一种从怀菊花中提取的金合欢素在制备雌激素样药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药，特别是一种从怀菊花中提取的金合欢素在制备雌激素样药物中的应用。

背景技术：

植物雌激素存在于一些天然植物中，具有雌激素样作用。植物雌激素可与体内雌激素受体和雌激素相关受体结合起到双向调节雌激素受体作用，显示出雌激素样活性。天然的植物雌激素相比于合成的雌激素，其雌激素样活性要低，但引起的乳腺癌、子宫内膜癌等副作用也少，安全性高。因此对植物雌激素的研究逐渐成为热点。

怀菊花有很高的药用价值，属于药用菊，味甘苦，性凉，含有约0.13％挥发油、菊甙、腺嘌呤、胆碱、水苏碱、微量维生素a样物质、维生素b、氨基酸和刺槐素等。菊花不但有清香之气，使人神怡，而且可缓解两眼昏糊、头晕、头痛等，有清熟、解毒、祛风、平肝、明目等功效。

金合欢素别名5,7-二羟基-4'-甲氧基黄酮、刺槐黄素、刺槐素，分子式为c16h12o5，分子量为284.27，是一种广泛存在于自然界的天然黄酮类化合物，目前发现金合欢素具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎抑菌、抗骨质疏松、抗肿瘤、免疫调节、保护心脏和神经系统等功效。但从怀菊花中提出金合欢素，并用于制备雌激素样作用的药物未见公开报道。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从怀菊花中提取的金合欢素在制备雌激素样药物中的应用，可有效解决从怀菊花中提取金合欢素，并用于制备雌激素样药物的问题。

本发明解决的技术方案，一种从怀菊花中提取的金合欢素，分子式为c16h12o5，分子结构式为：

提取方法是，

将怀菊花用体积浓度50％丙酮组织破碎提取两次，合并滤液，低温减压浓缩得总浸膏；总浸膏用水分散溶解，采用浸膏液等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，依次得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；称取干燥后的乙酸乙酯部位，以乙酸乙酯溶解，硅胶拌匀后蒸干，进行硅胶柱层析，以二氯甲烷︰甲醇等于50︰1的比例进行洗脱，旋干水溶上toyopearlhw-40，依次用水及不同比例的含水甲醇梯度洗脱，洗脱部分依次上sephadexlh-20、ods、silicagel、mclgelchp-20柱，结合制备高效液相和重结晶的方法分离纯化，得怀菊花金合欢素。

该怀菊花金合欢素具有雌激素样作用，有效用于制备雌激素样作用的药物。

本发明首次发现怀菊花金合欢素在体内有雌激素样作用，且是通过雌激素受体途径发挥作用的，开辟了金合欢素的新用途，具有良好的推广和应用价值。

附图说明

图1为本发明怀菊花金合欢素的分子结构式图。

图2为本发明怀菊花金合欢素的¹³c-nmr谱图。

图3为本发明怀菊花金合欢素的¹hnmr谱图。

图4为本发明怀菊花金合欢素在小鼠体内的雌激素样作用图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明一种从怀菊花中提取的金合欢素，提取方法是，称取怀菊花12kg，每次用12l体积浓度50％丙酮组织破碎提取两次，合并滤液，45℃低温、压力30hpa浓缩得总浸膏3.8kg；总浸膏用4l水分散溶解成浸膏液，采用浸膏液等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，依次得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；取干燥后的乙酸乙酯部位360.0g，再用乙酸乙酯溶解，硅胶拌匀，蒸干，进行硅胶柱层析，以1l的二氯甲烷︰甲醇体积比50︰1的比例混合在一起作为洗脱液进行洗脱(注：洗脱液的用量是多少？)，旋干，再水溶上toyopearlhw-40，依次用体积浓度90％、70％、50％、30％含水甲醇梯度洗脱，每梯度200ml，70％洗脱部分上sephadexlh-20、ods、silicagel、mclgelchp-20柱，结合制备高效液相和重结晶的方法分离纯化，得怀菊花金合欢素13.3g，纯度为98.7％。

按上述方法反复进行5次提取，均取得了相同或相近似的结果，平均每1kg怀菊花得1.11g金合欢素。

本发明提取物经¹hnmr和¹³c-nmr测定，其图谱见图2、图3，其分子结构式见图1，分子式c16h12o5，分子量284.27，鉴定为怀菊花金合欢素，并经实验具有很好的雌激素样作用，可有效用于制备雌激素样药物，实现怀菊花金合欢素在制备雌激素样药物中的应用，有关实验资料如下：

