用于治疗或预防冠状病毒感染的蛋白酶活性的肽的制作方法
本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽用于治疗和预防受试者的冠状病毒感染的用途。具体来说，本发明涉及使用胰蛋白酶(如海洋来源的胰蛋白酶，例如来自大西洋鳕鱼)治疗或预防哺乳动物的冠状病毒感染。
背景技术：
大西洋鳕鱼(大西洋鳕(gadusmorhua))胰蛋白酶已示出在体外降低如人鼻病毒、呼吸道合胞病毒和流感病毒的病毒感染力(fornbacke和clarsund2013，gudmundsdottir，hilmarsson等人2013)。认为这部分是由于其与类似酶相比具有较高的催化效率(asgeirsson，fox等人1989，asgeirsson和cekan2006，stefansson，helgadottir等人2010)。胰蛋白酶基于推导的氨基酸序列一致性可分为三个大组：i、ii和iii(spilliaert和gudmundsdottir1999)。最近鉴定的鳕鱼胰蛋白酶zt(参见wo2017/017012和提交公开的手稿中未公开的数据：sandholtgb，stefanssonb，gudmundsdottir
冠状病毒属于冠状病毒科(coronaviridae)中的冠状病毒亚科(coronavirinae)，按套病毒的次序。冠状病毒为具有正义单链rna基因组并且具有螺旋对称的核衣壳的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小在大约26到32千个碱基范围内，为rna病毒最大的。“冠状病毒”的名称源自拉丁语冠状，意指冠状或光环状，并且是指在电子显微镜(e.m.)下病毒粒子的特征性外观具有大的球状表面突起的边缘，产生的图像让人联想到皇冠或日冕。这种形态由病毒刺突(s)膜粒产生，所述膜粒为居住于病毒表面并且决定宿主嗜性的蛋白。促成所有冠状病毒整体结构的蛋白为刺突(s)、包膜(e)、膜(m)和核衣壳(n)蛋白。在sars冠状病毒的特殊情况下(见下文)，在s上定义的受体结合结构域介导病毒与其细胞受体血管紧张素转化酶2(ace2)的附着。一些冠状病毒(特别是β冠状病毒亚组a的成员)也具有被称作血凝素酯酶(he)的较短的刺突状蛋白。
冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类的呼吸道和胃肠道。已知它们连同鼻病毒、流感和呼吸道合胞病毒为普通感冒的传染因子中的一个(heikkinen和jarvinen2003，hull，rennie等人2007)。估计大约10％-15％的普通感冒病例由冠状病毒引起(hull，rennie等人2007，jonsdottir和dijkman2016)。六种已知的冠状病毒中有四种依次在健康个体中引起一般的上呼吸道疾病和感冒(即，229e、oc43、nl63和hku1)(bradburne，bynoe等人1967，kraaijeveld，reed等人1980)。其它两种冠状病毒为严重急性呼吸综合症(sars)冠状病毒和中东呼吸综合症(mers)冠状病毒，它们可引起严重的肺炎(park，li等人2016)。冠状病毒感染始于刺突蛋白与其同源细胞受体的附着(jonsdottir和dijkman2016，lim，ng等人2016)。众所周知，sars-cov和mers-cov通过使用其刺突蛋白进入细胞来感染上皮细胞(park，li等人2016)。冠状病毒的细胞嗜性和宿主范围部分取决于冠状病毒刺突(s)蛋白，所述蛋白结合细胞受体并且介导膜融合(graham和baric2010)。
由于极有可能引起重大流行病，因此mers和sars在who需要紧急研究的疾病重点清单中名列前茅(who)。cov家族的流行病潜力突出了对疫苗和抗病毒剂的需求。如今，不存在治疗人类冠状病毒引起的疾病的一般疗法，也没有商业疫苗可用(jonsdottir和dijkman2016)。因此，重要的是找到能够使冠状病毒失活的新疗法。
因此，本发明试图解决对用于治疗和预防冠状病毒感染的新疗法的需求。
技术实现要素：
本发明的第一方面提供具有蛋白酶活性的多肽，其用于治疗或预防如哺乳动物或鸟类的受试者的冠状病毒感染。
通过“具有蛋白酶活性的多肽”，我们包括能够在哺乳动物(例如人)体内催化蛋白水解的任何多肽(天然存在的和非天然存在的)。因此，在本发明中可利用任何类型的蛋白酶，包括但不限于丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶)、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
通过“冠状病毒感染”我们意指是指由冠状病毒科(冠状病毒亚科)的受试者的冠状病毒的生长引起或以其它方式与其相关的感染。
通过“治疗”，我们包括部分或全部缓解冠状病毒感染的症状(例如与普通感冒相关的喉咙痛、鼻塞和/或流鼻涕、咳嗽和/或体温升高)。这类治疗可包括根除与炎症相关的微生物剂或减缓其种群增长。
通过“预防”，我们包括降低患者冠状病毒感染的风险。然而，应了解，这类预防可能不是绝对的，即，它可能不能预防所有这样的患者发展冠状病毒感染，或可能仅部分预防单个个体的感染。如此，术语“预防”和“防治”可互换使用。
在一个实施例中，冠状病毒感染为上呼吸道和/或下呼吸道的感染。替代地或另外，冠状病毒感染可在胃肠道中。某些冠状病毒(如mers)也可感染肾上皮细胞。
通过“上呼吸道”，我们包括口腔、鼻子、鼻窦、中耳、喉咙、喉和气管。
通过“下呼吸道”，我们包括支气管(bronchialtubes/bronchi)和肺(支气管、细支气管和肺泡)，以及肺的间质组织。
“胃肠道”我们意指从口腔到肛门的通道，包括口腔、食道、胃和肠。
在替代的实施例中，冠状病毒感染为肾感染。
在一个实施例中，冠状病毒感染选自由以下组成的组：普通感冒、肺炎、局部肺炎、支气管炎、严重急性呼吸综合症(sars)、中东呼吸综合症(mers)、鼻窦炎、耳炎或咽炎。
与冠状病毒感染相关的其它适应症在gralinski和baric，2015，《病理学杂志(j.pathol.)》235：185-195和cavanagh，2005，“冠状病毒科：冠状病毒和环状病毒的综述(coronaviridae：areviewofcoronavirusesandtoroviruses)”，冠状病毒，特别强调sars-1的初步认识(coronaviruseswithspecialemphasisonfirstinsightsconcerningsarsi)，由a.schmidt，m.h.wolff和o.weber编，瑞士巴塞尔博克豪斯出版社(
因此，在一个优选的实施例中，冠状病毒感染为普通感冒。
冠状病毒可选自以下：
(a)α冠状病毒(如人冠状病毒229e)；
(b)β冠状病毒(如人冠状病毒hku1)；
(c)γ冠状病毒(如禽冠状病毒)；和
(d)δ冠状病毒(如夜莺冠状病毒)。
α冠状病毒的实例包括α冠状病毒1、蝙蝠冠状病毒cdphe15、蝙蝠冠状病毒hku10、人冠状病毒229e、人冠状病毒nl63、长翼蝠属蝙蝠冠状病毒1、长翼蝠属蝙蝠冠状病毒hku8、貂冠状病毒1、猪流行性腹泻病毒、菊头蝠属蝙蝠冠状病毒hku2和高头蝠属蝙蝠冠状病毒512。
β冠状病毒的实例包括鼠冠状病毒、β冠状病毒1、hedgehog冠状病毒1、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合症相关冠状病毒、伏翼属蝙蝠冠状病毒hku5、果蝠属蝙蝠冠状病毒hku9、严重急性呼吸综合症相关冠状病毒和扁颅蝠属蝙蝠冠状病毒hku4。
γ冠状病毒的实例包括禽冠状病毒和白鲸冠状病毒sw1。
δ冠状病毒的实例包括夜莺冠状病毒hku11、黑水鸡冠状病毒hku21、冠状病毒hku15、文鸟冠状病毒hku13、夜鹭冠状病毒hku19、鹅口疮冠状病毒hku12、绣眼鸟冠状病毒hku16和野鸭冠状病毒hku20。
因此，在例示性实施例中，冠状病毒为人冠状病毒。
举例来说，冠状病毒可选自：
(a)人冠状病毒229e；
(b)人冠状病毒oc43；
(c)严重急性呼吸综合症冠状病毒(sars-cov)
(d)人冠状病毒nl63(hcov-nl63，纽黑文冠状病毒)；
(e)人冠状病毒hku1；和
(f)中东呼吸综合症冠状病毒(mers-cov)
