一种五味子叶药茶的制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及一种五味子叶药茶的制备方法。

背景技术：

慢性肝病是指各种致病因子对肝的长期刺激，引起肝的正常结构、生理及生化功能受损，最终出现临床症状的一类疾病总称。慢性肝病通常包括非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、肝硬化乃至肝癌等，对人群健康造成极大的危害。在世界范围内，人均酒精消耗量呈上升趋势，饮酒所导致的各种问题已成为较严重的公共卫生问题之一。据调查，长期酗酒者的死亡率比一般居民高1～3倍。在欧美等国家，酒精性肝病是中青年死亡的主要原因之一。肝脏是人体重要的器官之一，在代谢中有着极其重要的作用。因此如何有效地缓解酒精对肝脏的毒性作用，尤其是预防日渐增多的急性肝损伤疾病，已成为医药工作者研究的热点。目前，临床上尚缺乏理想的肝病预防药物。

目前人体免疫系统容易受到各种因素影响，而不能正常发挥作用，从而极易招致病毒、细菌、真菌等感染，进而加重机体的消耗，造成体质虚弱、营养不良、精神萎靡、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍。且人体恢复能力弱，生病恢复时间长，病情容易反复；长此以往会导致身体和智力发育不良，还易诱发重大疾病。

针对上述问题，现如今有多种药物可以进行治疗，但是大多为化学合成药品，长期服用会产生许多严重的不良反应。因此，提供一种具有保肝护肝、抗氧化、提高免疫力的且有效成分含量高的五味子叶药茶的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种五味子叶药茶的制备方法，制备得到的药茶具有保肝护肝、抗氧化、提高免疫力的效果，特别针对慢性肝病患者、长期饮酒、免疫力低的人群具有明显的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种五味子叶药茶的制备方法，具体步骤如下：

(1)称取干燥的五味子叶，备用；

(2)将步骤(1)称取的五味子叶用四至八倍量水浸润至叶子湿透并无多余水分；

(3)对步骤(2)浸润的五味子叶放入烧杯中，然后进行超声处理，得到五味子叶药茶；所述超声处理条件为：超声时间为5-30min，超声功率为300-600w，超声温度为20-45℃。

采用上述技术方案的有益效果为：本发明采用超声处理，破坏五味子叶中细胞的细胞壁，使细胞中的有效成分容易在水中溶出，提高五味子叶中的有效成分溶出度，进而提高药茶保肝护肝、抗氧化、提高免疫力的作用效果。

进一步，步骤(3)所述超声处理条件为：超声时间为10-20min，超声功率为360-480w，超声温度为20-30℃。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明利用超声破壁技术处理五味子叶，使五味子叶中的细胞破壁，从而加快其中有效物质的溶出，使药茶茶水中的有效成分五味子醇甲含量提高，从而使药茶的效果显著提高。

进一步，一种五味子叶药茶的制备方法，还包括步骤(4)：利用高效液相色谱法检测步骤(3)得到的五味子叶药茶中五味子醇甲的含量。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明利用hplc检测五味子醇甲，能够准确得知药茶水中五味子醇甲及五味子乙素的含量，从而衡量药茶的有益效果。

进一步，步骤(4)所述利用高效液相色谱法(hplc)检测五味子叶药茶中五味子醇甲的含量，具体步骤如下：

a、将步骤(3)得到的五味子叶药茶放入烘箱中，40-50℃条件下烘干；

b、将步骤a得到的干品研磨成粉末并过600-800目筛；

c、取步骤b得到的粉末1.0g，精密称定，置小烧杯中，加10.0ml甲醇，在功率为250w，频率为20khz的条件下超声处理20min，取出，加甲醇定容至10.0ml，摇匀；

d、过滤步骤c超声后的溶液，取滤液，采用高效液相色谱法检测五味子醇甲含量。

进一步，所述的一种五味子叶药茶在制备保肝护肝、抗氧化、提高免疫力的饮品中的应用。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明制备得到的药茶具有保肝护肝、抗氧化、提高免疫力的效果，且其经过浸泡后能够将五味子醇甲等有效成分充分溶解到水中，再通过饮用茶水进入人体，从而可以发挥保肝护肝、抗氧化、提高免疫力的作用。