1实验材料

1.1实验动物

清洁级昆明小鼠，雌性，出生21天刚断乳,体重9-12g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2016-0011。

1.2试剂与仪器

本发明怀菊花金合欢素；戊酸雌二醇片(拜耳医药)；雌二醇(e2)elisa试剂盒(伊莱瑞特)；ab204-n型万分之一精密分析天平(mettlertoledo，sweden)；imark型酶标仪(bio-rad，usa)；ab204-n型的万分之一的电子天平(梅特勒，德国)；移液器，centrifuge-5804r小型高速低温冷冻离心机(eppendorf，德国)；超纯水(611vfsartorius，gottingen，germany)；0.9％氯化钠水溶液(河南科伦药业有限公司)；独立通风装置(江苏苏州冯氏实验动物有限公司)；mini-proteantetra电泳槽，全能型蛋白快速转膜仪(bio-rad，usa)；odyssey双色红外荧光成像系统(odyssey，usa)；-80℃超低温冰箱(海尔集团)，-20℃低温冰箱(中科美菱集团)。

2实验方法

2.1小鼠子宫增重实验

将小鼠按体重均衡和随机的原则分组,持续给药天。正常组每日灌胃蒸馏水，阳性对照组隔日灌胃戊酸雌二醇，给药组分别灌胃金合欢素35mg/kg和75mg/mg。最后一次给药后，摘眼球取血，脱颈椎处死小鼠，立即摘取子宫称重,计算子宫系数＝(子宫湿重/体重)×100％。实验平行重复三次。结果与正常组相比,计算p值，考察有无统计学意义。

2.2elisa法测血清e2的含量

小鼠摘眼球取血，血液室温静置后，3000转离心10min，取上清。按照elisa试剂盒说明书仔细操作。

2.3westernblotting检测小鼠子宫雌激素受体erα、erβ以及gpr30的表达

称取冻存于液氮中的子宫组织,按照总蛋白提取试剂盒操作步骤提取各组子宫总蛋白，bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，经sds-page电泳分离后转移至pvdf膜上，用5％脱脂奶粉封闭2h，加入一抗erα(1∶1000)、erβ(1∶1000)、gpr30(1∶1000)以及β-actin(1∶1000)。4℃孵育过夜，加入二抗(1:30000)，于37℃孵育1h，odyssey双色红外荧光成像系统进行成像，采用imagestudio软件对蛋白条带图像进行数据统计分析。

3统计分析

采用spss18.0软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)。实验数据以表示。p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异具有极显著性。

4实验结果

4.1金合欢素对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响

与正常组相比，金合欢素能显著诱导性未成熟雌性小鼠子宫系数的增加(p<0.01)。提示金合欢素在体内具有雌激素样作用。见表1。

表1金合欢素对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响

注:与正常组相比，^**p<0.01

4.2金合欢素对血清e2的影响

与正常组相比，金合欢素能显著增加小鼠血清e2的水平(p<0.01)，提示金合欢素在体内的雌激素样作用可能与增加小鼠e2水平有关。见表2。

4.3金合欢素对小鼠子宫雌激素受体erα、erβ以及gpr30的表达影响

与正常组相比，金合欢素能显著增加小鼠子宫雌激素受体erα、erβ以及gpr30的表达(p<0.05或p<0.01)。提示金合欢素在体内的雌激素样作用可能还与增加小鼠雌激素受体表达水平有关。见图4。

小鼠子宫增重实验建立用于检测雌激素活性的经典方法，主要通过测定外来雌激素对实验小鼠是否具有促进子宫生长的作用来评价雌激素样活性。我们发现金合欢素具有促进小鼠子宫增重的作用，提示金合欢素具有一定的雌激素活性。e2是体内主要由卵巢成熟滤泡分泌的一种天然雌激素，可以调节女性性器官及副性征发育，金合欢素能够提高小鼠血清中e2的含量来发挥雌激素样的作用。

雌激素发挥作用的重要途径是与er结合，er则包括经典的核受体与膜受体。其中，雌激素核受体主要有2种亚型(erα和erβ)以及雌激素膜受体gpr30。我们发现金合欢素能够显著促进雌激素受体的表达水平来发挥雌激素样的作用。

要说明的是，本发明请求保护的技术核心在于怀菊花金合欢素在制备雌激素样药物中应用的新用途，是首次发现金合欢素在体内有一定的雌激素样作用，且是通过雌激素受体途径发挥作用的，开辟了金合欢素的新用途，具有很好的推广和应用价值，经济和社会效益显著。