一种具有防治脑缺血疾病的组合物及其应用的制作方法

本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种具有防治脑缺血疾病的组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
：调查显示，我国脑血管疾病的死亡率是三大死因之一，仅次于心脏病和癌症，其中缺血性脑血管疾病(ischemiccerebralvessculardisease，icvd)，简称脑缺血，约占发病人数的60％～80％，高发病率、高致死率、高致残率是脑缺血的三大特点，严重威胁着人类的健康。脑缺血疾病其危害甚大，已受到医药研究者的广泛关注，开发治疗脑血管疾病的药物，缓解疾病带来的个人和社会压力，已成为亟待解决的问题。银杏内酯(ginkgolides,gg)为银杏叶提取物中主要药效成分，属于二萜内酯化合物，主要包括银杏内酯a、b、c(简称ga、gb、gc)。现已证明银杏内酯各成分均为强血小板活化因子(plateletactivatingfactor，paf)受体拮抗剂，能高度选择性地拮抗由paf诱导的血小板聚集，有效治疗脑梗塞导致的脑组织缺血、缺氧、坏死，神经功能障碍等，其疗效十分确切。口服银杏内酯制剂首先要保证有足够的血药浓度，但是银杏内酯几乎不溶于水，且易于水解，生物利用度较差，严重影响了其药效的发挥；银杏内酯注射给药虽避免了口服吸收过程中的生物利用度低的问题，但药物的血脑屏障透过率较低，脑内有效药量难以达到预期水平，且脑内各部位分布不均，以海马和嗅球中的含药量稍高，给药30min后脑组织内很多部位己很难检出药物，因其内酯环易水解、开环极性增加，药物迅速分布到胃、十二指肠、肝等部位，进入脑内药物量极低，严重限制其用于脑血管疾病的治疗。冰片是一种小分子脂溶性单萜类物质，主要分为合成冰片和天然冰片，其中天然冰片主成分是龙脑，纯度高达98％；而合成冰片为外消旋体，其中含有大量异龙脑。冰片主要用于开窍醒神的作用。技术实现要素：发明目的：本发明目的是为了克服现有技术银杏内酯溶解度差，难以透过血脑屏障发挥作用的不足，提供一种银杏内酷和冰片相互配合，协同促进，发挥治疗脑部血管疾病作用的组合物。本发明另外一个目的是提供具有防治脑缺血疾病的脂质体注射剂。技术方案：为实现以上目的，本发明采取以下技术方案：一种具有防治脑缺血疾病的组合物，其特征在于，它包括银杏内酷和冰片。作为优选方案，以上所述的具有防治脑缺血疾病的组合物，它由银杏总內酯10～100份，冰片5～50份制成。作为更加优选方案，以上所述的具有防治脑缺血疾病的组合物，它由银杏总內酯20～80份，冰片10～40份制成。作为特别优选方案，以上所述的具有防治脑缺血疾病的组合物，它由银杏总內酯50份，冰片25份制成。作为优选方案，以上所述的具有防治脑缺血疾病的组合物，所述的银杏总內酯为银杏內酯a、银杏內酯b和银杏內酯c组成的。作为更加优选方案，以上所述的具有防治脑缺血疾病的组合物，所述的银杏总內酯包括质量百分比50.69％的银杏內酯a、质量百分比47.56％的银杏內酯b和质量百分比0.92％的银杏內酯c。一种中药制剂，包括银杏内酷和冰片的组合物，所述的药物制剂可以为注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、合剂、丸剂、膏剂或口服液。本发明提供的组合物制成胶囊剂时把各原料的提取物和载体玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。制成口服液时,将各原料的提取物加蒸馏水溶解，过滤，调节ph值,制成口服液。制成片剂时，把各原料和玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，整粒，然后压片制成片剂。制成颗粒剂时，把各原料的提取物和稀释剂玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。一种具有防治脑缺血疾病的脂质体注射剂的制备方法，它包括以下步骤：称取大豆磷脂、胆固醇、银杏内酯、冰片置于250ml的茄形瓶中，加入60ml无水乙醇超声使其完全溶解，将茄形瓶置于旋转蒸发仪于水浴条件下减压旋转蒸发除去溶剂，得到白色均匀的薄膜，真空干燥过夜。加入ph7.4的磷酸盐缓冲液水合(水合温度40℃)，冰浴超声，过微孔滤膜即得冰片-银杏内酯脂质体。作为优选方案，一种具有防治脑缺血疾病的脂质体注射剂的制备方法，它包括以下步骤：称取225mg大豆磷脂、32.1mg胆固醇、25mg银杏内酯、冰片12.5mg置于250ml的茄形瓶中，加入60ml无水乙醇超声使其完全溶解，将茄形瓶置于旋转蒸发仪于40℃水浴条件下减压旋转蒸发除去溶剂，得到白色均匀的薄膜，真空干燥过夜。