进一步，所述五味子叶为木兰科五味子属植物五味子的干叶，所述五味子的产地为黑龙江。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：黑龙江省为五味子的道地药材产区，本发明选择由黑龙江产地出产的五味子，使制备得到的药茶功效最佳。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种五味子叶药茶的制备方法，本发明的制备方法简单，能够进行连续、工业化生产，具有很好的发展前景；本发明利用超声破壁技术，能够提高药茶中有效成分的溶出率，从而提高药茶的使用效果；本发明制备得到的药茶使用方便，加水浸泡饮用即可，且具有保肝护肝、抗氧化、提高免疫力的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1的药茶高效液相色谱检测图；

图2附图为本发明实施例2的药茶高效液相色谱检测图；

图3附图为本发明实施例3的药茶高效液相色谱检测图；

图4附图为本发明实施例4的药茶高效液相色谱检测图；

图5附图为本发明实施例5的药茶高效液相色谱检测图；

图6附图为本发明实施例6的药茶高效液相色谱检测图；

图7附图为本发明实施例7的药茶高效液相色谱检测图；

图8附图为本发明实施例8的药茶高效液相色谱检测图；

图9附图为本发明实施例9的药茶高效液相色谱检测图；

图10附图为本发明实施例10的药茶高效液相色谱检测图；

图11附图为本发明实施例11的药茶高效液相色谱检测图；

图12附图为本发明实施例12的药茶高效液相色谱检测图；

图13附图为本发明实施例13的药茶高效液相色谱检测图；

图14附图为本发明实施例14的药茶高效液相色谱检测图；

图15附图为本发明实施例15的药茶高效液相色谱检测图；

图16附图为本发明实施例16的药茶高效液相色谱检测图；

图17附图为本发明实施例17的药茶高效液相色谱检测图；

图18附图为本发明实施例18的药茶高效液相色谱检测图；

图19附图为本发明实施例19的药茶高效液相色谱检测图；

图20附图为本发明实施例20的药茶高效液相色谱检测图；

图21附图为本发明实施例21的药茶高效液相色谱检测图；

图22附图为本发明实施例22的药茶高效液相色谱检测图；

图23附图为本发明实施例23的药茶高效液相色谱检测图；

图24附图为本发明实施例24的药茶高效液相色谱检测图；

图25附图为本发明对比例的药茶高效液相色谱检测图；

图26附图为本发明le和te的总还原力；

图27附图为本发明vc的总还原力；

图28附图为本发明le和te的dpph自由基清除能力；

图29附图为本发明vc的dpph自由基清除能力；

图30附图为本发明le和te的abts自由基清除能力；

图31附图为本发明vc的abts自由基清除能力；

图32附图为本发明le和te的羟基自由基清除能力；

图33附图为本发明vc的羟基自由基清除能力；

图34附图为本发明le和te的超氧负离子清除能力；

图35附图为本发明vc的超氧负离子清除能力。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种五味子叶药茶的制备方法，具体步骤如下：

(1)称取干燥的五味子叶，备用；五味子的产地为黑龙江；

(2)将步骤(1)称取的五味子叶用水浸润至叶子湿透并无多余水分；

(3)对步骤(2)浸润的五味子叶放入烧杯中，进行超声处理，得到五味子叶药茶；超声处理条件为：超声时间为5-30min，超声功率为300-600w，超声温度为20-45℃。

(4)利用hplc检测步骤(3)得到的五味子叶药茶中五味子醇甲的含量，具体步骤如下：

a、将步骤(3)得到的五味子叶药茶放入烘箱中，50℃条件下烘干；

b、将步骤a得到的干品研磨成粉末并过800目筛；

c、取步骤b得到的粉末1.0g，精密称定，置于小烧杯中，加10.0ml甲醇，在功率为250w，频率为20khz的条件下超声处理20min，取出，加甲醇定容至10.0ml，摇匀；

d、过滤步骤c超声后的溶液，取滤液，采用hplc检测五味子醇甲含量：

色谱柱为xdb-c18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相a：甲醇；流动相b：0.5％甲酸水溶液梯度洗脱；检测波长：230nm；体积流量：1.0ml/min；柱温：35℃；灵敏度：0.5aufs；按五味子醇甲峰计算，理论塔板数在3000以上。