因此，在一个实施例中，待治疗的受试者为人。
在一个实施例中，具有蛋白酶活性的多肽选自由以下组成的组：丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
在一个实施例中，具有蛋白酶活性的多肽为丝氨酸蛋白酶。通过“丝氨酸蛋白酶”，我们包括能够切割蛋白中的肽键的天然存在的和非天然存在的催化多肽，其中丝氨酸充当在多肽的活性位点处的亲核氨基酸(如根据ec号3.4.21所定义)。丝氨酸蛋白酶可具有似胰凝乳蛋白酶的蛋白酶活性(即，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶)或似枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶活性。
因此，在一个实施例中，蛋白酶为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，或其混合物的组分。
因此，本发明的多肽可表现出胰蛋白酶活性。所谓“胰蛋白酶活性”，我们意指多肽表现出胰蛋白酶(ec3，4，21，4)或相关肽酶(如胰凝乳蛋白酶，ec3，4，21，1)的肽酶活性。举例来说，蛋白酶可为真核或原核来源的天然存在的胰蛋白酶，或这类胰蛋白酶的突变形式。
本发明的多肽可为天然存在的或非天然存在的。
在一个实施例中，具有蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：天然存在的蛋白酶(如来自海洋(例如鳕鱼)或哺乳动物(例如牛)来源)的氨基酸序列。举例来说，具有蛋白酶活性的多肽可由真核或原核来源的天然存在的胰蛋白酶的氨基酸序列组成。
在一个实施例中，具有蛋白酶活性的多肽为冷适应的，即多肽为嗜冷的。通过“冷适应的”，我们意指多肽源自寒冷环境中的生物，并且因此适于在低温下发挥作用。举例来说，具有蛋白酶活性的多肽在15℃下可比在较高的温度(如25℃或37℃)下表现出更长时间周期的蛋白酶活性(参见stefansson等人，2010，《比较生物化学与生理学：b部分-生物化学与分子生物学(comparativebiochem.physiolpartb-biochem.&mol.biol.)》155(2)：186-194，其公开内容以引用的方式并入)。
在优选的实施例中，多肽为海洋丝氨酸蛋白酶。海洋丝氨酸蛋白酶可获自例如鳕鱼、狭鳕、鲑鱼或磷虾。海洋蛋白酶的其它可能来源包括鲶鱼、黑线鳕、长尾鳕、无须鳕、红鱼、大眼澳鲈、罗非鱼、牙鳕和智利海鲈。特别包括冷适应的胰蛋白酶，如来自大西洋鳕鱼(大西洋鳕)，大西洋和太平洋鲑鱼(例如大西洋鲑(salmosalar)和太平洋鲑属(oncorhynchus)的物种)和阿拉斯加狭鳕(黄线狭鳕(theragrachalcogramma))的胰蛋白酶。举例来说，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可包含以下或由以下组成：seqidno：1到12中的任一个的氨基酸，如下文列出。
因此，在优选实施例中，海洋丝氨酸蛋白酶获自大西洋鳕鱼。
天然存在的丝氨酸蛋白酶可从源生物(例如大西洋鳕鱼)纯化或分离，或可重组表达。
因此，所属领域的技术人员应了解，本发明的这类天然存在的丝氨酸蛋白酶多肽以与在自然界中发现的形式不同的形式提供。举例来说，本发明的多肽可全部或部分地从在自然界中发现的组合物或形式分离。替代地，本发明的多肽可由天然存在的真核胰蛋白酶的氨基酸序列组成，但是通过重组方式表达，使得与在自然界中表达的蛋白相比，其具有改变的翻译后修饰(例如糖基化)。
在优选的实施例中，海洋丝氨酸蛋白酶为胰蛋白酶，例如胰蛋白酶i、胰蛋白酶x、胰蛋白酶y或胰蛋白酶zt(例如参见下文)。
胰蛋白酶的三种主要同工酶最初从大西洋鳕鱼表征，命名为胰蛋白酶i、ii和iii(参见
此外，大西洋鳕鱼表达胰凝乳蛋白酶的两种主要同工酶，分别称为胰凝乳蛋白酶a和b(参见
在一个实施例中，具有蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：来自大西洋鳕鱼(大西洋鳕)的胰蛋白酶i的氨基酸序列，即seqidno：1或seqidno：2
[seqidno：1]
[seqidno：2]
。b998：327-335，其公开内容以引用的方式并入本文中。
或保留所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性的seqidno：1或2的其片段、变体、衍生物或融合物(或所述片段、变体或衍生物的融合物)。
胰蛋白酶i的另外的细节可见于(参见
替代地，具有蛋白酶活性的多肽可包含以下或由以下组成：来自大西洋鳕鱼(大西洋鳕)的胰蛋白酶zt同工型的氨基酸序列，例如seqidno：3到7(参见enzymaticaab的wo2017/017012，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
seqidno：3为zt同种型、zt-1到zt-4的共有序列，如下所示。
[seqidno：3]
其中
x1选自i和v；
x2选自q和h；
x3选自d和e；
x4选自r和n；
x5为l；
x6选自t和p；
x7选自d和a；
x8选自e和q；
x9选自a和s；
x10选自v和m；
x11选自a和v；
x12选自y和f；
x13选自a和v；
x14选自q和r；
x15选自l和e；
x16选自y和s；并且
x17选自y和f。
大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-1同工型：
[seqidno：4]
大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-2同工型：
[seqidno：5]
大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-3同工型：
[seqidno：6]
大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-4同工型：
[seqidno：7]
所属领域的技术人员应了解，多肽可以一种或多种上述胰蛋白酶zt同种型的混合物存在，任选地与胰蛋白酶i、x和/或y组合。
替代地，具有蛋白酶活性的多肽可包含以下或由以下组成：来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶x的氨基酸序列，例如seqidno：8到11(参见stefansson等人，2017，《生物化学与生物物理学报(biochimbiophysacta.)》1865(1)：11-19，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
大西洋鳕鱼胰蛋白酶x：
[seqidno：8]
大西洋鳕鱼胰蛋白酶x-1：
[seqidno：9]
大西洋鳕鱼胰蛋白酶x-2：
[seqidno：10]
大西洋鳕鱼胰蛋白酶x-3：
[seqidno：11]
替代地，具有蛋白酶活性的多肽可包含以下或由以下组成：来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶y的氨基酸序列，例如seqidno：12(参见pálsdóttir和gudmundsdóttir，2008，《食品化学(foodchem.)》111(2)：408-14，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
大西洋鳕鱼胰蛋白酶y：
[seqidno：12]
因此，在示例性实施例中，具有蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：根据seqidno：1到12中的任一个的氨基酸序列。这类多肽可从大西洋鳕鱼纯化，例如如在
本发明的合适的示例性多肽和其生产方法也在欧洲专利第1202743b号中描述(其公开内容以引用的方式并入本文中)。
像许多蛋白酶一样，来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶i作为无活性的前体或酶原产生，其包含被切掉以生成成熟的活性胰蛋白酶的前肽(或“激活”)序列。胰蛋白酶的初始表达产物还包含信号序列，在表达后将其去除。
