川贝母总苷在制备治疗哮喘药物中的用途的制作方法

本发明涉及天然药物的应用，具体涉及川贝母总苷在制备治疗哮喘药物中的用途。

背景技术：

哮喘(asthma)是一种由多种炎性细胞，如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和t淋巴细胞等浸润所致的反复发作的慢性气道炎症性疾病，临床上以气道高反应为特征，突出表现为可逆性的气道阻塞和呼吸困难，该疾病呈现高度异质性，其诱因广泛，例如尘螨、花粉或者空气污染等，均可视为哮喘的诱因。

尽管过敏反应的发展有着广泛的异质性，但是ig-e在过敏性哮喘中，对固有和特异性免疫的衔接起着至关重要的作用，并参与哮喘的各个阶段。在哮喘的发病初期，抗原被树突细胞提呈给cd4+t细胞，使其分化为th2，促进b细胞生成大量的ig-e抗体，使机体进入过敏状态；随着疾病发展，其病理进程体现为th2细胞群功能亢进，th2细胞被募集激活，诱导嗜酸性粒细胞浸润气管，进一步分泌大量的il-4、il-5、il-13等炎症因子，使气道杯状细胞呈现一个高反应的状态，黏附因子增多，加重炎症历程。

目前阻断ig-e的奥马珠单抗，对轻度哮喘患者的治疗研究表明，阻断ig-e可以减少过敏原吸入后的早期支气管收缩和血液中嗜酸性粒细胞的数量；抗il-4的单抗药品，可以显著改善大部分患者肺功能和哮喘控制指标，控制哮喘发病进程；以及其他的治疗方式：β受体激动剂、抗胆碱能支气管扩张剂、白三烯调节剂、茶碱和磷脂二酯酶抑制剂、糖皮质激素等。但是这些局部靶点的治疗方式已经不适用于高度异质性的哮喘患者，甚至一部分哮喘患者对糖皮质激素产生了很强的耐药性。而天然药物活性成分毒副作用小、多靶点治疗等优点已成为治疗哮喘、缓解炎症型药物的重要来源。

川贝母(fritillariaecirrhosaebulbus)是百合科植物卷叶贝母(川贝母)、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母、瓦布贝母的干燥鳞茎。贝母之名，始载于《神农本草经》，列为中品，曰：“贝母。味辛平，主伤寒烦热，淋沥，邪气疝，喉痹乳难，金疮风痉。”性微寒，味苦、甘。能清热化痰，润肺止咳。川贝母在中国的用药史已经超过2000年，主要用于止咳化痰。川贝母止咳化痰的功效在临床使用中，被证实无疑，但是川贝母具体发挥药效的成分未知。川贝母总苷在川贝母中广泛分布，但总苷部位的制备优化及活性研究却鲜有报道。

卵清蛋白(ova)是最经典的哮喘模型致敏剂，ova小鼠哮喘模型也是至今发展最成熟的动物模型，目前尚未有关川贝母总苷在缓解和治疗哮喘方面的报道。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的在于提供川贝母总苷在制备治疗哮喘药物中的用途，本发明公开了川贝母总苷提取物对哮喘具有缓解和治疗的作用。

技术方案：川贝母总苷在制备治疗哮喘药物中的用途。

所述的药物是治疗呼气气流减少、气喘，并伴有慢性气道炎症的药物；或所述的药物是治疗肺泡结构损伤，支气管壁增厚明显，支气管狭窄的药物。

所述川贝母总苷为川贝母总苷或包含川贝母总苷的组合物。

所述组合物由川贝母总苷添加药学上可接受的辅料制备成制剂。

所述制剂为口服制剂。

所述口服制剂为口服液、冲剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、汤剂。

川贝母总苷是川贝母总苷提取物的主要成分，川贝母总苷提取物中的川贝母总苷含量为55％-70％。

川贝母总苷提取物在制备治疗哮喘药物中的用途。

所述的川贝母总苷提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

取川贝母鳞茎粉末，乙醇提取，过滤，将滤液浓缩，用石油醚脱脂，得到水相层，用水饱和正丁醇萃取，挥干溶剂浓缩得到浸膏，用水复溶，作为上样液；量取经乙醇活化好的hpd100大孔树脂，用水洗至无醇味，湿法装柱，加水进行平衡后上样，用水淋洗，乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩得浸膏，用水复溶后冻干。

