西仑吉肽在制备防治放射性肺损伤的药品中应用的制作方法

本发明涉及治疗放射性肺损伤领域，具体涉及一种西仑吉肽在制备防治放射性肺损伤的药品中应用。

背景技术：

放射治疗是肺癌治疗的重要方法。然而，放射治疗所导致的放射性肺损伤目前尚无有效的预防和治疗措施。因此，亟需寻找有效药物干预放射性肺损伤，从而改善接受胸部放射治疗患者的健康和生存质量。西仑吉肽是一种选择性抑制整合素αvβ3和αvβ5的抑制剂，在1999年，由德国默克雪兰诺公司研发并命名。在多项肿瘤相关的1/2期临床试验中，西仑吉肽显示出良好的临床用药安全性。

研究表明，研究表明西仑吉肽对整合素受体αvβ3、αvβ5具有较高的选择亲和性,可抑制tgf-β1的激活,并且可能对慢性结肠炎的纤维化发展具有抑制作用。多项研究已表明西仑吉肽能显著抑制tgfβ1的激活。patrick等人发现在胶质母细胞瘤中发现，西仑吉肽能抑制tgfβ1激活从而减弱胶质母细胞瘤的侵袭性。vincent等人发现，潜在型tgfβ1的活化会促进心脏成纤维细胞的收缩，诱发心脏纤维化，而给予原代心肌成纤维细胞西仑吉肽培养后，tgfβ1的活化显著受到抑制。li等人利用大鼠模型，发现西仑吉肽能通过减少tgfβ1的过度活化，降低细胞外基质i型胶原沉积，从而阻断克罗恩病诱导的肠纤维化的发生。而最近的一项研究表明，每日西仑吉肽腹腔注射显著减弱了小鼠系统性硬化症导致的皮肤纤维化。然而，西仑吉肽在放射性肺损伤中的作用尚不明确。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服西仑吉肽应用范围窄、放射性肺损伤无有效药物干预的缺陷；提供了一种西仑吉肽在制备防治放射性肺损伤的药品中应用；本发明利用整合素抑制剂西仑吉肽能明显预防放射性肺损伤的发生，其在防治放射性肺损伤的同时改善生存时间和健康状态。

为实现上述目的，本发明所设计一种西仑吉肽在制备防治放射性肺损伤的药品中应用。

本发明还提供了一种防治放射性肺损伤的药品，其特征在于：它包括有效量的西仑吉肽和药学上可接受的辅料。

再进一步地，所述药品中，西仑吉肽的含量为10～20mg/kg。

进一步地，所述药品中，西仑吉肽的含量为15mg/kg。

再进一步地，所述辅料为维生素c、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁和蔗糖中任意一种或两种。

再进一步地，所述药品注射制剂或口服制剂。

西仑吉肽是一个含rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列的生物活性环肽,化学名称为环(l-精氨酰甘氨酰-l-天冬氨酰-d-苯丙氨酰-n-甲基-l-缬氨酰)，英文名为cilengitide，分子式c27h40n8o7，分子量588.66，密度：1.41g/cm³，其结构式如下：

多项研究已表明西仑吉肽能显著抑制tgfβ1的激活。patrick等人发现在胶质母细胞瘤中发现，西仑吉肽能抑制tgfβ1激活从而减弱胶质母细胞瘤的侵袭性。vincent等人发现，潜在型tgfβ1的活化会促进心脏成纤维细胞的收缩，诱发心脏纤维化，而给予原代心肌成纤维细胞西仑吉肽培养后，tgfβ1的活化显著受到抑制。li等人利用大鼠模型，发现西仑吉肽能通过减少tgfβ1的过度活化，降低细胞外基质i型胶原沉积，从而阻断克罗恩病诱导的肠纤维化的发生。而最近的一项研究表明，每日西仑吉肽腹腔注射显著减弱了小鼠系统性硬化症导致的皮肤纤维化。

本发明的有益效果：

本发明西仑吉肽在制备防治放射性肺损伤的药品中应用，该西仑吉肽可明显改善照射后肺组织纤维化程度和健康状态，总生存时间增加，且未观察到致死性的副作用，具有良好的安全性。

附图说明

图1：药物处理实验小鼠的流程图；

图2：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠的生存曲线图；

图3：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠的体重曲线图；

图4：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠肺组织切片masson染色图；

图5：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠肺纤维化评分图；

图6：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠羟脯氨酸(胶原)含量测定图；

图7：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠肺泡壁厚度测定图；

图8：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠胶原蛋白转录水平测定图；

图9：对照组、西仑吉肽组、单纯照射组、照射+15mg/kg西仑吉肽组、照射+75mg/kg西仑吉肽组小鼠血浆tgfβ1水平的测定图；

图10：测定西仑吉肽对mrc-5人胚肺成纤维细胞的ic50结果图；

图11：西仑吉肽对mrc-5人胚肺成纤维细胞纤维化指标表达的影响图；

图12：西仑吉肽在mrc-5人胚肺成纤维细胞中的作用机制图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

