupastreptococcus.cancerimmunolimmunother2001；50:408–1610.1007/s002620100207

4.vanderdoesam,etal.antimicrobialpeptidehlf1-11directsgranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor-drivenmonocytedifferentiationtowardmacrophageswithenhancedrecognitionandclearanceofpathogens.antimicrobagentschemother2010；54(2):811–6.

5.ahnje,kimh,chungdk.lipoteichoicacidisolatedfromlactobacillusplantarummaintainsinflammatoryhomeostasisthroughregulationofth1-andth2-inducedcytokines.jmicrobiolbiotechnol

2019；29(1):151-159.

6.yizj1,fuyr,lim,etal.effectofltaisolatedfrombifidobacteriaond-galactose-inducedaging.expgerontol2009；44(12):760-5.

7.schoberp1,opreag,mersmannj,etal.lipoteichoicacidinducesdelayedmyocardialprotectioninisolatedrathearts:acomparisonwithendotoxin.resuscitation2008；79(2):311-5.

技术实现要素：

本发明的目的在于提供金黄色葡萄球菌来源的脂磷壁酸在改善骨质疏松及其相关疾病的应用。

本发明所采取的技术方案是：进行小鼠对照实验验证金黄色葡萄球菌来源的lta促进增加小鼠骨量。首先将小鼠分为两组，每组小鼠5只，适当调整使每组小鼠总体重大致相等。2组分组分别为生理盐水处理组、lta处理组。对照组腹腔注射200μl生理盐水，实验组腹腔注射lta。注射量为200μl腹膜内注射，lta浓度为250μl/ml，每周2次注射。处理6周。周后进行取材，取小鼠股骨进行microct扫描分析，比较不同组内骨量变化。

进一步地，验证lta抗骨质疏松效果。按照试验分组进行处理，将c57/bl6小鼠饲养至8周龄，逐只称重，淘汰活力差及体重过大者，将剩余小鼠随机分成三组，每组6只，适当调整使每组小鼠总体重大致相等。三组分组分别为假手术+生理盐水处理组、卵巢切除+生理盐水处理组、卵巢切除+lta处理组。除假手术+生理盐水组外，其余两组小鼠皆进行卵巢切除手术。假手术+生理盐水组腹腔注射生理盐水,阳性对照组进行卵巢切除后腹腔注射生理盐水，实验组进行卵巢切除后腹腔注射lta进行处理。注射量为200μl腹膜内注射，每周2次注射，处理8周。8周后进行取材，取小鼠股骨进行microct扫描分析，比较不同组内骨量变化。

本发明的有益效果是：发明人首次通过动物实验发现，金黄色葡萄球菌来源的脂磷壁酸可以有效增加骨质疏松动物的骨量，改善骨质疏松，有望用于治疗脆性骨折、肩周炎、椎间盘突出、椎管狭窄、骨质增生、颈椎病、骶管囊肿等骨质疏松相关病症。

附图说明

图1是生理盐水组与lta注射组小鼠的骨生长情况对比，图中，(a)骨体积分数(bv/tv)，(b)骨小梁数量(tb.n)，(c)平均骨小梁间距(tb.sp)，(d)骨小梁平均厚度(tb.th)。

图2是假手术+生理盐水组、卵巢切除+生理盐水组、卵巢切除+lta组小鼠的骨生长情况对比，图中，(a)骨体积分数(bv/tv)，(b)骨小梁平均厚度(tb.th)，(c)骨小梁数量(tb.n)，(d)平均骨小梁间距(tb.sp)。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

实验一：金黄色葡萄球菌来源的lta促进增加小鼠骨量实验

实验材料：7周龄雄性c57/bl6小鼠，由南方医科大学南方医院动物实验中心所提供，饲养于spf级动物饲养房内、250μl/ml的金黄色葡萄球菌来源的lta，由sigma公司购买，货号为l2515。

实验步骤：

1)分组：按照试验分组及处理，将c57/bl6小鼠饲养至8周龄，逐只称重，淘汰活力差及体重过大者，将剩余小鼠随机分成2组，每组5只，适当调整使每组小鼠总体重大致相等。2组分组分别为生理盐水处理组、lta处理组。

2)处理：对照组腹腔注射200μl生理盐水，实验组腹腔注射lta。注射量为200μl腹膜内注射，lta浓度为250μl/ml，每周2次注射。处理6周。

3)扫描：6周后进行取材，取小鼠股骨进行microct扫描分析，比较不同组内骨量变化。试验小鼠分组和处理情况见表1。

表1试验动物分组与处理情况

实验结果如图1所示。造模6周后，相对于生理盐水组，lta组的小鼠的骨体积分数(bv/tv)，骨小梁数量(tb.n)和骨小梁平均厚度(tb.th)明显更高，而平均骨小梁间距(tb.sp)则明显降低，说明lta明显增加了小鼠的骨量。

实验二：lta抗骨质疏松实验

实验材料：8周龄雌性c57/bl6小鼠，由南方医科大学南方医院动物实验中心所提供，饲养于spf级动物饲养房内、250μl/ml的金黄色葡萄球菌来源的lta，由sigma公司购买，货号为l2515。

实验步骤：

1)分组：按照试验分组进行处理，将c57/bl6小鼠饲养至8周龄，逐只称重，淘汰活力差及体重过大者，将剩余小鼠随机分成三组，每组6只，适当调整使每组小鼠总体重大致相等。三组分组分别为假手术+生理盐水处理组、卵巢切除+生理盐水处理组、卵巢切除+lta处理组。

2)处理：除假手术+生理盐水组外，其余两组小鼠皆进行卵巢切除手术。假手术+生理盐水组腹腔注射生理盐水,阳性对照组进行卵巢切除后腹腔注射生理盐水，实验组进行卵巢切除后腹腔注射lta进行处理。注射量为200μl腹膜内注射，每周2次注射。处理8周。

3)扫描：8周后进行取材，取小鼠股骨进行microct扫描分析，比较不同组内骨量变化。试验小鼠分组和处理情况见表2。

表2试验动物分组与处理情况

实验结果如图2所示。造模8周后，进行卵巢切除的2组小鼠均出现明显的骨质疏松表现，说明实验造模是成功且稳定的。相对于卵巢切除+生理盐水组，卵巢切除+lta组小鼠的骨小梁数量(tb.n)和平均骨小梁间距(tb.sp)变化虽然不是很明显，但骨体积分数(bv/tv)和骨小梁平均厚度(tb.th)明显更高，说明lta在一定程度上改善了骨质疏松。

综合实验一与实验二的结果来看，金黄色葡萄球菌来源的脂磷壁酸具有促进动物骨量增加的作用，显著改善了动物骨质疏松的情况。以金黄色葡萄球菌来源的脂磷壁酸作为活性成分有望用于制备改善动物骨质疏松及相关疾病的组合物。特别地，相关疾病可以是脆性骨折、肩周炎、椎间盘突出、椎管狭窄、骨质增生、颈椎病、骶管囊肿，及其并发症的任一种或多种的组合。