川贝母总苷在制备治疗ig-e、il-4、il-5、il-13炎症因子分泌增多的药物中的应用。

有益效果：本发明公开了川贝母总苷缓解哮喘的医药用途，设计采用了至今发展最成熟的ova哮喘动物模型，选取了最具临床症状的药效指标，经过多次实验条件优化，最终确定70％乙醇提取，石油醚脱脂，水饱和正丁醇萃取，所得浸膏经条件优化后的hpd100大孔树脂富集纯化。本发明中，哮喘模型川贝母总苷药物治疗组，ig-e、il-4含量显著降低，肺泡、支气管部位炎症浸润情况得到大幅度缓解，嗜酸性粒细胞比例显著下降。因此，川贝母总苷具有明显缓解哮喘的作用。与现有治疗哮喘的药物相比，本发明的川贝母总苷更安全有效、温和持久，且作用机理多靶点、多效应，并不会出现单一靶点药物产生强烈耐药性的状况。因此，川贝母总苷在缓解、治疗哮喘方面具备可观的开发和利用价值。

附图说明

图1三种是大孔树脂的静态吸附性能图；

图2四种不同乙醇浓度的洗脱效果图；

图3是tsf的制备流程图；

图4是ova模型的造模流程图；

图5是tsf对ova哮喘小鼠肺部病理学的影响；

图6是tsf对ova哮喘小鼠血清中ig-e含量的影响；

图7是tsf对ova哮喘小鼠肺部il-4mrna水平变化的影响；

图8是tsf对ova哮喘小鼠肺泡灌洗液(balf)中白细胞总数的影响；

图9是tsf对ova哮喘小鼠肺泡灌洗液(balf)中细胞分类计数的影响。

具体实施方式

实施例1：川贝母总苷富集提取条件优化

1、大孔树脂型号筛选

本发明比较了ab-8、d101、hpd100四种型号的大孔树脂的静态吸附、解吸性能，以筛选出适合川贝母总苷富集的大孔树脂。取上样溶液(总苷浓度0.47mg/ml)4ml，加入到放置1.0g大孔树脂的锥形瓶中，每种类型树脂平行制备3份，称定重量，密封，置摇床上进行充分震荡12h，使大孔树脂充分吸收。12h之后，称定重量，补足重量，移取上清液，13000rpm，离心5min，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法进行制备检测，计算各种树脂对川贝母总苷的比吸附量(mg/g)。将移走吸附12h的上样溶液的大孔树脂用蒸馏水充分洗涤，每次10ml洗涤，洗涤3次，移取洗涤蒸馏水至吸不上液体为止，加入95％乙醇10ml，称定重量，密封，置摇床上进行充分震荡12h，使大孔树脂充分解吸附，12h后，称定重量，补足，取上清液，13000rpm离心5min，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法进行制备检测，计算各种树脂对总苷的比解吸量(mg/g)。

从图1结果可知，三种大孔树脂的吸附率接近，但是hpd101的解析率明显优于其他2种大孔树脂，综合考虑，hpd100表现最佳性能，因此选择hpd100大孔树脂富集纯化川贝母总苷。

2、除杂溶剂和洗脱溶剂的确定

取4ml总苷上样溶液(总苷浓度0.48mg/ml)上柱(1.0g树脂装柱)，平行5份，过夜吸附，分别用水、30％、50％、70％和95％乙醇10bv进行洗脱，分别收集各浓度洗脱液，计算各浓度下的解析率％。以乙醇浓度对川贝母总苷解析率作图。

从图2结果可知，洗脱水溶液中皂苷类成分基本检测不到，因此选择水作为除杂溶剂。比较30％、50％、70％和95％不同浓度下的解析率，50％醇浓度作为洗脱溶剂最为合适。

实例2：本发明川贝母总苷的分离制备

川贝母总苷提取物的制备方法(如图3所示)：

取川贝母鳞茎粉末(过60目筛)，70％乙醇提取(85℃，微沸)，料液比1:10，提取3小时，提取2次，过滤，合并滤液，将滤液浓缩成原体积的1/3(旋蒸至无醇味)，制备川贝母总苷部位。用石油醚脱脂3次(萃取体积1:1)，得到水相层，用水饱和正丁醇萃取5-6次(萃取体积1:1)，挥干溶剂浓缩得到浸膏，用水复溶，冻干得到提取物。将提取物用单蒸水溶解(按1.0mg生药材：1ml水的比例进行溶解)，备用，作为上样液。量取经乙醇活化好的hpd100大孔树脂，用单蒸水洗至无醇味，湿法装柱，加8倍柱体积的蒸馏水进行平衡后上样，8倍柱体积的蒸馏水淋洗，10倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩得浸膏，用水复溶后冻干。经实验检测，所得川贝母总苷提取物中川贝母总苷的含量为59％。