下述西仑吉肽选用rgd126937(购自上海吉尔生化有限公司)。

实施例1西仑吉肽在小鼠放射性肺损伤模型中的实验

在小鼠放射性肺损伤模型中进行了实验。通过以16gy单次大剂量照射小鼠胸部，建立小鼠放射性肺损伤模型，观察小鼠肺纤维化程度和小鼠的健康、生存情况。

选取8周龄、雌性c57bl/6野生型小鼠250只，共分为五组。安慰剂组(50只)和单纯给药组(50只)小鼠不接受射线照射。另150只小鼠接受16gy单次大剂量胸部照射。随即将它们分为单纯照射组(50只)、照射+15mg/kg西仑吉肽组(50只)和照射+75mg/kg西仑吉肽组(50只)。分组后，给药组小鼠给予15mg/kg或75mg/kg西仑吉肽(溶于pbs)，每天一次，腹腔注射，连续给药8周。照射后每日记录各组小鼠体重和生存时间，观察至照射后第200天。分别于第6，16，20周处死小鼠(每组5只)，将肺组织固定、染色，观察肺组织切片纤维化程度，对肺切片进行ashcroft纤维化评分，测量肺组织中羟脯氨酸(胶原)含量(图1)。

实施例2西仑吉肽在减轻小鼠放射性肺损伤中的作用

如图2所示：在28周的观察时间内，正常对照组与西仑吉肽单纯给药组小鼠均未出现死亡。而单纯放疗组小鼠生存时间较对照组小鼠显著缩短，到观察终点28周时，最终仅有2只小鼠存活，中位生存时间仅为87天。照射给药低剂量组(每日15mg/kg西仑吉肽腹腔注射8周)在28周时有4只小鼠死亡，照射给药高剂量组(每日75mg/kg西仑吉肽腹腔注射8周)在28周时有7只小鼠死亡，log-rank检验提示，两组照射给药组小鼠生存显著优于单纯照射组，其中照射给药低剂量组(p<0.001)较照射给药高剂量组(p＝0.04)更为显著。

此结果提示，16gy胸部照射后给予小鼠腹腔注射西仑吉肽能给小鼠带来生存获益，其中照射给药低剂量组较照射给药高剂量组更为显著。

图3描述了小鼠的体重变化情况。单纯给药组小鼠较对照组小鼠体重未有明显变化，而16gy胸部照射减轻了小鼠的体重，从第4周开始，3组接受照射组小鼠体重低于对照组小鼠与正常给药组小鼠。至第12周开始，放疗给药组小鼠体重优于单纯照射组，但差异未达到统计学意义。

对照组与单纯给药组小鼠并未出现皮肤变化。而3组照射组小鼠照射后第4周开始，接受照射部位毛发开始变白以及出现脱毛现象，而后照射部位皮肤开始溃烂出现脱屑现象，第18周左右小鼠照射部位几乎全部脱毛。西仑吉肽给药并未明显改变照射后小鼠的脱毛现象。

放疗后第6周肺组织he染色结果可见(图4)：照射组小鼠肺泡壁增宽，肺泡腔缩小，肺泡内出现大量红细胞与炎性细胞浸润。放疗后6周小鼠肺组织并未见明显的胶原沉积，提示放疗后6周小鼠肺组织仍处于放射性肺损伤急性炎症期，并未出现显著纤维化改变。而照射给药组小鼠肺组织较单纯照射组相比，肺泡壁厚度与炎症细胞浸润情况并没有显著差异，提示西仑吉肽对于放射性肺损伤急性炎症期并无显著的干预作用。放疗后第16周与20周肺组织he染色结果可见：照射组小鼠肺泡壁呈实变改变，肺泡腔几乎消失，肺泡间质纤维细胞集聚。放疗后16周小鼠肺组织可见部分蓝色胶原沉积，多位于气道旁与肺泡间隔内。放疗后20周小鼠，肺泡间隔与气道旁可见大量蓝色胶原沉积，提示放疗后20周小鼠肺组织出现显著纤维化改变。而照射给药组小鼠肺组织较单纯照射组相比，纤维化程度显著减弱。

ashcroft法纤维化评分显示(图5)：两组照射给药组小鼠肺组织纤维化评分显著低于单纯照射组，其中照射给药低剂量组(p<0.01)较照射给药高剂量组(p<0.05)更为显著。给药组肺泡壁厚度同样显著低于单纯照射组(p<0.01)。以上结果提示：照射后每日腹腔注射西仑吉肽可以显著减轻小鼠放射性肺纤维化程度，其中照射给药低剂量组较高剂量组更为显著。

对照组小鼠肺组织羟脯氨酸含量为825ug/g，单纯给药组含量为817ug/g，单纯照射组为1117ug/g，照射给药低剂量组为891ug/g，照射给药高剂量组为967ug/g。两组照射给药组小鼠肺组织羟脯氨酸含量显著低于单纯照射组，其中照射给药低剂量组(p<0.01)较照射给药高剂量组(p<0.05)更为显著(图6)。