表1梯度洗脱表

实施例1-24均采用上述技术方案，区别在于步骤(3)的超声处理条件不同，具体参见表2。

表2超声处理条件

对比例

将只浸润、未进行超声处理的五味子叶粉末作为对照。

在上述色谱条件下，分别对实施例1-24和对比例得到的药茶甲醇溶液中五味子醇甲含量进行检测，进样量10μl，结果如图1-25。

根据实施例1-24和对比例得到的hplc检测结果可以得到五味子茶中五味子醇甲的含量，结果见表3。

表3五味子醇甲含量

表3结果表明，本发明实施例1-24得到的产物中五味子醇甲的含量明显高于对比例，说明本发明采用超声破壁技术能够明显提高药茶中有效成分五味子醇甲的溶出率，证明本发明制备得到的药茶使用效果明显提高。

方法学考察

(一)线性关系考察

取五味子醇甲对照品溶液，浓度分别为0.00289mg/ml、0.00412mg/ml、0.289mg/ml、0.505mg/ml、2.89mg/ml；分别进样10μl。按上述色谱条件测定峰面积。以五味子醇甲进样量y为纵坐标，峰面积x为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为y＝19303x+20229；r²＝0.9990。结果表明五味子醇甲在28.9μg～2890.0μg与峰面积具有良好的线性关系。

(二)精密度试验

精密吸取五味子醇甲对照品溶液(0.05mg/ml)10μl，重复进样5次，测定五味子醇甲峰面积，得其rsd为1.28％。

(三)重复性试验

取同一超声条件(超声时间5min，超声功率为500w，超声温度为30℃)下的五味子样品，平行5次取样，制备供试品溶液，进样测定，结果五味子醇甲峰面积的rsd为1.91％(n＝5)。

(四)回收率试验

采取加样回收法，取已知质量分数(五味子醇甲含量为0.000625mg/g)的五味子样品约1.0g，精密加入五味子醇甲对照品溶液(0.10mg/ml)1.0ml，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为98.62％，rsd为2.16％(n＝5)。

本发明进一步考察超声破壁处理得到的五味子叶药茶的抗氧化活性，具体步骤如下：

a、准确称取五味子叶与实施例21制备的五味子叶药茶各3g(干基计)，加入200ml蒸馏水，沸水浴加热15min，离心取上清液；得五味子叶水提液(le)和五味子叶药茶水提液(te)；

b、分别将le和te两种溶液配成浓度为10、20、40、60和100μl/ml5个浓度的溶液进行总还原力及dpph自由基清除能力的测定；

c、分别配置50、100、200、250和500μl/ml不同浓度的溶液用于abts自由基清除能力的测定；

d、分别配置100、200、400、600和800μl/ml不同浓度的溶液用于羟基自由基及超氧负离子清除能力的测定。

(一)总还原力

a、取两种样品不同浓度的溶液各1ml，加入0.2mol/lph为6.6的磷酸盐缓冲溶液1ml和1％的铁氰化钾溶液1.0ml，将其混匀，50℃保温反应20min；

b、加入10％的tca溶液1.0ml，冷却至室温；

c、再加入1.0ml0.1％fecl3溶液，反应10min后，测定700nm处的吸光度，来表示还原力的大小，吸光度值越大，表明还原力越强；

d、vc作为阳性对照，用等体积的纯水作空白对照；结果见图26、图27。

由图26、图27可以看出，te、le在10μl～100μl/ml范围内，吸光度随溶液浓度增加而增大；vc溶液浓度在1.0mg/ml时的吸光度为0.927。吸光度越大说明还原力越大，因此可以得出te的还原能力整体高于le，te浓度达到100μl/ml时，吸光度值为0.798，说明经超声破壁后的药茶还原能力明显提高。

(二)dpph自由基(dpph·)清除能力测定

a、分别量取2ml不同浓度的le、te于具塞试管中，加入浓度为0.2mmol/ldpph无水乙醇溶液1ml，密封后混匀，于25℃恒温并避光反应1h，测定517nm处的吸光值ai；

b、用等体积的无水乙醇溶液代替dpph溶液为样品对照组aj；

c、消除样品溶液对吸光值的影响，等体积的蒸馏水代替样品溶液作空白对照，测吸光度为a0。

清除率/％＝(1-ai-aj/a0)×100

te、le和vc对dpph自由基的清除能力如图28、图29所示。由图可知，随着浓度的增大，vc和样品溶液对dpph·清除率不断升高。当te和le浓度为100μl/ml时，清除率分别达到78.7％、46.7％。te、le的ic50值分别为37.63μl/ml、99.43μl/ml。说明超声破壁后使有效成分溶出率提高，从而在一定体积范围内清除dpph·的能力明显提高。结果表明，与le相比，te对dpph·具有良好的清除作用，有较好的抗氧化活性。