包括信号序列的对应于seqidno：1的来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶i的变体的酶原序列下文示出为seqidno：13(并且对应于基因库数据库登录号aco903971)：
[seqidno：13]
其中：
信号肽＝氨基酸1到13(带下划线的)
前肽＝氨基酸14到19(粗体斜体)
成熟胰蛋白酶＝氨基酸20到241
包括信号序列的对应于seqidno：2的来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶i的变体的酶原序列下文示出为seqidno：14(并且对应于通用蛋白质资源数据库登录号p16049-1)：
[seqidno：14]
其中：
信号肽＝氨基酸1到13(带下划线的)
前肽＝氨基酸14到19(粗体斜体)
成熟胰蛋白酶＝氨基酸20到241
包括信号序列的对应于seqidno：8的变体胰蛋白酶x的酶原序列下文示出为sedidno：15(并且对应于基因库数据库登录号q91041.2)：
[seqidno：15]
(其中信号序列和前肽分别带下划线和粗体斜体)。
包括信号序列的对应于seqidno：9的变体胰蛋白酶x-1的酶原序列下文示出为sedidno：16(并且对应于基因库数据库登录号aox15769.1)：
[seqidno：16]
(其中信号序列和前肽分别带下划线和粗体斜体)。
包括信号序列的对应于seqidno：10的变体胰蛋白酶x-2的酶原序列下文示出为sedidno：17(并且对应于基因库数据库登录号aox15770.1)：
[seqidno：17]
(其中信号序列和前肽分别带下划线和粗体斜体)。
包括信号序列的对应于seqidno：11的变体胰蛋白酶x-3的酶原序列下文示出为sedidno：18(并且对应于基因库数据库登录号aox15771.1)：
[seqidno：18]
(其中信号序列和前肽分别带下划线和粗体斜体)。
包括信号序列的对应于seqidno：12的变体胰蛋白酶y的酶原序列下文示出为sedidno：19(并且对应于基因库数据库登录号cad30563.1)
[seqidno：19]
(其中信号序列和前肽分别带下划线和粗体斜体)。
由seqidno：3到7表示的胰蛋白酶zt同工型代表这些胰蛋白酶的活性变体，即已经通过切割胰蛋白酶的n端被激活的变体。这些胰蛋白酶为幽门垂/胰腺(鱼中的胰腺组织)中表达的蛋白，其中在n端的许多氨基酸对于细胞分泌和保持酶失活是重要的。
举例来说，全长胰蛋白酶zt同工型在本文中还公开为：
未切割的大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-1同工型：
[seqidno：20]
未切割的大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-2同工型：
[seqidno：21]
未切割的大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-3同工型：
[seqidno：22]
未切割的大西洋鳕鱼胰蛋白酶zt-4同工型：
[seqidno：23]
如本文所用，术语‘氨基酸’包括标准的二十种遗传编码的氨基酸和其以‘d’形式(与天然的‘l’形式相比)的相应立体异构体、ω-氨基酸和其它天然存在的氨基酸、非常规的氨基酸(例如α，α-二取代的氨基酸\n-烷基氨基酸等)和化学上衍生的氨基酸(参见下文)。
当特别列举氨基酸时，如‘丙氨酸’或‘ala’或‘a’，除非另有明确说明，否则所述术语是指l-丙氨酸和d-丙氨酸两者。其它非常规氨基酸也可为本发明多肽的合适的组分，只要多肽保留所需的功能特性即可。对于示出的肽，在适当的情况下，每个编码的氨基酸残基由对应于常规氨基酸俗名的单字母名称表示。
根据惯例，本文公开的氨基酸序列以n端到c端方向提供。
通常，本发明的多肽包含以下或由以下组成：l-氨基酸。
所属领域的技术人员将了解，具有蛋白酶活性的多肽可包含以下或由以下组成：上述氨基酸序列中的一个的其片段、变体、衍生物或融合物(或所述片段、变体或衍生物的融合物)，例如seqidno：1到12，其条件是所述片段、变体、衍生物或融合保留(至少部分)所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性。
胰蛋白酶活性可使用所属领域众所周知的方法来确定。举例来说，胰蛋白酶测定试剂盒可商购自英国剑桥的艾博抗(abcam，cambridge，uk)(参见目录号ab102531)和其它供应商。在一个实施例中，胰蛋白酶活性使用cbz-gly-pro-arg-对硝基苯胺(cbz-gpr-pna)作为底物测量(参见ep1,202,743b和stefansson等人，2010，《比较生物化学与生理学b，生物化学与分子生物学》155(2)：186-94，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
通常，蛋白酶多肽的比活性为至少1u/mg的多肽，例如至少10u/mg、至少50u/mg、至少100u/mg、至少200u/mg或至少500u/mg。如本文所用，‘u’意指酶单位(一u为每分钟催化1微摩尔底物转化的酶的量)。
因此，在多肽包含根据seqidno：1到12中的任一个的氨基酸序列的情况下，其可在其n-和/或c端处包含seqidno：1到12的那些之外的额外氨基酸。同样地，在多肽包含根据seqidno：1到12的氨基酸序列的片段、变体或衍生物的情况下，其可在其n-和/或c端处包含额外的氨基酸。
替代地，具有蛋白酶活性的多肽可对应于这类野生型胰蛋白酶的片段，如seqidno：1到12，其条件是所述片段保留(至少部分)天然存在的胰蛋白酶蛋白的胰蛋白酶活性，所述片段由所述天然存在的胰蛋白酶蛋白衍生。因此，多肽可包含以下或由以下组成：seqidno：1到12的至少10个连续氨基酸，例如seqidno：1到12中的任一个的至少15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230或240个连续氨基酸。
举例来说，片段可包含以下或由以下组成：seqidno：1到12中的任一个的氨基酸残基61到77。替代地或另外，片段可包含以下或由以下组成：seqidno：1到12中的任一个的氨基酸残基225到241。
所属领域技术人员应了解，本发明的多肽可替代地包含以下或由以下组成：根据seqidno：1到12中的任一个的氨基酸序列(或其片段)的变体。这类变体可为非天然存在的变体。
通过多肽的‘变体’，我们包括保守性或非保守性的插入、缺失和取代。具体来说，我们包括多肽的变体，其中这类变化至少部分保持所述多肽的胰蛋白酶活性。
这类变体可使用重组多核苷酸使用在所属领域中众所周知的蛋白工程和定点诱变的方法制备(参见《分子克隆：实验指南(molecularcloning：alaboratorymanual)》，第4版，green和sambrook，2012，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，其以引用的方式并入本文中)。
在一个实施例中，变体具有与根据seqidno：1到12中任一个的氨基酸序列或其片段具有至少50％一致性的氨基酸序列，例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％一致性。
可使用合适的计算机程序确定两个多肽之间的序列同一性百分比，例如威斯康星大学遗传计算组(universityofwisconsingeneticcomputinggroup)的gap程序，并且应了解，相对于序列已最佳比对的多肽计算同一性百分比。
替代地，可以使用clustalw程序进行比对(如thompson等人，1994，《核酸研究(nucl.acidres.)》22：4673-4680中所述，其以引用的方式并入本文中)。
使用的参数可如下：
快速成对比对参数：k-元组(字)大小；1，窗口大小；5，空位罚分(gappenalty)；3，顶部对角线数量；5。评分方法：x百分比。
多重比对参数：空位开放罚分(gapopenpenalty)；10，空位扩展罚分(gapextensionpenalty)；0.05。