实例3：川贝母总苷制剂的制备

川贝母总苷提取物20mg溶于10ml0.5％cmc-na中，超声20min，涡旋至混悬状态，制成口服液。

川贝母总苷提取物20mg，与糊精50mg、糖粉20mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，制备冲剂。

川贝母总苷提取物20mg，与糖粉20mg、水5mg采用常规技术制成糖浆剂，再加入淀粉70mg采用常规技术制备成丸剂。

川贝母总苷提取物20mg，与淀粉50mg、糊精50mg混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入硬脂酸镁混合，制成片剂。

川贝母总苷提取物20mg，与淀粉50mg、滑石粉5mg混合采用常规技术制成散剂。川贝母总苷提取物20mg，与淀粉70mg、糊精10mg、糖粉10mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，湿法制粒制备成颗粒剂。

川贝母总苷提取物20mg溶于20mg水，制备汤剂。

实例4：本发明tsf对ova小鼠哮喘模型的影响

1、试验方法

⑴动物分组：雌性清洁级近交系c57bl/6j小鼠，6-8周龄，体重18-20g，按体重随机分为3组，每组分8只。分别设立正常对照组、模型组、tsf药物干预组。

⑵溶液配制：

①致敏用ova-氢氧化铝佐剂混合乳剂配制：以一只小鼠的量为例，称取50μgova，用100μl注射用生理盐水溶解，4℃备用；移取氢氧化铝佐剂(含氢氧化铝40mg/ml和氢氧化镁40mg/ml)100μl。将100μlova和100μl佐剂混合，4℃摇床30min，现配现用(注：每只小鼠皮下注射0.2ml的致敏剂)。

②雾化用ova溶液配制：称取2.5gova，用100ml注射用生理盐水配制成2.5％ova的雾化液，4℃备用(现用现配)。

③0.5％cmc-na：称取5.0g羧甲基纤维素钠，缓慢加入于100℃的1000ml热水中，磁力搅拌器过夜搅拌。

④川贝母总苷溶液：称取20mg川贝母总苷提取物溶于10ml0.5％cmc-na中，超声20min，涡旋至混悬状态(注：每只小鼠给药剂量为20mg/kg/d)。

⑶模型建立：哮喘模型分为两个阶段，如图4所示。第一阶段为致敏阶段：模型组和药物组，在第0、7、14天皮下注射致敏用ova-氢氧化铝佐剂混合乳剂(0.2ml/只)进行致敏(共三次)，而正常组注射生理盐水作为空白对照。第二阶段为激发阶段：模型组和药物组，在第21天至第27天将小鼠置于自制的雾化箱内，在雾化器的协助下，用雾化用ova溶液连续雾化7天，而正常组注射生理盐水作为空白对照，每天40min。

⑷给药方案：从第0天开始至激发结束，tsf药物干预组，按照20mg/kg/d的给药剂量，用上述所配制的混悬液进行灌胃给药，每天1次，连续26天；空白对照组和模型组平行灌胃给予0.5％cmc-na空白溶剂。

⑸指标的测定与评价：

①样本采集：

取血：末次激发，禁食12h后，减掉小鼠胡须，摘眼球取血置1.5mlep管中，静置30min，3000rpm

10min离心移取上清，-80℃保存。

肺泡灌洗液(balf)：取血后，将小鼠脱颈椎处死，小鼠四肢仰卧固定于泡沫板，用酒精棉球擦拭腹部毛皮，手术剪剪开毛皮，分离组织暴露出气管，用镊子在气管下穿过两根手术线，气管上端插入尖端剪平的针头，用两个镊子将两根手术线分别将气管与针管打结固定，针筒每次吸入0.8mlpbs，针筒与针管对接牢固，防止漏泄，进行灌洗，每毫升pbs灌洗3次，每只小鼠用2.4mlpbs灌洗，确保回收率在80％以上，得到balf，灌洗液收集于2mlep管中，取适量留样进行白细胞总数计数，剩余balf在4℃下300g离心5min，收集上清液，置于-80℃保存，所得下层细胞进行细胞分类计数。

气管、肺：打开胸腔，将气管与下方连接的肺与心脏一同取下，剪断剥离开黏连的组织，将右肺上叶置于4％多聚甲醛固定保存，剩余肺组织与气管收集入ep管中，置于-80℃保存。

②细胞计数：

白细胞总数：取样收集的部分balf，用移液枪吹打混匀，取10μbalf，加入10μl2％冰醋酸，裂解红细胞，移取10μl置于改良式血细胞计数板，在显微镜下进行白细胞总数计数。