加入17.5mlph7.4的磷酸盐缓冲液水合(水合温度40℃)，冰浴超声15min，过0.45μm的微孔滤膜即得冰片-银杏内酯脂质体。本发明所述的具有防治脑缺血疾病的组合物在制备防治脑缺血和脑神经功能疾病的药物中的应用。作为优选方案，以上所述的应用，所述的脑缺血疾病包括中风、中风后遗症、血管性痴呆、眩晕、偏头痛疾病。有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：本发明通过大量实验筛选不同重量比的银杏內酯与冰片组合物，发现当银杏內酯与冰片的重量比为2:1时对pc12细胞ogd/r损伤最小，安全性最高。并且通过药理试验发现，银杏內酯与冰片的组合物对脑神经功能具有很好的保护作用，并且可显著降低脑水肿，恢复血清和脑组织的sod活性，显示出很好的防治脑缺血疾病和脑神经功能疾病的作用。且通过对比，本发明重量比为2:1银杏內酯与冰片的组合物比单个的银杏內酯具有更好的疗效，显示出了很好的协同增效作用。附图说明图1为冰片配伍银杏内酯对pc12细胞ogd/r损伤的影响(n＝3)。图2为各组脑含水量对比图。图3给药后各组动物血清中sod值柱状图。图4为给药后各组动物组织中sod值柱状图。图5给药后各组动物血清中mda值柱状图。图6为给药后各组动物组织中mda值柱状图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1银杏内酯及冰片的安全浓度的筛选为研究银杏内酯配伍冰片对离体缺血模型(ogd/r损伤模型)的干预作用，需先确定银杏内酯及冰片对pc12细胞的增殖不存在毒性作用的安全范围，本发明设置银杏内酯、冰片浓度范围分别为8μm～120μm、60μm～200μm，利用均匀优化设计将银杏内酯及冰片设置成8个剂量组，通过mtt法测定的od值，计算细胞的存活率，考察试验药物的最低治疗剂量、引起毒性的最低剂量以及起治疗作用的最佳剂量。剂量设计见表1。表1银杏内酯及冰片的剂量设计1.冰片配伍银杏内酯对pc12细胞ogd/r损伤的最佳比例优选将制成单细胞悬液后的细胞进行细胞计数，调整细胞密度达到6*104/ml，每孔100μl接种于96孔板，置于37℃、5％co2培养箱中培养至细胞贴壁，吸弃上清液，加入不含葡萄糖的ebss，置于37℃，5％co2+1％o2+94％n2的三气培养箱中培养时间分别为4、6、8h，将细胞从三气培养箱中取出，弃去上清液，加入高糖的dmem培养基，并在37℃、5％co2的培养箱中继续培养24h，形成缺氧复氧环境，采用mtt方法通过酶标仪测定光密度值(od值)，考察氧糖剥夺培养4、6、8h后细胞存活率，建立ogd/r损伤细胞模型。采用不同比例冰片配伍银杏内酯，研究其对ogd/r损伤细胞模型的干预作用。取对数生长期状态良好的pc12细胞，制成单细胞悬液后进行细胞计数，调整细胞密度为6*104/ml，每孔100μl接种于96孔板，置于37℃、5％co2培养箱中培养至细胞贴壁，共分7组，包括：正常组、ogd/r模型组、药物组：冰片：银杏内酯，分别为1:1(40μm:40μm)、1:2(20μm:40μm)、1:4(10μm:40μm)、1:8(5μm:40μm)、1:16(2.5μm:40μm)，每组4个复孔。正常组细胞给予5％fbs的高糖dmem培养基并放入37℃、5％co2的培养箱内孵育；模型组给予无糖的ebss在三气培养箱中培养，不加任何药物培养8h；药物组给予5种不同配比药液的ebss溶液培养8h；药物组与模型组均吸弃上清液，再加入5％fbs的高糖dmem培养基复氧24小时后，再加入mtt溶液(5mg.ml-1)20μl，在37℃、5％co2培养箱中避光培养4h，用1ml注射器吸去上清，每孔再加入150μl的dmso，摇床低速震动溶解20-30min后，在酶标仪492nm波长处检测每孔的od值，根据od值，与正常组细胞对比，计算出各组细胞的存活率，优选出冰片配伍银杏内酯对pc12细胞ogd/r损伤的的最佳药物比例。实验数据结果可得，在冰片:银杏内酯比例为1:2(20μm:40μm)时，细胞存活率为98.3％，与模型组及其它给药组相比具有显著性差异，给药组为冰片：银杏内酯重量比为1:1(40μm:40μm)、1:4(10μm:40μm)、1:8(5μm:40μm)、1:16(2.5μm:40μm)时的细胞存活率分别为78.0％、69.5％、76.3％、72.9％，与模型组相比，仍具有显著性差异(p<0.05)，本实验确定最佳配比和剂量为冰片：银杏内酯为1:2(20μm:40μm)，结果见表2、图1。