评分矩阵：blosum。
替代地，bestfit程序可用于测定局部序列比对。
具有蛋白酶活性的变体多肽的实例在enzymaticaab的wo2015/150799中公开，其公开内容以引用的方式并入。
在本发明的第一方面的另外的实施例中，具有蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下组成：融合蛋白。
通过多肽的‘融合’，我们包括对应于与任何其它多肽融合的具有蛋白酶活性的多肽(如seqidno：1到12或其片段或变体)的氨基酸序列。举例来说，所述多肽可与如谷胱甘肽-s-转移酶(gst)或蛋白a的多肽融合，以便促进所述多肽的纯化。这类融合的实例是所属领域的技术人员所熟知的。类似地，所述多肽可与寡组氨酸标签(如his6)融合，或与抗体识别的表位(如众所周知的myc标签表位)融合。与所述多肽的任何变体或衍生物的融合也包括在本发明的范围内。
融合可包含赋予本发明的所述多肽所需特征的另外的部分；例如所述部分可用于增强或延长治疗效果。举例来说，在一个实施例中，融合包含人血清白蛋白或类似蛋白。
替代地，如所属领域的技术人员所熟知，融合的部分可为例如生物素部分、放射性部分、荧光部分，例如小荧光团或绿色荧光蛋白(gfp)荧光团。如所属领域的技术人员已知，所述部分可为免疫原性标签，例如myc标签，或如所属领域的技术人员已知，可为能够促进多肽细胞摄取的亲脂性分子或多肽结构域。
在本发明的第一方面的另外的实施例中，多肽或其片段、变体、融合或衍生物包含以下或由以下组成：修饰或衍生的一种或多种氨基酸。
一种或多种氨基酸的化学衍生物可通过与官能侧基反应来实现。这类衍生分子包括例如其中游离氨基被衍生以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、羧基苯甲酸基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可被衍生以形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯和酰肼。游离羟基可被衍生以形成o-酰基或o-烷基衍生物。还包括含有二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽作为化学衍生物。举例来说：4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸并且鸟氨酸可取代赖氨酸。衍生物还包括含有一个或多个添加或缺失的肽，只要维持必需的活性即可。其它包括的修饰为酰胺化、氨基端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧酰胺化(例如与氨或甲胺)和类似末端修饰。
所属领域的技术人员应进一步了解，拟肽化合物也可为适用的。因此，通过“多肽”，我们包括拟肽化合物，其具有seqidno：1到12中任一个的多肽的蛋白酶活性。术语‘拟肽’是指模拟特定肽作为治疗剂的构象和所需特征的化合物。
举例来说，本发明的多肽不仅包括其中氨基酸残基通过肽(-co-nh-)键接合的分子，而且还包括其中肽键反向的分子。这类逆反拟肽可使用所属领域中已知的方法，如meziere等人(1997)《免疫学杂志(j.immunol.)》159，3230-3237中所描述的那些方法制备，其以引用的方式并入本文中。此方法涉及制备含有涉及主链而不是侧链取向的变化的伪肽。含有nh-co键而不是co-nh肽键的逆反肽对蛋白水解具有更强的抗性。替代地，本发明的多肽可为拟肽化合物，其中一个或多个氨基酸残基通过-y(ch2nh)-键代替常规酰胺键连接。
在另外的替代方案中，可完全省去肽键，其限制条件是使用保留氨基酸残基的碳原子之间的间隔的适当接头部分；接头部分具有与肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面度可能是有利的。
应了解，多肽可方便地在其n或c端被阻断，以帮助降低对外切蛋白水解消化的敏感性。
各种未编码或修饰的氨基酸，如d-氨基酸和n-甲基氨基酸也用于修饰多肽。另外，假定的生物活性构象可通过共价修饰来稳定，例如环化或通过并入内酰胺或其它类型的桥，例如参见veber等人，1978，《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》75：2636和thursell等人，1983，《生物化学与生物物理研究通讯(biochem.biophys.res.comm.)》111：166，其以引用的方式并入本文中。
然而，在一个优选实施例中，本发明的多肽包含通过peg化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生的一种或多种氨基酸。
所属领域的技术人员应了解，具有蛋白酶活性的多肽可具有任何合适的长度。在一个实施例中，多肽的长度在10和30个氨基酸之间，例如长度在10和20、12和18、12和16或15和20个氨基酸之间。替代地，多肽的长度可在150和250个氨基酸之间，例如长度在200和250、210和240、220和230或220和225个氨基酸之间。
通常，多肽为线性的。
在具有蛋白酶活性的多肽为天然存在的蛋白酶的情况下，可使用所属领域已知的方法从其天然来源中提取和/或纯化(例如分离)所述蛋白。
举例来说，海洋来源的胰蛋白酶，如来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶可使用在jonbragibjarnason的ep1202743b中描述的提取方法生产，其公开内容以引用的方式并入。
在替代实施例中，具有蛋白酶活性的多肽可通过重组方法生产。
因此，用于本发明的多肽以及用于生产所述多肽的核酸分子、载体和宿主细胞可使用在所属领域中众所周知的方法制备(例如参见green和sambrook，2012，《分子克隆实验指南》，第四版，纽约冷泉港，文献的相关公开内容由此以引用的方式并入)。
用于生产具有蛋白酶活性的多肽(如胰蛋白酶)的重组方法在enzymatica的wo2015/150799中公开，其公开内容以引用的方式并入。
在另外的替代实施例中，具有蛋白酶活性的多肽可通过已知的方式合成，如液相和固相合成(例如t-boc固相肽合成和bop-spps)。
所属领域的技术人员应了解，本发明还包括上文所描述的多肽的药学上可接受的酸或碱加成盐的用途。用于制备可用于本发明的前述碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸为形成无毒酸加成盐的酸，即含有药学上可接受的阴离子的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸酯)]盐，等等。
药学上可接受的碱加成盐也可用于生产多肽的药学上可接受的盐形式。可用作制备呈酸性性质的本发明化合物的药学上可接受的碱盐的试剂的化学碱是与这类化合物形成无毒碱盐的化学碱。这类无毒碱盐包括但不限于：衍生自这类药学上可接受的阳离子的碱盐，如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的碱盐；铵或水溶性胺加成盐，如n-甲基葡糖胺-(葡甲胺)和低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其它碱盐，等等。
应进一步了解，可将本发明的多肽冻干用于储存，并在使用前在合适的载体中重构。可采用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥、饼干燥)和/或重构技术。所属领域的技术人员应了解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调节使用水平以进行补偿。优选地，当再水化时，冻干的(冷冻干燥的)多肽损失其活性(在冻干之前)的不超过约20％，或不超过约25％，或不超过约30％，或不超过约35％，或不超过约40％，或不超过约45％，或不超过约50％。
