广东紫珠提取物及其应用的制作方法

本发明公开了一种心肌保护的中药提取物，属于中药领域。
背景技术：
：心肌缺血是指心脏的血液灌注减少的一种疾病，它会导致心脏的供氧减少，使心肌能量代谢不正常。严重影响人们的生活和工作，严重者可导致心肌梗塞和猝死。其特征在于缺氧、心肌炎症和心肌细胞凋亡，导致心肌供氧和需求之间严重失衡使得心肌坏死快速发展。心肌缺血主要的症状有心绞痛，心肌梗死，缺血性心肌病，和猝死。心血管疾病(cvds)是一类影响心脏和/或血管的疾病，在心血管患者中大部分都有高血压和动脉粥样硬化。高血压和/或动脉粥样硬化可发展成心律失常，缺血性心脏病，心肌梗塞，最终导致心力衰竭。广东紫珠(callicarpakwangtungensis)为马鞭草科紫珠属多年生落叶小灌木,以地上部位入药，其干燥茎枝、叶均可入药，性苦、涩，味凉，归胃、肝、肺经，具有清热解毒、止血收敛的功效，主治吐血、咽喉肿痛、外伤出血、热毒疮疡等症。临床用于治疗宫颈炎、盆腔炎与阴道炎等妇科疾病。广东紫珠提取物对实验性炎症早期的渗出有明显的抑制炎症反应中药因其副作用小，价格低廉来源广泛，目前没有文献报道广东紫珠提取物具有心肌保护作用，因此开发具有心肌保护活性的中药来预防一些心血管疾病的发生很有必要。本研究意义在于开发具有心肌保护活性的中药广东紫珠并进而阐明其发挥心肌保护作用的机制。技术实现要素：本发明目的提供广东紫珠提取物的新用途，即具有心肌保护作用。技术方案一种广东紫珠提取物，其特征在于所述的提取物按如下步骤获得：取广东紫珠干燥的茎叶,80％的乙醇加热回流提取，滤液浓缩得浸膏即得广东紫珠总提物；将广东紫珠总提物过大孔树脂柱，用30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩后得浸膏，即广东紫珠提取物。具体来说：一种广东紫珠提取物，其特征在于按如下步骤获得：取广东紫珠干燥的茎叶,80％的乙醇加热回流提取3次，每次1h,合并滤液浓缩得浸膏，即广东紫珠总提取物；将广东紫珠总提物干法上样过d101大孔树脂柱，依次用10％，30％，50％，70％，90％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩后得浸膏，即广东紫珠提取物-广东紫珠总苯乙醇苷。所述广东紫珠提取物及广东紫珠总苯乙醇苷在制备作为心肌保护药物中的应用。本发明进一步具体发现广东紫珠提取物及广东紫珠总苯乙醇苷对心肌缺血损伤有保护作用并且发现广东紫珠总苯乙醇苷是通过改变na+/k+-atpase活性发挥心肌保护的作用，具体是通过激活na+/k+-atpasw/src/erk1/2信号通路。进一步说明本发明药物从市场获得，提取方法为将广东紫珠生药材5.4kg，用80％乙醇加热回流提取3次，每次1h，合并后进行减压浓缩得到总浸膏，即得广东紫珠提取物。将总提物通过d101大孔树脂柱，用30％的乙醇洗脱，搜集洗脱液浓缩得浸膏，即广东紫珠总苯乙醇苷。广东紫珠提取物体外活性筛选：将上述得到的广东紫珠总提物即广东紫珠总苯乙醇苷进行抗心肌氧化损伤活性筛选实验，实验发现他们对于h2o2诱导氧化损伤的h9c2细胞有保护作用。广东紫珠总苯乙醇苷体内活性筛选：将广东紫珠总苯乙醇苷配成低中高(100mg/kg,150mg/kg,200mg/kg)三个浓度进行灌胃给药,给药20天后，开始造模，造模方法为：盐酸异丙肾上腺素(iso)诱导sd大鼠产生心肌缺血，给予iso两天后进行心脏彩超检查，发现空白组大鼠心脏功能常数正常，模型组心肌射血分数短轴缩短率降低，肥厚指数较空白组增加，给药后心脏功能有所恢复，具体图表见附图4。