细胞分类计数：取balf离心所得细胞沉淀，加入15μlpbs，涡旋混匀，移取10μl于载玻片点板，将载玻片置于通风橱，自然风挥干，进行瑞氏-吉姆萨染色。每张片子滴加a液150μl，染1min，加入b液450μl，染10min，洗耳球不断吹匀，用水轻轻冲洗15s，晾干。正置显微镜下观察计数400个细胞，计算嗜酸性粒细胞和淋巴细胞所占比例。

③h&e染色：

干燥后的组织切片需要脱蜡及水化才能在水溶性染料中进行染色。使用二甲苯脱蜡，再依次使用纯乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇洗，最后用蒸馏水洗。甩干后置于苏木精染液中染色5-10min。经水洗等操作后，再将切片用伊红染色1-3min。然后将切片依次放入95％乙醇、纯乙醇中梯度脱水，二甲苯中透化。最后使用中性树胶封片。利用数字病理切片扫描仪对制成的切片进行扫描。

④elisa试剂盒检测：

根据欣博盛生物科技有限公司elisa试剂盒说明书检测各组小鼠血清中免疫球蛋白ig-e的表达。室温平衡板条后，加入100μl待测样品或者不同浓度的标准品，37℃条件下孵育90min。洗板5次，加入100μl生物素化抗体工作液，37℃条件下孵育60min。洗板5次，加入100μl酶结合物工作液，37℃条件下避光孵育30min。洗板5次，加入100μl显色底物(tmb)，37℃条件下避光孵育15min。最后加入100μl终止液，然后立即测定各孔在450nm波长处的吸光度值。利用绘制的标准曲线计算出各血清样本中的ig-e的浓度。

⑤rt-qpcr检测:

组织研磨：取冻存的各小鼠肺部样本，迅速剪下相同质量的肺组织(约40mg)，转移至干净的2mlrnase-freeep管中，然后用剪刀和镊子将组织剪碎。每管加入1mltrizol裂解液和不锈钢研磨球，置于研磨仪中预冷的ep管座上。设定运行参数：频率60hz；运行时间60s；运行次数5次。

总rna的提取：待组织研磨均匀后，加入200μl氯仿，上下震荡15s后室温静置5min，离心(12000g，4℃，15min)。小心吸取400μl上层无色水相，转移到新的1.5mlrnase-freeep管中。加入400μl异丙醇，混匀后静置5min并离心(12000g，4℃，10min)。此在ep管管底可见白色羽毛状rna沉淀。小心吸去上清，沿管壁加入1ml75％乙醇(用depc水配制)，对沉淀进行洗涤。离心(12000g，4℃，10min)后小心弃去上清，置于室温至rna沉淀略干。加入适量无rnase水溶解rna沉淀。

rna浓度和纯度的测量：使用nano-100超微量分光光度计检测提取到的总rna的浓度和纯度。选择基线校准(波长340nm)。取1μldepc水加到下基座上进行空白校对。滤纸吸干校对溶液后，再取1μl待测溶液加到下基座上，进行测试。期间30min进行一次空白校对。测试完毕后，记录样品中的rna浓度，默认的浓度单位为ng/μl。其中，结果中显示的260/280的值代表核酸样品的纯度，纯rna的比值约为2.0。od260/280在1.8～2.0之间可视为抽提的rna纯度较高。260/230的值代表核酸样品受污染的程度，正常范围为1.8～2.2。

rna逆转录成cdna：将测得浓度的总rna提取物，用无rnase水按1μg的上样量进行稀释。按照逆转录试剂盒说明书配制20μl的反应体系，见表1。反应程序为25℃-10min，42℃-15min，85℃-5min，冷却。经逆转录得到的cdna可直接用于下一步实验或于-80℃条件下保存备用。

表1逆转录反应体系

实时定量pcr(real-timepcr)：按照hieff^tmqpcrgreenmastermixkit(lowroxplus)的说明书配制20μl的反应体系，见表2。使用的引物序列见表3。扩增程序见表4。各mrna的表达水平以β-actin作为内参计算，使用的公式为foldchange＝2^-δδct。

表2反应体系

表3引物序列

表4扩增程序

⑥统计学分析：

数据使用spss19.0软件和graphpadprism5软件进行统计学分析，采用mean±sem表示。两组独立样本的均值比较使用student's-t检验，两组以上分析利用单因素方差分析。设α＝0.05，*p<0.05表示具有显著性差异，**p<0.01表示差异极显著。