具有蛋白酶活性的多肽通常以治疗组合物的形式提供，其中多肽与药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或赋形剂一起配制。在组合物中可包括额外的化合物，包括螯合剂，如edta、柠檬酸盐、egta或谷胱甘肽。抗微生物/治疗组合物可以所属领域中已知的方式制备，其具有足够的储存稳定性并且适于向人和动物给药。可将治疗组合物冻干，例如通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却，或通过使用由超临界粒子形成的粒子形成。
所属领域的技术人员应了解，本发明的多肽还可添加到用于局部施用的配制物中，例如作为化妆品组合物、药物组合物或医疗装置，以便赋予产品治疗、预防和/或化妆品益处(如滴耳剂、洗涤组合物等)。相应地解释如本文所用的术语‘药物组合物’和‘药剂’。
通过“药学上可接受的”，我们意指无毒材料，其不降低本发明的多肽的胰蛋白酶活性的效力。这类药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂在所属领域中是众所周知的(参见《雷明顿氏药物科学(remington′spharmaceuticalsciences)》，第18版，a.rgennaro编，马克出版公司(mackpublishingcompany)(1990)和《药物赋形剂手册(handbookofpharmaceuticalexcipients)》，第3版，a.kibbe编，医药出版社(pharmaceuticalpress)(2000)，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
术语“缓冲液”旨在表示含有酸碱混合物的水溶液，其目的是稳定ph。缓冲液的实例为氨基丁三醇(trizma)、二甘氨酸(bicine)、麦黄酮(tricine)、mops、mopso、mobs、三羟甲基氨基甲烷(tris)、hepes、hepbs、mes、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、aces、ada、酒石酸盐、amp、ampd、ampso、bes、cabs、二甲胂酸盐、ches、dipso、epps、乙醇胺、甘氨酸、heppso、咪唑、咪唑乳酸、pipes、ssc、sspe、popso、taps、tabs、tapso和tes。
术语“稀释剂”旨在表示水溶液或非水溶液，其目的是在治疗制剂中稀释肽。稀释剂可为盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中的一种或多种。
术语“佐剂”旨在表示添加到配制物中以增加本发明的多肽的生物学效应的任何化合物。佐剂可为具有不同阴离子的锌、铜或银盐中的一种或多种，例如但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和不同酰基组成的乙酸盐。佐剂也可为阳离子聚合物，如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰化透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物(如聚(乙烯基咪唑))和阳离子多肽(如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸)和含有这些氨基酸的肽。
赋形剂可为碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质中的一种或多种。碳水化合物的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇和环糊精，其被添加到组合物中，例如为了便于冻干。聚合物的实例为淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、褐藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮，其分子量都不同，添加到组合物中，例如用于粘度控制、用于实现生物粘附或用于保护脂质免于化学和蛋白水解降解。脂质的实例为脂肪酸、磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂，其酰基链长度和饱和度都不同，蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋卵磷脂和大豆卵磷脂，其出于与聚合物类似的原因被添加到组合物中。矿物质的实例为滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被添加到组合物中以获得益处，如减少液体积聚或有利的颜料特性。
在一个实施例中，多肽可与稳定剂如氯化钙一起提供。
可将本发明的多肽配制成所属领域已知的适合于递送多肽试剂的任何类型的治疗组合物。
在一个实施例中，可将多肽简单地溶解在水、盐水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。
在一个实施例中，本发明提供在渗透活性溶液中的如上所述的蛋白酶多肽。举例来说，多肽可在丙三醇或甘油中配制。
在另外的实施例中，本发明的治疗组合物可呈脂质体的形式，其中除了其它药学上可接受的载体外，多肽与两亲性剂(如脂质)结合，两亲性剂作为胶束、不溶性单层和液晶以聚集形式存在。用于脂质体配制物的合适的脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、髓硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。适合脂质还包括在极性头基中被聚(乙二醇)修饰以便延长血流循环时间的脂质。这类脂质体配制物的制备可在例如us4,235,871中找到，其公开内容以引用的方式并入本文中。
本发明的治疗组合物还可以呈可生物降解微球形式。脂肪族聚酯，如聚(乳酸)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、pla和pga(plga)或聚(己内酯)(pcl)的共聚物和聚酸酐已在微球生产中被广泛用作可生物降解聚合物。这类微球的制备可在us5,851,451和ep0213303中找到，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在另外的实施例中，本发明的治疗组合物以聚合物凝胶的形式提供，其中聚合物用于增稠含有肽的溶液，所述聚合物如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、褐藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯基咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮。聚合物还可包含明胶或胶原。
应了解，本发明的治疗组合物可包括离子和限定的ph，用于增强多肽的作用。另外，组合物可经受常规的治疗操作，如灭菌和/或可含有常规佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液、填充剂等。
在一个优选实施例中，治疗组合物包含在三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲液中的多肽，以及edta、木糖醇、山梨糖醇、丙二醇和丙三醇中的一种或多种。
在一个实施例中，多肽用于与丙三醇和缓冲液组合给药。
根据本发明的治疗组合物可经由所属领域的技术人员已知的任何适合途径给药。因此，可能的给药途径包括口服、口含、肠胃外(静脉内、皮下和肌内)、局部、经眼、经鼻、经肺、肠胃外、经阴道和经直肠。同样，可从植入物给药。多肽可被配制成喷雾、凝胶、乳霜或液体或常规液体用于给药。
在一个优选实施例中，治疗组合物以适合于递送到口咽的形式局部给药。举例来说，多肽可被配制成口腔喷雾、lozenge、锭剂、片剂、糖浆或口嚼锭。
在替代的实施例中，治疗组合物胃肠外给药，例如静脉内、脑室内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下给药，或其可以过输注技术给药。其可方便地以无菌水溶液的形式使用，其可含有其它物质，例如足够的盐或葡萄糖，以使溶液与血液等渗。如果需要，那么水溶液应合适地缓冲(优选地缓冲到ph为3到9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外配制物可通过所属领域的技术人员熟知的标准制药技术容易地实现。