广东紫珠提取物提高心肌组织na+/k+-atpase活性：各组大鼠处死后取一定量心肌组织测组织中na+/k+-atpase酶活力，发现广东紫珠总苯乙醇苷能够提高心肌组织中na+/k+-atpase活性。有益效果1.首次发现广东紫珠总提取物及广东紫珠总苯乙醇苷有心肌保护活性。2.首次发现广东紫珠总苯乙醇苷能够增加大鼠心肌表面na+/k+-atpase活性。3.首次发现广东紫珠总苯乙醇苷能够调节心肌组织中na+/k+-atpase表达，能够通过激活na+/k+-atpase/src/erk1/2，及bax/bcl2信号通路发挥心肌保护作用。附图说明图1：广东紫珠及广东紫珠总苯乙醇苷液相图，其中a为广东紫珠总提物，b为广东紫珠总苯乙醇苷，c为连翘酯苷b+金石蚕苷的混合标准品对照图，d,e分别为连翘酯苷b及金石蚕苷的标准曲线。图2：广东紫珠提取物(a)及广东紫珠总苯乙醇苷(b)的tof-ms图图3：广东紫珠提取物及广东紫珠总苯乙醇苷心肌保护活性筛选图。图4：广东紫珠总苯乙醇苷及连翘酯苷b抑制na+/k+-atpase活性筛选结果图；图5：大鼠心脏彩超a及心功能常数图，肥厚指数(b),短轴缩短率(c),收缩期室间隔厚度(d)舒张期室间隔厚度(e)，左心室收缩末期内径(f),舒张末期左室后壁厚度(g)图6：大鼠血清中心肌损伤标记物水平图,血清中乳酸脱氢酶含量(a)，血清中肌酸激酶含量(b)。图7：大鼠血清及心肌组织中氧化应激水平，血清中丙二醛(mda)含量(b)及心肌组织中谷胱甘肽(gsh)含量(a)；图8：大鼠血清及心肌组织中炎症因子水平,心肌组织中caspase3活性水平(a)血清中肿瘤坏死因子(tnf-α)水平(b),血清中白细胞介素水平(c),(d)；图9：大鼠心肌组织病理切片；图10：大鼠心肌组织中na+/k+-atpase活性；图11：免疫组织化学方法测定心肌组织中na+/k+-atpase表达，免疫组化染色(a),定量测定na+/k+-atpase表达(b)；图12：免疫印迹测定心肌组织中src,p-src蛋白表达，并以src总蛋白为内参定量p-src(a)。erk1/2,p-erk1/2蛋白表达，并以erk1/2总蛋白为参照进行定量(b),bcl2,bax蛋白表达，并以β-actin为参照进行定量(c)。具体实施方式：实施例1广东紫珠的提取及粗分离将广东紫珠生药材5.4kg，粉碎成粉末，用80％乙醇加热回流提取3次，每次1h，抽滤取滤液合并后在50℃条件下进行减压浓缩得到总浸膏,即广东紫珠总提物，将总浸膏通过d101大孔树脂柱，具体方法为，取400g大孔树酯与400克总浸膏混合均匀，干法上柱，柱体积为8000ml,用30％的乙醇洗脱，搜集洗脱液浓缩得浸膏，即得广东紫珠总苯乙醇苷。以连翘酯苷b和金石蚕苷的含量来衡量提取物中总苯乙醇苷的量，液相分析得广东紫珠总苯乙醇苷中苯乙醇苷含量为33.7％，见图1。表1以连翘酯苷b和金石蚕苷含量定量广东紫珠及广东紫珠总苯乙醇苷中苯乙醇的含量广东紫珠及广东紫珠总苯乙醇苷的质谱分析条件：流动相a：0.1％的甲酸-水溶液，b：甲醇溶液，洗脱条件：0-5min:5％(b)-15％(b),5-8min:15％(b)-16％(b),8-12min:16％(b)-32％(b),12-42min:32％(b)-37％(b),42-62min:37％(b)-47％(b),62-72min:47％(b)-52％(b),72-82min:52％(b)-95％(b),流速为1ml/min,检测波长：280nm。进样体积：10μl，实验结果见图2。