本发明属于医药和食品安全技术领域,涉及血根碱在多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜抑制和清除中的应用。
背景技术:
普罗威登斯菌是一种兼性厌氧的革兰氏染色阴性杆菌,可引起食物中毒导致呕吐腹泻,导致泌尿道感染和其它的肠道外感染,可在医院引起暴发流行,其作为一种广泛存在条件致病菌对人类健康的威胁越来越受到重视。近年来,国内由普罗威登斯菌引起的临床散发病例的报道也日益增多。同时,也在食品中检测到了这种菌株。在食品加工环境中,由于受污染的食品,交叉污染风险增加,随后造成经济损失。细菌生物膜由于具有耐受抗生素、宿主防御系统和其他外部压力的能力,成为全球严重的健康问题,因此导致了长期的慢性感染。生物膜是一种不动的微生物群落,在缝合、导管和牙种植体等医用植入物表面,由自行产生的胞外高分子物质定植和生长,造成感染,只能通过清除它们才能治疗。生物膜由细胞外基质填塞的细菌种群组成,它具有胞外多糖、胞外蛋白和edna等。生物膜不仅保护微生物不受ph变化、渗透压、营养缺乏、机械力和剪切力的影响。此外,还阻止细菌生物膜群落从抗生素和宿主免疫细胞进入。因此,生物膜基质赋予细菌附加的耐药能力,使其不仅能耐受恶劣的环境,而且对抗生素也具有耐药性,从而导致多药耐药、广泛耐药和完全耐药等不良细菌感染的出现。
抗菌药物就是一种有选择地消除持久性生物膜,从而促进抗生素向复杂生物膜环境中扩散的生物膜剂。血根碱是一种来源于博落回的提取物,已被证明具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎特性(范慧宁,张靖,朱金水.血根碱抗肿瘤机制的研究进展[j].现代肿瘤医学,2019,27(18):3323-3327.)。据报道,血根碱可以显著抑制卵巢癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,增加活性氧的产生,抑制卵巢癌肿瘤生长(张蓓蕾,李怡,吴涛,等.血根碱通过诱导细胞凋亡抑制卵巢癌肿瘤生长的机制研究[j].实用肿瘤学杂志,2019,33(04):305-309.)。此外,血根碱具有强效的抗真菌作用,并且发现它对生物被膜也有良好的抑制效果,而且抗生物被膜起效浓度低于其最低抑菌浓度(仲华.血根碱的抗真菌作用及机制研究[d].中国人民解放军海军军医大学,2019.)。文献(zhongh,hudd,hugh,etal.activityofsanguinarineagainstcandidaalbicansbiofilms[j].antimicrobialagentsandchemotherapy,2017,61(5).)报道血根碱有很强的对抗白色念珠菌生物被膜能力。更重要的是,它不仅能抑制生物膜的形成,还能破坏成熟生物膜的维持。另外,文献(丁浩,董靖,宋怿,苏志俊,余琳雪,艾晓辉.36种中药对罗非鱼源无乳链球菌体外抑菌及生物被膜消除效果[j].淡水渔业,2019,49(03):71-77.)报道血根碱对无乳链球菌生长和生物被膜生成具有抑制作用但是,未有文献报道血根碱对多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜的抑制和清除作用。
技术实现要素:
本发明解决的技术问题在于提供血根碱在多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜抑制和清除中的应用,从现存的药用植物资源库入手,挖掘潜在的生物被膜清除剂,为缓解或解决多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜引起的感染问题和降低病死率,以及为解决耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜难以清除的难题提供实践基础。
本发明是通过以下技术方案来实现:
血根碱在多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜抑制和清除中的应用。
进一步的,多重耐药雷氏普罗威登斯菌为人源雷氏普罗威登斯菌。
进一步的,多重耐药雷氏普罗威登斯菌耐受的抗生素选自氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、呋喃妥因、氨曲南、庆大霉素中的多种。
进一步的,多重耐药雷氏普罗威登斯菌选自耐氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素的人源雷氏普罗威登斯菌。
进一步的,最低抑制雷氏普罗威登斯菌生物被膜形成的浓度是通过结晶紫染色法确定的;最低清除成熟的雷氏普罗威登斯菌生物被膜的浓度是通过结晶紫染色法确定的。
进一步的,血根碱对雷氏普罗威登斯菌生物被膜的最低抑制浓度为7.81μg/ml,最低清除浓度为125μg/ml。
进一步的,血根碱对多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜具有抑制和清除作用。