适合于肠胃外给药的配置物包括可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得配置物与既定接受者的血液等渗的溶质的水性和非水性无菌注射溶液；和可包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。可使配制物存于单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用之前即刻添加无菌液体载体(例如水)用于注射。即用型注射溶液和悬浮液可从先前所描述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。
治疗组合物将以药学有效剂量向患者给药。如本文所用，‘治疗有效量’或‘有效量’或‘治疗有效’是指对于给定病况和给药方案提供治疗效果的量。这是与所需的添加剂和稀释剂，即载剂或给药媒剂结合产生所需治疗效果的计算的活性材料的预定量。另外，其旨在意指足以减少并且最优选地预防宿主的活性、功能和反应的临床显著缺陷的量。替代地，治疗有效量足以引起宿主的临床显著病况的改善。如所属领域的技术人员所理解，化合物的量可根据其比活性而变化。合适的剂量可含有与所需的稀释剂结合产生所需治疗效果的计算的活性组合物的预定量。在制造本发明组合物的方法和用途中，提供治疗有效量的活性组分。如所属领域所众所周知，普通技术医务人员或兽医工作者可根据患者特征(如年龄、体重、性别、病况、并发症、其它疾病等)来确定治疗有效量。药学上有效剂量的给药可通过以个别剂量单位，或另外几个较小剂量单位的形式单次给药进行，并且还可通过以特定间隔多次给药细分剂量来进行。替代地，剂量可在长时段内作为连续输注提供。
根据所用多肽的效力/毒性，蛋白酶多肽可以各种浓度配制。
在一个实施例中，配制物包含浓度在0.01和100u/g的配制物之间，例如在1和10u/g的配制物之间的蛋白酶多肽。举例来说，配制物(例如漱口水、凝胶、软膏等)可在配制物中包含至少0.1u/g、至少0.5u/g、至少1u/g、至少5u/g、至少10u/g或至少50u/g的蛋白酶多肽。因此，配制物(例如漱口水、凝胶、软膏等)可在配制物中包含不大于50u/g、不大于20u/g、不大于10u/g、不大于5u/g、不大于1u/g或不大于0.1u/g的蛋白酶多肽。
因此，治疗配制物可包含一定量的多肽或其片段、变体、融合或衍生物，其足以杀死或减慢耳朵内的微生物如病毒、细菌和酵母的生长。
在多肽被配制成用于向口咽给药(例如作为喷雾或凝胶)的情况下，治疗组合物可包含溶解于水和丙三醇中的多肽。示例性口腔喷雾剂和凝胶配制物已经以
在一个实施例中，可在递送装置中，例如在喷雾容器中提供多肽，其可被配置成易于递送到口咽。
在一个实施例中，多肽与一种或多种额外活性剂组合使用。
举例来说，额外活性剂选自由以下组成的组：抗微生物剂(包括抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂)、抗炎剂(包括甾体和非甾体抗炎剂)和防腐剂。
在一个实施例中，活性剂为一种或多种抗微生物剂，例如选自由以下组成的组的抗生素：青霉素、头孢菌素、氟喹诺酮、氨基糖苷、单酰胺菌素、碳青霉烯和大环内酯。
举例来说，抗生素可选自由以下组成的组：阿米卡星、阿莫西林、氨苄西林、阿奇霉素、卡本西林、碳青霉烯、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢呋辛、头孢菌素、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、曲张链菌素、达福普汀、达托霉素、多西环素、恩氟沙星、厄他培南、红霉素、氟喹诺酮、庆大霉素、马波沙星、美罗培南、甲硝哒唑、二甲胺四环素、莫西沙星、萘夫西林、氧氟沙星、苯唑西林、青霉素、奎奴普丁、利福平、磺胺嘧啶银、磺胺甲基异恶唑、替考拉宁、四环素、妥布霉素、甲氧苄氨嘧啶、万古霉素、杆菌肽、多粘菌素b，或其混合物。
在一个优选的实施例中，一种或多种抗生素化合物选自由以下组成的组：四环素、头孢噻肟、万古霉素、红霉素和苯唑西林。
所属领域的技术人员应了解，本发明的组合疗法可包含单一抗生素化合物或多种抗生素化合物。
根据所属领域的公共常识，在本发明的组合疗法中使用的抗生素的浓度将取决于所使用的特定抗生素和所治疗的生物膜的指示和/或位置。通常，抗生素的配制浓度将在0.1％到5％(以重量计)之间，例如在0.1％到1％(以重量计)之间。
在一个实施例中，额外的抗生素可用于局部或口服给药。
在一个实施例中，本发明提供可植入医疗装置，其用如本文所描述的多肽浸渍、涂布或以其它方式处理。
本发明的第二相关方面提供具有蛋白酶活性的多肽，其用于制备用于治疗或预防哺乳动物的冠状病毒感染的药剂。
具有蛋白酶活性的合适的多肽的实例上文关于本发明的第一方面详述。具体来说，多肽可为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，或其混合物的组分。
在本发明的第二方面的一个实施例中，多肽包含以下或由以下组成：seqidno：1到12中任一个的氨基酸序列，或保留所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性的其片段、变体、衍生物或融合物(或所述片段、变体或衍生物的融合物)。
因此，在一个实施例中，多肽由seqidno：1到12中的任一个的氨基酸序列组成。
在一个实施例中，冠状病毒感染选自由以下组成的组：普通感冒、肺炎、支气管炎、严重急性呼吸综合症(sars)、中东呼吸综合症(mers)、鼻窦炎、耳炎或咽炎。
本发明的第三相关方面提供用于治疗或预防哺乳动物的冠状病毒感染的方法，其包含向受试者给药治疗有效量的具有蛋白酶活性的多肽。
具有蛋白酶活性的合适的多肽的实例上文关于本发明的第一方面详述。具体来说，多肽可为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，或其混合物的组分。
在本发明的第三方面的一个实施例中，多肽包含以下或由以下组成：seqidno：1到12中任一个的氨基酸序列，或保留所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性的其片段、变体、衍生物或融合物(或所述片段、变体或衍生物的融合物)。
因此，在一个实施例中，多肽由seqidno：1到12中的任一个的氨基酸序列组成。
在一个实施例中，冠状病毒感染选自由以下组成的组：普通感冒、肺炎、支气管炎、严重急性呼吸综合症(sars)、中东呼吸综合症(mers)、鼻窦炎、耳炎或咽炎。
除非上下文另有说明，否则本发明的给定方面、特征或参数的偏好和选项应被视为已经结合本发明的所有其它方面、特征和参数的任何和所有偏好和选项而公开。举例来说，在一个实施例中，本发明提供了一种由seqidno：1到7中的任一个的氨基酸序列组成的多肽，用于治疗人的冠状病毒感染。
在本说明书中对明显先前已出版文献的列举或论述未必应视为承认所述文献是目前先进技术的一部分或是公共常识。
使用词语“一(a或an)”在结合术语“包含”用在权利要求书和/或说明书中时可指“一个”，而且其还符合“一个或多个”、“至少一个”及“一个或多于一个”的含义。
当结合以上描述考虑时，将更好地了解和理解本发明的这些和其它实施例。然而，应理解，以上描述虽然表明了本发明的各种实施例和其许多特定细节，但是其是以说明而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的精神的情况下，可在本发明的范围内进行许多替换、修改，添加和/或重新布置，并且本发明包括所有此类替换、修改、添加和/或重新布置。
现在将描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实例。
在本说明书中对明显先前已出版文献的列举或论述未必应视为承认所述文献是目前先进技术的一部分或是公共常识。