表2广东紫珠提取物可能化合物结构推断表3广东紫珠总苯乙醇苷可能化合物结构推断23.449640.1963campneoside24.607180.0588caffeicacid25.319650.2147刺梨苷26.2786.2570echinacoside27.285786.2567β-oh-poliumoside28.099654.2482isocampneoside28.947786.2566β-och3-forsythoside31.422756.2465fosythosideb33.829624.2027acteoside36.644756.2444samioside47.325797.25612’-forsythoside56.615811.2730brandioside63.193635.1312acacetin-7-o-diglucuroniside67.330417.2561syringaresind68.177462.242decaffeoylacteoside药物na+-k+-atpase活性筛选(亲和力筛选)：为了评价待测药物对na+-k+-atpase的亲和力，通常采取药物抑制na+-k+-atpase水解atp的能力进行表征。将广东紫珠浸膏溶于dmso中配制成100mg/ml的母液，在1.5mlep管中精密加入15μl药物溶液和15μlna+-k+-atpase溶液至70μl反应缓冲液中，混匀。实验分组情况为：空白组，给药组，阳性药组(哇巴因)；每组做两个对照。在37℃水浴锅中孵育15min后，活化na+/k+-atpase，随后将15μlatp溶液加入到ep管中，混匀；在37℃水浴锅中孵育25min，加入18μl蛋白沉淀剂沉淀，10000rpm离心5min，取上清液，按照说明书使用磷测试盒(磷钼酸法)测定磷含量，通过吸光度评价na+-k+-atpase受到抑制的程度。结果见图3和4，发现广东紫珠浸膏与na+/k+-atpase亲和力很好。动物实验：选择250gsd大鼠作为造模动物，将广东紫珠总苯乙醇苷预给药3周，给药方式灌胃，在第20天，21天的时候进行皮下注射异丙肾上腺素(iso)，所用剂量为120mg/kg，连续造模两天后，(距离第一次皮下注射24h后)将大鼠进行超声心动图检查，检查结果见图5，发现大鼠心肌(主要是心室)肥厚严重，心肌损伤严重，表明造模成功，给药组大鼠肥厚现象有所缓解，损伤程度有所降低。ldh，ck，mda试剂盒检测血清中ldh，ck，mda的因子表达ldh,ck,mda为心肌缺血损伤的标记性因子，取大鼠血清，按试剂盒说明书操作，试剂盒结果见图6，图7，表明模型组ldh,ck,mda水平与空白组相比显著增加而给药组的ldh，ck，mda表达与模型组相比显著降低，表明广东紫珠总苯乙醇苷对心肌缺血损伤有保护作用。gsh活性检测：取各组心肌组织适量，按1:9比例加入生理盐水，匀浆后12000r/min,取上清液进行蛋白定量，按照试剂盒说明书进行gsh活性测定。试剂盒结果表明，结果见图7，与空白组相比，模型组大鼠gsh含量降低，给药后，各组大鼠组织中gsh水平有所增加，表明广东总苯乙醇苷可以增加心肌组织的抗氧化能力。炎症凋亡相关因子caspase3活性检测：caspase3是参与dna维护和调控细胞的重要组分，即caspase3激活，细胞凋亡。结果见图8(a)按照试剂盒说明提供方法提取组织中caspase3蛋白，按照说明书方法测定caspase3活性，结果表明模型组中caspase3活性最强，凋亡最严重，给予紫珠提取物后凋亡情况有所减弱，表明广东紫珠提取物能增加心肌抗凋亡水平从而发挥心肌保护作用。