表2冰片配伍银杏内酯对pc12细胞ogd/r损伤的影响(n＝3)分组od(492)成活率(％)对照组0.59±0.05100模型组0.35±0.0259.3#冰片:银杏内酯重量比1:10.46±0.0378.0＊冰片:银杏内酯重量比1:20.58±0.0398.3＊＊冰片:银杏内酯重量比1:40.41±0.0869.5＊冰片:银杏内酯重量比1:80.45±0.0876.3＊冰片:银杏内酯重量比1:160.43±0.172.9＊注：与对照组相比#p<0.01，与ogd/r组相比＊＊p<0.01，＊p<0.05实施例2药效学评价1、实验方法1.1造模方法：采用改良的线栓法制备大鼠急性脑缺血模型：①通过腹腔注射10％水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠；②从颈部正中央切口，切开约2cm后，进行肌肉和结缔组织的分离，并暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉；③结扎并切断颈外动脉后，由颈总动脉插入适宜的栓线至颈内动脉，阻断大脑中动脉初端及其他侧支血管的血流；④将颈内动脉剪口的上方丝线进行结扎，防止其中的栓线滑出和出血，缝合皮肤，外留1cm长的栓线，并将大鼠侧卧放置于单独的笼内；⑤缺血2h后进行再灌注，麻醉动物后，缓慢轻拉栓线，当看到黑色标记后，即可剪掉皮肤外的线栓部分；⑥大鼠清醒后，可自由进食水和食物。1.2实验分组：取sd大鼠60只，随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组(sham组)、模型组(i/r组)、阳性药氯吡格雷组(i/r+clopidogrel组)、银杏内酯组(i/r+gg组)、冰片配伍银杏内酯组(i/r+gg+bo组)。适应性饲养3天后开始每天尾静脉注射给药1次，对照组及模型组给予生理盐水l0ml·kg-1，阳性药组给予氯吡格雷7.5mg·kg-1，银杏内酯组给予银杏内酯20mg·kg-1，冰片配伍银杏内酯组以冰片10mg·kg-1、银杏内酯20mg·kg-1尾静脉注射方式给药，连续给药7天，于第七天给药后1小时开始按上述方法造模(其中模型组：造成脑缺血再灌注模型后，不做进一步治疗；空白对照组：取正常大鼠，不作任何处理)，造模结束后24h以内再按原给药方案尾静脉给药一次。再灌注期间，需使用激光多普勒血流仪(ldf100c,biopac系统)监测脑血流(cbf)，以确保在特定缝合要求下mca的闭合，并且cbf的下降率应大于80％。同时，对照组的动物进行假手术。整个实验过程中，采用恒温控制的红外线灯，使每只大鼠的体温维持在37±0.5℃。2、实验结果2.1.神经功能评分结果对照组治疗前后评分均为0分，其余入组大鼠治疗前评分均为0分，神经行为功能表现正常；造模后，各组大鼠均出现评分升高，表现为不同程度的神经行为功能障碍；给予药物干预后，氯吡格雷组、银杏内酯组及冰片配伍银杏内酯组(重量比1:2)评分较模型组明显下降，并存在显著性差异(p＜0.05)，其中冰片配伍银杏内酯组评分下降最为明显，仅为0.89±0.49，其改善效果超过氯吡格雷组。结果见表3。表3给药治疗后各组神经功能评分(n＝12x±s)注：各组与模型组相比p##<0.052.2、脑含水量的测定结果与对照组相比，模型组脑水肿的比例升高，达到81.12±1.31，存在显著性差异(p＜0.05)。与模型组相比，氯吡格雷组、银杏内酯组和冰片配伍银杏内酯组均能显著降低脑水肿，并存在显著性差异(p＜0.05)，氯吡格雷组经给药治疗后水的含量减少明显，仅为48.67±0.94，银杏内酯及冰片配伍银杏内酯组分别是50.98±1.17和49.25±0.86，无显著性差异，尚未达到或超越阳性药氯吡格雷组所得的实验效果。2.3.过氧化物歧化酶(sod)的测定结果由数据可得，给药后血清中和组织中的sod值与对照组相比，模型组、氯吡格雷组、银杏内酯组和冰片配伍银杏内酯组均存在显著性差异，其中模型组sod活性最低，血清和组织中分别仅为12.540±0.94和12.443±0.83。与模型组相比，氯吡格雷组、银杏内酯组、冰片配伍银杏内酯组的治疗均能明显恢复血清和脑组织的sod活性，存在显著性差异，其中氯吡格雷组血清中的sod值为30.431±1.28、组织中的sod值为30.842±1.25，活性值最高；冰片配伍银杏内酯组血清中的sod值为26.612±1.12、组织中的sod值为26.354±1.10，与银杏内酯组血清中的sod值21.381±1.05和组织中的sod值21.452±1.03相比，冰片配伍银杏内酯组恢复血清和脑组织的sod活性效果更明显，并与阳性药氯吡格雷组的结果更为接近。