现在将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选、非限制性实施例：
图1.通过鳕鱼胰蛋白酶使冠状病毒(cov-229e-luc)失活。此图示出鳕鱼胰蛋白酶降低冠状病毒感染人肝细胞(huh7)的能力。y轴根据海肾荧光素酶测定(参见方法)的结果，以对数标度示出冠状病毒的感染水平。x-轴示出以u/ml为单位的鳕鱼胰蛋白酶的量。
图2.通过鳕鱼胰蛋白酶使冠状病毒(cov-229e)失活。此图示出鳕鱼胰蛋白酶降低冠状病毒感染人胎儿肺成纤维细胞样细胞(mrc5)的能力。y轴以对数标度示出冠状病毒感染的减少。使用的鳕鱼胰蛋白酶的浓度为1.22u/ml(图a)和2.44u/ml(图b)。每个浓度和时间点重复两次。
图3.在与不同浓度的鳕鱼胰蛋白酶一起孵育的冠状病毒样品中的冠状病毒蛋白的蛋白质印迹分析。此图示出在含有鳕鱼胰蛋白酶治疗的冠状病毒的样品中冠状病毒蛋白被降解。通过sds-page分离鳕鱼胰蛋白酶处理的冠状病毒样品中的蛋白，并且使用针对冠状病毒蛋白的抗体进行蛋白质印迹分析(请参见方法)。在凝胶中每个泳道上方示出使用的鳕鱼胰蛋白酶的浓度。标记冠状病毒的泳道为不含鳕鱼胰蛋白酶的样品。
图4.与不同浓度的鳕鱼胰蛋白酶一起孵育的重组cov-229e刺突蛋白的蛋白质印迹分析。此图示出鳕鱼胰蛋白酶降解重组冠状病毒刺突蛋白。通过sds-page分离在含有与不同浓度的鳕鱼胰蛋白酶一起孵育的重组冠状病毒刺突蛋白的样品内的蛋白，并且进行蛋白质印迹分析。大小标准的迁移通过右侧的条形和数字(kda)示出。作为对照，将含有鳕鱼胰蛋白酶的样品和含有s1刺突蛋白的样品装载在凝胶上。在凝胶中每个泳道上方示出与重组冠状病毒刺突蛋白一起孵育的鳕鱼胰蛋白酶的量。
图5.sds-page分析的重组sars-cov刺突蛋白与胰蛋白酶zt或胰蛋白酶i在33℃下一起孵育10分钟。此图示出重组sars-cov刺突蛋白被胰蛋白酶zt和胰蛋白酶i降解。通过sds-page分离在含有与不同浓度的鳕鱼胰蛋白酶一起孵育的重组sars-cov刺突蛋白的样品内的蛋白。凝胶用考马斯蓝染色并且在odyssey红外成像系统上成像。大小标准的迁移通过右侧的条形和数字(kda)示出。作为对照，将含有sars-cov刺突蛋白的样品装载在凝胶上。在凝胶中每个泳道上方示出孵育的胰蛋白酶zt和胰蛋白酶i的量。
实例
材料和方法
细胞、病毒和酶
huh7细胞和cov-229e-luc(vandenworm，eriksson等人2012)从瑞士伯尔尼大学病毒学和免疫学研究所(theinstituteofvirologyandimmunology，universityofbern，switzerland)的volkerthiel博士获得。苯甲脒纯化的鳕鱼胰蛋白酶从zymetech(冰岛雷克雅未克)获得。胰蛋白酶zt(在提交出版的手稿中未公开的数据：sandholtgb，stefanssonb，gudmundsdottir
通过鳕鱼胰蛋白酶使cov-229e-luc失活和海肾荧光素酶测定
每ml在没有胎牛血清(fbs)的杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(dmem)中稀释的鳕鱼胰蛋白酶与cov-229e-luc(orf4被海肾荧光素酶代替)在33℃下一起孵育3小时。预先，将每孔约15.000huh7细胞接种到96孔板中，并且在37℃和5％co2下在具有5％fbs的dmem中孵育。二十四小时后，将细胞用pbs洗涤，用0.1用鳕鱼胰蛋白酶处理的cov-229e-luc的感染复数感染。使病毒吸附到细胞2小时，用pbs和细胞培养基洗涤细胞。将细胞在具有5％fbs的dmem中孵育。感染后22小时，通过使用10％(v/v)alamarblue测定(飞世尔科技公司公司(fisherscientific，inc.))评估细胞活力。将alamarblue在33℃和5％co2下再孵育24小时，然后在595nm下的光度计中评估。根据制造商说明书，使用海肾荧光素酶检测定剂盒(美国普洛麦格(promega，usa))，使用推荐的底物浓度的一半和光度计确定病毒复制的水平。通过计算测量的发光的对数来构建对数标度。
通过鳕鱼胰蛋白酶使cov-229e失活
在杀病毒效力悬浮测试中，在两个时间点(10和60分钟)评估鳕鱼胰蛋白酶在悬浮液中对抗攻击病毒(人类冠状病毒，菌株229e，atccvr-740)。测试遵循称为e1052-11的astm国际测试方法“评估在悬浮液中对病毒的杀微生物剂活性的标准测试方法(standardtestmethodtoassesstheactivityofmicrobicidesagainstvirusesinsuspension)”。对于每次运行，分别进行两次稀释。一种稀释液用1份胰蛋白酶和1份稀释剂(1×磷酸盐缓冲盐水(pbs))，并且另一种用1份胰蛋白酶和3份稀释剂。将每种稀释液(2.7ml)与0.3ml的攻击病毒悬浮液(含0％血清)混合，并且涡旋混合。将反应混合物在35℃-37℃下孵育10和60分钟(接触时间)。在孵育之后，立刻将反应混合物的等分试样与等体积的中和剂混合。中和剂为最低基础培养基(mem)+10％fbs+1％聚山梨醇酯80。sephacryl柱用于将病毒与鳕鱼胰蛋白酶分离用于在通过中和剂中和之后测试物质和病毒回收对照(参见下文)。将来自柱的淬灭样品用培养基以十倍的增量连续稀释，并且接种到宿主细胞(mrc-5细胞，atccccl-171)上以测定感染性病毒。将接种的板在33℃±2℃下，在5％±1％co2中孵育5-7天。在孵育之后，通过确定病毒诱导的细胞病变效应(cpe)对培养物进行病毒感染评分。使用spearman-karber公式计算病毒的滴度(log10tcid50/ml)(
对照包括病毒回收对照、中和剂有效性/病毒干扰对照、细胞毒性对照、细胞活力对照、病毒原液滴度对照和参考产物对照。进行中和剂有效性/病毒干扰对照以确定在中和之后是否存在残留的活性成分，以及中和的测试物质是否干扰病毒感染力。将1.35ml的鳕鱼胰蛋白酶和1.35ml的1×pbs的混合物与0.3ml的培养基(代替攻击病毒)充分混合，保持60分钟，中和并通过sephacryl柱。将淬灭的样品分成2部分，一部分用于中和剂效力/病毒干扰对照，另一部分用于细胞毒性对照，并且每个部分连续稀释十倍。对于中和剂有效性/病毒干扰对照，将0.1ml的低滴度的病毒添加到4.5ml的每种稀释液并且保持等于或大于60分钟的时间段。在孵育之后，将病毒掺杂的稀释液接种到宿主细胞上。对于细胞毒性对照，将从中和剂有效性/病毒干扰对照运行中获得的样品进行连续稀释并且接种到宿主细胞上。在孵育期结束时记录宿主细胞的状况。对于回收病毒对照，将2.7ml稀释培养基(mem+5％fbs)与0.3ml攻击病毒悬浮液混合。将混合物保持60分钟，中和，并且通过sephacryl柱进行测试产物运行。用稀释培养基以十倍的增量连续稀释淬灭的样品，并且将选择的稀释液接种到宿主细胞上以测定感染性病毒。对于细胞活力对照，在每次测定中至少用培养基接种4个孔，以证明细胞在整个测定中保持活力并且培养基为无菌的。对于病毒原液滴度对照，将病毒的等分试样连续稀释并且直接接种到宿主细胞上。这证明原液病毒的滴度适合使用，并且适当地进行病毒感染力测定。对于参考产物对照，将约1000ppm含naoc1的漂白溶液的2.7ml等分试样与0.3ml的攻击病毒悬浮液混合。将混合物保持两个接触时间，并且然后中和。用稀释培养基以十倍的增量连续稀释淬灭的样品，并且将选择的稀释液接种到宿主细胞上以测定感染性病毒。用于每次测定的病毒原液滴度对照确认在实验中使用适当的滴度并且回收足够量的病毒用于病毒回收对照。在细胞活力对照孔中未检测到病毒，细胞保持活力，培养基为无菌的。在所有中和剂有效性/病毒干扰对照孔中均检测到病毒。在测试的任何稀释液或细胞系中均未检测到细胞毒性。病毒诱导的cpe与未感染的细胞是可区分的。因此，所有对照均符合有效测试的标准。对于所有测试的病毒，参考测试物质1000ppmnaocl的对数下降值≥4.31。
杀病毒效力的悬浮液测试由独立的测试实验室；美国维吉尼亚州20164的斯特灵的microbaclaboratories公司，105carpenterdrive(microbaclaboratories，inc.，105carpenterdrive，sterling，va20164，usa)进行。