2、试验结果

⑴tsf对小鼠肺部病理学的影响

取样后，取小鼠右肺上叶进行h&e染色，由图5可知，肺组织he染色结果显示，空白对照组表现为支气管、肺泡结构清晰，纤毛柱状上皮细胞完整，支气管壁无增厚水肿，支气管周围无炎症浸润情况；哮喘模型组表现为肺泡结构破损，偶有出现空洞，纤毛柱状上皮细胞脱落，支气管壁增厚明显，出现水肿，支气管狭窄，周围大量炎症细胞浸润；川贝母总生物碱治疗组表现为支气管、肺泡偶有破损空洞现象，纤毛柱状上皮细胞完整，大大减轻支气管壁增厚水肿的状况，改善支气管狭窄、炎症浸润情况；川贝母总苷治疗组表现为支气管、肺泡破损空洞现象减轻，纤毛柱状上皮细胞完整，支气管壁增厚水肿状况较模型组显著减轻，支气管狭窄、炎症浸润情况得到有效改善。

⑵tsf显著降低小鼠血清中ig-e的含量

elisa试剂盒检测小鼠血清中免疫球蛋白ig-e的含量，如附图6所示，发现ova诱导的哮喘小鼠血清中ig-e含量很高，而药物干预组中ig-e的含量均发生回调，药物干预组与模型组的表达具有显著性差异。ige是免疫球蛋白的一种，哮喘病理生理的整个过程都与循环血中ige的升高明显相关，在本发明的哮喘造模过程中，两个药物干预组均可以显著减少循环血中的ig-e含量，从而起到防止ige与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的高亲和力受体结合，从而避免了与过敏原接触后的介质释放；减少嗜碱性粒细胞和肥大细胞的存活；阻止ige促进的过敏反应；减少il-4和il-5的释放等一系列缓解哮喘的作用。

⑶tsf显著降低小鼠肺部il-4mrna的表达

建立ova诱导的哮喘模型后，取各组肺组织样本提取rna，分析了il-4的相对含量，结果见附图7。发现ova诱导的哮喘小鼠肺部il-4mrna高表达，而taf、tsf干预组中两种炎性因子的表达均发生回调，药物干预组与模型组的表达具有显著性差异。il-4可促进th2细胞分化、嗜酸粒细胞浸润、肥大细胞增生、杯状细胞化生、黏液高分泌和气道重塑、上调ige等一系列加重哮喘的历程，在哮喘的发病过程中，起到至关重要的作用。在本说明的哮喘造模过程中，药物可以通过抑制il-4的相对表达，从而起到减轻炎症、缓解哮喘的作用。

⑷tsf降低小鼠肺泡灌洗液(balf)中白细胞总数

ova诱导的哮喘模型取样后，用改良式血细胞计数板，在显微镜下进行白细胞总数计数，如图8所示。模型组较之于空白组，balf白细胞总数均明显增多，而taf、tsf干预组中白细胞总数均发生回调，药物干预组与模型组比较具有显著性差异。白细胞是血液中至关重要的一类细胞，是与疾病斗争的关键细胞，其数量反映了哮喘进程中，炎症的发展与浸润情况。在本说明的哮喘造模过程中，药物组可以显著降低白细胞总数，从而起到减少炎症浸润、缓解哮喘的作用。

⑸tsf对小鼠肺泡灌洗液(balf)中白细胞分类计数的影响

ova诱导的哮喘模型取样后，经瑞氏-吉姆萨染色，在显微镜下进行细胞分类计数，如图9所示。在肺泡灌洗液中，肺巨噬细胞百分比部分，模型组显著低于空白对照组，taf、tsf干预组较于模型组均有回调，总苷组与模型组比较具有显著性差异；淋巴细胞百分比部分，模型组较空白组显著上升，taf、tsf干预组较于模型组均有回调，总苷组与模型组比较具有显著性差异；嗜酸性粒细胞百分比部分，模型组较空白组显著上升，而taf、tsf干预组较于模型组均发生回调，且具有显著性差异。白细胞是免疫进程中至关重要的一类细胞，细胞分类计数可以有效分析balf中白细胞比例的变化。肺巨噬细胞，由单核细胞分化而来，广泛分布在肺内；在哮喘的发病过程中，浸润其支气管的炎症细胞主要是淋巴细胞和嗜酸性细胞，淋巴细胞能够扩大支气管粘膜上嗜酸性细胞的炎症反应，并且随着嗜酸性粒细胞的的增多,在肺内聚集、活化的调制以及与其它炎性细胞、炎性介质、细胞因子的相互作用均错综复杂，加重哮喘。在本说明的哮喘造模过程中，药物组可以显著降低淋巴细胞、嗜酸性细胞数量，从而起到减少炎症浸润、缓解哮喘的作用。