tnf-α，il-6，il-1β活性检测：当细胞发生损伤时，机体会产生炎症反应，是一种机体对损伤因子的一种保护性和防御性的反应，tnf-α，il-6,il-1β为一种内源性炎性介质，可以调节自然免疫，按照试剂盒说明书进行tnf-α，il-6,il-1β活性测定，结果见图8(b)，8(c),8(d)，实验结果表明tnf-α,il-6,il-1β含量在造模后显著增加，而给药后其水平又会显著降低，表明广东紫珠能通过抗炎来发挥心肌保护作用的。he染色看病理水平：病理切片检查发现模型组细胞核固缩，心肌纤维肿胀，排列紊乱，局部横纹消失，炎性细胞浸润，部分心肌细胞出现断裂坏死和融合，病理损伤明显。结果见图9，给药后心肌纤维肿胀程度有所降低，炎性细胞浸润减少，病理损伤程度降低，表明广东紫珠提取物对心肌缺血损伤有保护作用。心肌组织na+-k+-atpase活性检测：取各组心肌组织适量，按1:9比例加入生理盐水，匀浆后12000r/min,取上清液进行蛋白定量，结果见图10，活性检测结果表明，模型组na+-k+-atpase活性降低，给药后活性有所增加，na+-k+-atpase活性对心肌细胞有保护作用，表明广东紫珠可能是通过增加na+-k+-atpase活性来发挥心肌保护作用的。免疫组化染色检测大鼠心肌组织中na+-k+-atpase表达：将大鼠心肌组织石蜡切片脱蜡后加热切片进行抗原修复，修复液为柠檬酸-柠檬酸钠，用3％h2o2孵育15-20min消除内源性过氧化氢酶，5％bsa封闭切片1h,滴加一抗孵育过夜，pbst清洗3次后室温条件下孵育二抗1h,然后加sabc试剂孵育30min,根据试剂盒根据说明书操作，用dab染色液对切片染色苏木素复染，最后脱水脱蜡封片，在正置显微镜下进行观察，用imagej软件进行定量。结果见图11(a),11(b)定量结果表明：造模后，心肌组织中na+-k+-atpase表达显著降低，给予广东紫珠提取物后，心肌组织中na+-k+-atpase表达增加，表明广东紫珠提取物可以通过增加na+-k+-atpase的表达来发挥心肌保护作用。westernblot实验检测大鼠心肌组织中src，p-src,erk1/2,p-erk1/2的表达：取100mg大鼠左心室组织，加入ripa裂解液1ml,20μl蛋白酶抑制剂及20μl磷酸酶抑制剂。在冰上用玻璃匀浆器将组织碾碎，冰上裂解15分钟然后在12000rpm下4℃离心5min，收集上清液，蛋白浓度通过bca试剂盒进行定量。蛋白样品经上样缓冲液变性后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后转移到pvdf膜。pvdf膜接着用5％(w/v)脱脂牛奶室温封闭2h，src(1；8000),p-src(1；1000),erk1/2(1；1000),p-erk1/2(1；8000)bcl-2(1:800),bax(1:1000)和β-actin(内参,1:10000)相对应的一抗4℃孵育过夜。在tbst清洗三次后，pvdf膜继续用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:150000)室温孵育2h。目标蛋白条带通过ecl化学发光液显影后在tanon凝胶成像仪上进行观察。计算各蛋白的积分光密度值进行统计分析，每个蛋白进行三次平行实验。结果见图12(a),12(b),12(c)，实验结果表明；造模后，心肌组织中na+-k+-atpase表达降低，src,erk1/2蛋白会激活，凋亡蛋白bax表达增加,抗凋亡蛋白bcl2表达降低，给药后，与模型组相比，na+-k+-atpase表达增加，src,erk1/2蛋白会激活水平降低，凋亡蛋白表达降低。表明广东紫珠总苯乙醇苷可以通过调节na+-k+-atpase/src/erk1/2信号通路及bax/bcl2信号通路发挥心肌保护作用。当前第1页12