鳕鱼胰蛋白酶处理的cov-229e-luc的病毒蛋白分析
将在dmem(没有fbs)中稀释的鳕鱼胰蛋白酶与cov-229e-luc病毒混合。将混合物在33℃下孵育2小时。在孵育之后，添加laemmli缓冲液(4×)，并且将混合物在95℃下孵育5分钟。将样品装载在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)凝胶上(bachofen，bollinger等人2013)并且进行蛋白质印迹分析，参见下文。
用鳕鱼胰蛋白酶处理重组cov-229es1刺突蛋白
在无dmem的血清中稀释的鳕鱼胰蛋白酶以86μg/ml的最终浓度用于处理重组cov-229es1刺突蛋白。将混合物在33℃下孵育2小时。在孵育之后，添加laemmli缓冲液(4×)，并且在95℃下孵育5分钟以使酶失活。将样品装载在10％sds-page凝胶上(bachofen，bollinger等人2013)并且进行蛋白质印迹分析，参见下文。重组cov-229es1刺突蛋白从瑞士伯尔尼大学病毒学和免疫学研究所的volkerthiel博士获得。
蛋白质印迹分析
对于蛋白质印迹分析，进行sds-page(10％)，并且将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。在转移之后，将膜用含有5％牛奶和0.5％tween-20的pbs在室温(rt)下阻断60分钟。初级抗体(由np-40-分散的cov-229e产生的抗冠状病毒多克隆山羊抗体(wentworth和holmes2001)在具有0.5％牛奶的pbs-tween(pbs-t)中以1∶1000稀释，并且在4℃下在轻轻搅动下孵育过夜。将膜用pbs洗涤，然后在rt下与第二抗体(与辣根过氧化物酶缀合的抗山羊igg，在0.5％牛奶中1∶1000)一起孵育60分钟。使用电荷耦合装置(ccd)相机开发免疫印迹。
用胰蛋白酶zt或胰蛋白酶i处理重组sars-cov刺突蛋白
将重组刺突蛋白(beijing02)(sars-cov)(eenzyme，目录号：ss-001-005p)(0.1mg/ml)与胰蛋白酶zt或胰蛋白酶i在33℃下在ph8.5下的17mm三羟甲基氨基甲烷、12.5mmcacl2、2.5mm乙醇胺中孵育10分钟。将样品在95℃下在4×lds样品缓冲液中孵育10分钟。作为阳性对照，在没有胰蛋白酶同工酶的情况下，将刺突蛋白在33℃下孵育10分钟。使用mops-sds运行缓冲液，将混合物在12％sds-page凝胶(nupagebis-tris，通过生命技术公司的novex)上运行。凝胶用考马斯蓝染色(pageblue蛋白染色溶液，赛默飞世尔科技)并且在odyssey红外成像系统上成像。
结果
通过鳕鱼胰蛋白酶使冠状病毒失活
为了研究鳕鱼胰蛋白酶降低冠状病毒感染力的能力，使用了使用利用海肾荧光素酶的cov-229e-luc的测定(vandenworm，eriksson等人2012)。将冠状病毒在有或没有鳕鱼胰蛋白酶的情况下孵育(180分钟)，并且然后放置在人肝细胞(huh7)上。在病毒吸附期之后，将细胞孵育两天，并且测量冠状病毒感染水平(请参见方法)。使用海肾荧光素酶测定测量感染的水平(图1)。
与对照组(未经处理的冠状病毒)相比，用1.4和2.8u/ml鳕鱼胰蛋白酶处理可将冠状病毒感染水平降低约3个对数单位(图1)。
为了进一步测试鳕鱼胰蛋白酶使冠状病毒失活的能力，使用具有冠状病毒229e的标准化杀病毒效力悬浮液测试进行实验。将冠状病毒与浓度为1.22u/ml或2.44u/ml的鳕鱼胰蛋白酶一起孵育10或60分钟，一式两份。来自每次孵育的样品用50％组织培养物感染感染性剂量剂量(tcid50)终点分析(参见方法)。计算log10降低因子，并且报告平均值(图2)。
在两种浓度下孵育60分钟之后，鳕鱼胰蛋白酶处理的冠状病毒导致病毒感染力的对数下降值大于4。在孵育10分钟的情况下，分别在1.22u/ml和2.44u/ml下观察到对数下降值为2.5和3。
在鳕鱼胰蛋白酶处理的冠状病毒样品中的病毒蛋白的降解
测试鳕鱼胰蛋白酶降解在含有感染性冠状病毒的样品中的冠状病毒蛋白的能力。将冠状病毒的原液溶液在33℃下用浓度为1.4-5.6u/ml的鳕鱼胰蛋白酶处理3小时，并且样品进行蛋白质印迹分析(图3)。如在图3中可看出，鳕鱼胰蛋白酶能够在3小时内以1.4-5.6u/ml的浓度降解冠状病毒蛋白。通过抗体(50kda)识别的蛋白的大小与cov-229e核衣壳蛋白的大小匹配(lo，lin等人2013)。
为了进一步研究鳕鱼胰蛋白酶降来自解冠状病毒的蛋白的能力，将重组cov-229e刺突蛋白与不同浓度的鳕鱼胰蛋白酶在33℃一起孵育2小时，并且然后进行蛋白质印迹分析(图4)。
如在图4中可看出，鳕鱼胰蛋白酶在所有测试浓度下均降解重组冠状病毒刺突蛋白。
测试鳕鱼胰蛋白酶同工酶胰蛋白酶zt和胰蛋白酶i降解重组sars-cov刺突蛋白的能力是令人感兴趣的。在研究中使用的鳕鱼胰蛋白酶分离物中发现了两种同工酶。在图5中，看到约180kda的sars-cov刺突蛋白。在33℃下，在10分钟内胰蛋白酶zt和胰蛋白酶i在测试的浓度(0.35和0.7u/ml)下将刺突蛋白降解。
论述
在本研究中，证明鳕鱼胰蛋白酶在60分钟内将冠状病毒的感染水平降低大于4个对数单位，而仅在10分钟内将其降低至多3个对数单位(图2)。还使用冠状病毒(cov-229e-luc)确定鳕鱼胰蛋白酶使冠状病毒失活的能力，其中用海肾荧光素酶测定监测病毒滴度(图1)。认为鳕鱼胰蛋白酶对冠状病毒的失活效力基于其降解冠状病毒刺突蛋白的能力。这将削弱冠状病毒与对感染重要的人类细胞受体结合的能力(lim，ng等人2016，park，li等人2016)。为了支持这种作用模式，分析通过鳕鱼胰蛋白酶降解冠状病毒蛋白。使用针对cov-229e产生的多克隆抗体，对用鳕鱼胰蛋白酶处理的cov-229e-luc病毒进行蛋白质印迹分析(图3)。结果清楚地表明，大小范围为50kda的蛋白的降解与核衣壳蛋白的降解相关性很好(lo，lin等人2013)。此外，如在图4中所见，以纯化形式的重组cov-229e刺突蛋白通过鳕鱼胰蛋白酶降解。冠状病毒蛋白降解获得的数据基于所述病毒与鳕鱼胰蛋白酶孵育2小时(图3)。据怀疑，由于刺突蛋白位于冠状病毒的表面，因此它们最容易受鳕鱼胰蛋白酶降解的影响。基于我们的发现，冠状病毒与鳕鱼胰蛋白酶一起孵育以刺突蛋白的降解开始(图4和图5)。然而，在长时间的孵育期之后，核衣壳蛋白降解(图3)。
研究中使用的苯甲脒纯化的鳕鱼胰蛋白酶级分含有不同的鳕鱼胰蛋白酶同工酶，如胰蛋白酶i、胰蛋白酶zt和胰蛋白酶x(参见上文)。所有这些胰蛋白酶同工酶均能在精氨酸和赖氨酸上切割，但是胰蛋白酶i和胰蛋白酶zt已经示出具有不同的亚位点特异性(未公开的数据；sandholtgb，stefanssonb，gudmundsdottir
基于sds-page分析，鳕鱼胰蛋白酶i和胰蛋白酶zt两者在低浓度下仅在10分钟内有效地降解重组sars-cov刺突蛋白(图5)。发现指示，sars冠状病毒很可能容易在通过低浓度下的鳕鱼胰蛋白酶失活。这表明引起人感染的不同冠状病毒可通过鳕鱼胰蛋白酶失活。胰蛋白酶同工酶在10分钟内有效切割sars-cov刺突蛋白的事实(图5)与其中鳕鱼胰蛋白酶在10分钟内降低冠状病毒的感染水平的图2的结果非常吻合。
在本研究中关于鳕鱼胰蛋白酶使冠状病毒失活的能力的提出的结果扩展了示出鳕鱼胰蛋白酶抵抗不同呼吸病毒的效力的其它研究的发现(gudmundsdottir，hilmarsson等人2013)。有趣的是，在病毒蛋白中经常发现富含赖氨酸和精氨酸的氨基酸序列(suzuki，orba等人2010，jiang，cun等人2012，gallaher和garry2015)。这些带正电荷的碱性氨基酸残基主要暴露于蛋白表面，并且通过形成静电相互作用而对蛋白稳定重要(sokalingam，raghunathan等人2012)。精氨酸和赖氨酸残基在病毒蛋白中常见的事实可解释鳕鱼胰蛋白酶有效地切割在本研究中的冠状病毒刺突蛋白的能力(图4和图5)。
总之，这些结果表明，鳕鱼胰蛋白酶具有经由降解表面刺突蛋白而使冠状病毒失活的能力，从而阻止冠状病毒与细胞的粘附。
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