(三)abts自由基(abts+·)清除能力测定

a、制备abts+·储备液，量取8ml浓度为7mmol/l的abts溶液和141μl浓度为140mmol/l的过硫酸钾溶液，将两者混合后于4℃下避光反应12～16h；

b、用ph为7.4，浓度为10mmol/l的磷酸盐缓冲液稀释储备液至od＝1.00±0.02后，备用；

c、分别量取1ml各浓度的le、te溶液，加入abts+·溶液3ml，混匀后，进行避光反应1h，测定在734nm处的吸光值ai；

d、用1ml纯水作空白对照，同条件下测得吸光值a0；用3ml纯水作为样品对照组，替代abts+·溶液，测得吸光值aj。

清除率/％＝(1-ai-aj/a0)×100

te、le和vc对abts自由基的清除能力如图30、图31所示。由图可知，随着浓度的增大，vc和样品溶液对abts+·清除率不断升高。当te、le浓度为500μl/ml时，清除率达到78.0％、67.0％。te、le的ic50值分别为127.22μl/ml、287.15μl/ml。说明超声破壁后得到的药茶在一定体积范围内清除abts+·的能力明显提高。结果表明，与le相比，te对abts自由基具有良好的清除作用，有较好的抗氧化活性。

(四)羟基自由基(·oh)清除能力测定

a、量取0.8ml各浓度的两种样品溶液，分别加入浓度2mmol/l的feso4溶液2ml、2mmol/l的水杨酸1ml和0.1％的h2o2溶液1ml，在37℃恒温水浴1h，冷却至室温，测定其在510nm波长处的吸光值ai；

b、以去离子水作空白，同等条件下测吸光值a0；

c、样品对照组采用去离子水来代替水杨酸溶液，同等条件下测得吸光值aj。

清除率/％＝(1-ai-aj/a0)×100

oh自由基具有强氧化活性，是生物机体内活性氧代谢的产物，能引发不饱和脂肪酸的过氧化反应，对机体损伤极大。te、le和vc对羟基自由基的清除能力如图32、图33所示。由图可知，te对·oh清除率均大于le，且对·oh清除率随te浓度的增大而增大。当te、le浓度为800μl/ml时，清除率达到86.0％、70.0％。te、le的ic50值分别为281.46μl/ml、457.21μl/ml。说明超声破壁后得到的药茶在一定浓度范围内清除·oh的能力明显提高。结果表明，与le相比，te对·oh具有良好的清除作用，有较好的抗氧化活性。

(五)o^2-·清除能力的测定

a、量取1.0ml各浓度的两种样品溶液，在反应体系中分别加4.5ml浓度为0.05mol/l的tris-hcl(ph8.2)缓冲液，于25℃水浴20min；

b、再加1.0ml不同浓度的受试样液和0.5ml2.5mmol/l在25℃下预热过的邻苯三酚溶液，混匀后在25℃下反应5min后立即用2滴～3滴浓度为8.0mol/l的hcl溶液终止反应，于320nm处测吸光值ai；

c、同条件下测定样品溶液的吸光值aj，未加样品溶液的吸光度a0；

d、同时以vc做为阳性对照，超氧离子自由基清除率计算公式:

清除率/％＝(1-ai-aj/a0)×100

te、le和vc对o^2-·的清除能力如图34、图35所示。由图可知，te对o^2-·清除率均大于le，且对o^2-·清除率随te浓度的增大而增大。当te、le浓度为800μl/ml时，清除率达到80.2％、68.7％。te、le的ic50值分别为111.36μl/ml、247.35μl/ml。说明超声破壁后得到的药茶在一定体积范围内清除o^2-·的能力明显提高。结果表明，与le相比，te对o^2-·具有良好的清除作用，有较好的抗氧化活性。

自由基本质上具有高度活性和潜在的损伤性，广泛存在于机体组织中。一定数量的自由基对人体是有益的，但是当自由基超过一定数量时，就会对人体造成损伤，利用抗氧化剂可以对多余的自由基进行淬灭，维护机体健康。对五味子叶药茶进行抗氧化活性试验，发现超声破壁得到的五味子叶药茶具有较好的抗氧化能力，样品加入量在一定范围内对dpph·、abts+·、·oh和o^2-·的清除率随着浓度的增大而升高，有着明显的量效关系，说明其具有较好的抗氧化活性，在还原力试验中，与vc相比相差不大。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。