测定小鼠肺泡壁厚度，图7可见与单纯照射组相比，给药组小鼠肺泡壁厚度明显减低，结果具有统计学意义。

运用real-timepcr方法检测各组小鼠右肺组织col1a1基因rna表达，如图8所示：单纯照射组小鼠col1a1基因表达量显著高于对照组，但西仑吉肽给药后col1a1表达量显著降低(p<0.001)。

本研究表明，单纯照射组小鼠生存时间显著减少，体重明显减轻，肺组织纤维严重，肺纤维化ashcroft评分高，肺泡壁厚度明显增厚，羟脯氨酸含量明显升高，胶原蛋白含量明显升高；与单纯照射组相比，给予15mg/kg西仑吉肽的实验组小鼠生存时间显著延长，体重改善，肺组织纤维减轻，表现为纤维化ashcroft评分低，肺泡壁厚度减少，羟脯氨酸含量明显降低，胶原蛋白含量明显降低。

使用1.5％戊巴比妥钠注射麻醉小鼠后，摘取小鼠眼球，用1.5mlep管收集小鼠血标本，后将血标本室温静置2小时，1000g离心10分钟，分离血清，将采集好的血清置于新的干净ep管中，-80℃冰箱冻存。使用小鼠转化生长因子elisa试剂盒(ek0515，武汉博士德生物)检测收集的各组小鼠总tgfβ1与活化型tgfβ1含量。方法如下：将血清样本分成两份，第一份样品稀释20倍后，加入盐酸酸化，检测结果为总tgfβ1。第二份样品不稀释，不加入盐酸酸化，检测结果为活化型tgfβ1。

如图9所示，单纯照射组小鼠血清总tgfβ1和活化型tgfβ1含量较对照组显著升高，而照射给药组小鼠血清总tgfβ1含量较单纯照射组小鼠并无显著降低。但西仑吉肽照射给药组小鼠血清活化型tgfβ1含量较单纯照射组显著降低(p<0.05)。结果提示：西仑吉肽能抑制小鼠血清活化型tgfβ1的分泌，但对总tgfβ1分泌影响不大。

测定西仑吉肽对mrc-5人胚肺成纤维细胞的ic50结果：如图10，cck-8细胞增殖实验结果表明，西仑吉肽能显著抑制mrc-5细胞增殖，其半抑制浓度(ic50)约在0.5um左右。根据此结果，本部分中后续实验中我们将0.5um浓度的西仑吉肽来干预细胞。

将mrc-5细胞给予不同剂量(0gy-10gy)的单次照射，24小时后收集细胞上清，通过elisa法检测不同剂量照射后细胞上清中总tgfβ1与活化型tgfβ1含量，结果显示(图11a),随着放射剂量的增高，mrc-5细胞上清中总tgfβ1与活化型tgfβ1含量逐渐增高，其中8gy照射后的细胞分泌的总tgfβ1(p<0.05)与活化型tgfβ1(p<0.01)含量较对照组细胞增加最为明显。

在不同时间点提取细胞蛋白，可见mrc-5细胞接受8gy照射后，α-sma于照射后10分钟蛋白表达水平升高，随着时间推移，在照射后12小时表达水平达到顶峰。胶原的表达在照射后24小时达到最高水平，随后几乎无表达。整合素αv于照射后6小时表达水平开始升高，之后逐渐下降到照射前水平(图11b)。

接受8gy照射的mrc-5细胞，其胶原和α-sma表达水平明显升高。若给予西仑吉肽处理细胞，接受照射的mrc-5细胞的胶原和α-sma表达无升高(图12a)。如图12b所示，我们在照射前1小时给予mrc-5细胞0.5um西仑吉肽干预，照射后5小时更换无血清培养基，继续培养24小时，收集细胞上清液检测不同处理条件下细胞分泌总tgfβ1与活化型tgfβ1含量，结果显示，8gy照射后的细胞分泌的总tgfβ1与活化型tgfβ1增高。而西仑吉肽处理细胞后，细胞分泌的总tgfβ1较单纯8gy单纯照射组细胞的总tgfβ1分泌量并无明显变化，而活化型tgfβ1显著降低(p<0.001)。接受8gy照射的mrc-5细胞，其总smad2/3和磷酸化smad2/3表达水平明显升高。若给予西仑吉肽处理细胞，接受照射的mrc-5细胞的总smad2/3和磷酸化smad2/3表达无升高(图12c)。

如图12d所示，西仑吉肽处理mrc-5细胞后，α-sma表达水平明显下调。给予外源性人重组活化型tgf-β1，可逆转西仑吉肽对α-sma表达的抑制作用，而给予外源性人重组潜在型tgf-β1，无法逆转整合素αv敲除对α-sma表达的抑制作用。

实施例3

防治放射性肺损伤的药品1，它包括有效量的西仑吉肽和药学上可接受的蔗糖；其中，西仑吉肽的含量为15mg/kg。

实施例4

防治放射性肺损伤的药品2，它包括有效量的西仑吉肽和药学上可接受的蔗糖；其中，西仑吉肽的含量为10mg/kg。

实施例5

防治放射性肺损伤的药品2，它包括有效量的西仑吉肽和药学上可接受的蔗糖；其中，西仑吉肽的含量为20mg/kg。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。