图3(各组与对照组相比，p**<0.05；各组与模型组相比p##<0.05)及图4(各组与对照组相比，p**<0.05；各组与模型组相比p##<0.05)。表4不同给药组给药后血清中和组织中的sod活力值(n＝12x±s)注：各组与对照组相比，p**<0.05；各组与模型组相比p##<0.052.4.mda的测定结果由表5实验数据结果显示：给药后血清和组织中的mda值与对照组相比，模型组、氯吡格雷组、银杏内酯组和冰片配伍银杏内酯组均有不同程度的升高，并存在显著差异，其中模型组mda含量值最高，血清和组织中分别为36.052±1.54和29.200±1.02。与模型组相比，氯吡格雷组、银杏内酯组、冰片配伍银杏内酯组的治疗均能明显降低血清和脑组织的mda含量，存在显著性差异，其中氯吡格雷组血清中的mda值为15.210±1.12、组织中的mda值为14.673±1.00，mda含量最低；冰片配伍银杏内酯组血清中的mda值为23.632±0.95、组织中的mda值为14.589±0.98，与银杏内酯组血清中的mda值25.548±1.01和组织中的mda值17.114±1.10相比，冰片配伍银杏内酯组降低mda的含量效果更为明显，与氯吡格雷组的mda值更为接近。结果见表5、图5和图6(各组与对照组相比，p**<0.05；各组与模型组相比p##<0.05)。表5不同给药组给药后血清中和组织中的mda含量(n＝12x±s)注：各组与对照组相比，p**<0.05；各组与模型组相比p##<0.05实施例3星点设计-效应面优化冰片-银杏内酯脂质体的制备1、在单因素考察实验的基础之上，选择对脂质体包封率和粒径影响较大的磷脂与药物比(质量比、x1)、磷脂与胆固醇比(质量比、x2)、水合体积(ml、x3)作为考察的因素，确定其用量范围为：x1为6～12；x2为5～9；x3为10～30。并采用design-expert软件中的星点设计对脂质体的制备工艺处方进行三因素五水平的实验安排，同时以包封率(ee，y1)、平均粒径(ms，y2)作为指标进行了实验考察(详见表6)。表6星点设计因素水平2、优化处方验证根据上述实验结果，以评价指标(y1、y2)分别对影响因素进行多元线性和多元非线性回归。采用design-expert8.05统计软件，使用复相关系数(r2)和置信区间(p)校正对该模型进行评估，各指标拟合的多项式方程如下：包封率的模型方程如下：ee(％)＝88.18+1.78x1－0.62x2－0.11x3－3.09x1x2+1.14x1x3+0.36x2x3－4.93x12－5.53x22－5.68x32粒径的模型方程如下：size(nm)＝119.20－1.86x1+24.50x2－5.34x3－11.61x1x2－8.70x2x3+9.57x1x3+67.58x12+49.67x22+32.93x32用f检验和p值检查回归模型的统计数据，方差分析(anova)反映曲面二次式模型。拟合结果表明，各指标对自变量的拟合相关系数均较高，表明拟合模型与实际情况拟合较好。对该模型方程进行方差分析，以方差分析中的p值评价模型的显著性差异，结果显示包封率和粒径拟合模型中p值均小于0.01，表明具有显著性差异。以失拟项评价该模型的可信度，结果显示包封率与粒径模型的失拟项分别为0.58和0.38，均大于0.1，没有显著性差异。结果表明该模型可信度较高，推测该模型可行。从三维效应面得到冰片-银杏内酯脂质体制备条件的优化范围如下：磷脂/药物比率(x1):8.8:1～9.2:1；磷脂与胆固醇比率(x2):6.8:1～7.2:1；水合物体积(x3):16.65～18.35ml。最终确定磷脂/药物比率为9:1，磷脂与胆固醇比为7:1，水合体积为17.5ml为最佳制备工艺，本发明并进行工艺验证(n＝3)。包封率和粒径的预测值和实验值见表7。冰片-银杏内酯脂质体的实际包封率为89.73±3.45％，粒径为128.01±5.91nm，该模型的预测值为87.56％和129.04nm。结果表明，预测值与实验值之间的偏差分别为2.47％和0.79％，理论值与预测值相近。表7理论值与预测值的对比(n＝3)检测项预测值实际值偏差％包封率(％)87.5689.73±3.452.47粒径(nm)129.04128.01±5.910.79。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12