血根碱在抗多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜的药物中的应用。
进一步的,多重耐药雷氏普罗威登斯菌为雷氏普罗威登斯菌。
进一步的,多重耐药雷氏普罗威登斯菌选自对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素中多种抗生素耐药的雷氏普罗威登斯菌。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明基于血根碱对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的作用的研究,利用血根碱可以抑制和清除多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜,为多重耐药雷氏普罗威登斯菌清除剂的研究开发和应用提供新的思路,在医药领域具有广泛的应用价值。
本发明进一步明确了血根碱对耐抗生素氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素的雷氏普罗威登斯菌耐药性的抑制作用,有效缓解或解决多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜引起的感染问题,降低病死率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明的内容,并非对本发明的限定。
血根碱的英文名称为sanguinarine,分子式是c20h14clno4,分子量是367.78,熔点为281-285℃,cas号是5578-73-4。分子结构是:
1、雷氏普罗威登斯菌的药敏实验
本发明以5株雷氏普罗威登斯菌为出发菌株,选用氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、呋喃妥因、氨曲南、庆大霉素等18种常用抗生素的进行试验。
挑取培养24h的纯菌落均匀溶解于5mltsb中,调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊。利用二倍稀释法将抗生素、菌液及tsb液体培养基加入96孔培养板中过夜培养,利用酶标仪测定抗生素对雷氏普罗威登斯菌的最小抑菌浓度mic。不同浓度的药液组别均为三个平行,确保实验数据的可信度。抑菌结果根据美国临床试验室国家标准化管理委员会(clsl2017)标准判定,判定标准见表1。实验结果见表2,结果显示,1#雷氏普罗威登斯菌菌株所耐的抗生素最多,其对17种抗生素耐药,1种敏感,因此将其作为下一步实验的研究对象。
表1.美国临床试验室国家标准化管理委员会(clsl2017)标准判定结果
表2.抗生素对雷氏普罗威登斯菌mic结果
由表1和表2可知,血根碱对耐氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素的多重耐药雷氏普罗威登斯菌的抑制作用较好。
2、血根碱对多重耐药菌株生物被膜的抑制作用
本发明以单一活性成分血根碱为研究对象,以雷氏普罗威登斯菌的标准菌株atcc31052作为对照,进行生物被膜的抑制研究。挑取培养24h的纯菌落均匀溶解于5mltsb液体培养基中,用酶标仪测定od600值为0.5。用二甲基亚砜配制浓度为500g/ml的血根碱作为药液,在24孔板中加入无菌玻片,利用二倍稀释法将药液、菌液及tsb液体培养基加入24孔培养板中过夜培养,使药液的终浓度为125g/ml、62.5g/ml、31.25g/ml、15.63g/ml、7.811g/ml、3.90g/ml。之后,用0.1mpbs洗三次,加入200μl结晶紫染料染色20min,洗去多余染料,用显微镜观察结果。不同浓度的药液含有三个平行,确保实验数据的可信度。
3、血根碱对多重耐药菌株成熟生物被膜的清除作用
本发明以单一活性成分血根碱为研究对象,以雷氏普罗威登斯菌的标准菌株atcc31052作为对照,进行成熟生物被膜的清除研究。挑取培养24h的纯菌落均匀溶解于5mltsb液体培养基中,调节其浊度与0.5麦氏比浊,并用酶标仪测定其od600值。用二甲基亚砜配制浓度为1000g/ml的血根碱作为药液,在24孔板中加入无菌玻片和1ml菌液培养24h形成成熟的被膜,然后向每孔加入药液培养4h,使药液的终浓度为62.5g/ml、125g/ml、125g/ml、500g/ml、1000g/ml。之后,用0.1mpbs洗三次,加入200μl结晶紫染料染色20min,洗去多余染料,用显微镜观察结果。不同浓度的药液含有三个平行,确保实验数据的可信度。实验结果见表3。
表3.血根碱对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的抑制结果
由表3可知,血根碱对雷氏普罗威登斯菌生物被膜的最低抑制浓度为7.81μg/ml,最低清除浓度为125μg/ml。
根据以上实验结果,结合中草药解决耐药病原菌生物被膜难以清除的特点,可通过获得活性单品成分血根碱,直接针对临床主要的多重耐药雷氏普罗威登斯菌发挥清除作用,可有效缓解或解决多重耐药雷氏普罗威登斯菌生物被膜引起的感染问题,降低病死率,具有重要的实践意义。