胆固醇晶体形成的治疗的制作方法

引言

胆固醇是脊椎动物的一种必需脂质，胆固醇源自营养和内源性生物合成。作为所有细胞膜中的泛在性成分，胆固醇在膜结构和功能中起着至关重要的作用，并且胆固醇对于维持膜渗透性和细胞信号传导很重要。游离胆固醇在水性环境中具有非常低的溶解度，并且脂蛋白充当血流中胆固醇运输的胆固醇载体。

但是，胆固醇也以其晶体形式发现于体内。例如，在动脉粥样硬化斑块中可以发现固体胆固醇一水合物晶体。处于结晶状态的斑块胆固醇是相对惰性的，并且在体内情况下可能极难或甚至不可能移动、分解和/或溶解。

存在其中胆固醇的聚集或结晶、其代谢物和衍生物具有重大意义的许多医学领域，其中有两个主要领域。

第一个领域涵盖了这样的重要应用，从靶向富含胆固醇的脂筏(如质膜中的动态微结构域)到胆囊中形成的胆结石和动脉粥样硬化斑块中生长的胆固醇晶体。胆固醇聚集的控制将影响脂筏的动力学，这在从受体表达和信号传导到离子、营养物、调节分子和病原体的转运的许多膜功能的调节中将是重要的[1，2]

另一个医学领域(其中控制胆固醇晶体或聚集物的形成是重要的)是胆结石病理学[3，4]。胆结石疾病是一种常见且费用昂贵的严重医学状况，其在发达国家中影响10％至15％的成年人群。例如，多于2000-2500万美国人患有这种疾病，并且在美国每年花费62亿美元，构成了主要的健康负担之一。

但是，主要的健康问题是动脉粥样硬化斑块中胆固醇晶体的形成。它们的生长和最终突出到血管腔中被认为是脆弱斑块破裂和血液凝块(clotting)的主要原因之一，血液凝块可以导致心脏病发作或心肌梗死、中风和急性血栓形成的其他并发症[6-10]。

因此，胆固醇晶体在动脉粥样硬化斑块中早已被鉴定出，并且其在动脉粥样硬化中发挥致病作用的潜力在50多年前首次被认识到，当时在动物中的实验证明，当将胆固醇晶体注射到动脉壁中时，它们导致了典型的动脉粥样硬化病变的发展。动脉粥样硬化斑块内的胆固醇大部分是酯化的；但是，随着斑块的发展，斑块内游离胆固醇的量增加，并倾向于在新生斑块中(技术已经证明存在胆固醇晶体)形成胆固醇晶体。成像和染色的最新进展以及脆弱和不稳定的动脉粥样硬化斑块中浓度高得多的胆固醇晶体[27]。胆固醇结晶和相关的带有尖锐尖端的晶体的体积扩大会破坏纤维帽并导致斑块破裂[25]。

心血管疾病仍然是发达国家中死亡率的主要原因，并且在2014年有1900万人死于心血管疾病，全球损失多于9000亿美元。仅在美国，多于600万年龄20岁以上的人患过中风。每年约有100万人经历新的或复发的中风。动脉粥样硬化是绝大多数心血管疾病的原因。尽管数十年的努力，他汀类和pcsk9抑制剂(降低血液胆固醇水平的药物)仍然是仅有的有效疗法，但它们只能减缓、不能阻止或逆转疾病进展。目前没有阻止动脉粥样硬化发展并诱导其消退的可用疗法。

已知血液总胆固醇与动脉粥样硬化斑块的发展相关性较差[29]。还已知血清总胆固醇与动脉粥样硬化斑块负荷不相关[28]。此外，50％患有心脏病发作的患者没有血液胆固醇升高[26]。因此需要用于治疗不存在高脂血症的心血管疾病的新策略。胆固醇晶体是心血管疾病的发展的独立风险因素，与高血清(循环)胆固醇水平无关。此外，斑块破裂和胆固醇以其晶体形式释放可以引发急性临床事件心肌梗死和中风。

其中胆固醇晶体生长和动脉粥样硬化形成引起严重并发症的另一个医学问题是用支架和其他血管内装置进行重建性血管内治疗。这些非外科手术过程快速，患者经历的创伤最小，不太复杂，并且成本相对较低，已经成为替代心内心血管外科手术和其他旁路外科手术的常规实践。

但是，使用支架和其他类似治疗的主要并发症是非常高的再狭窄率。这是由所谓的“新生动脉粥样硬化”引起的，其中动脉粥样化物质开始生长并且发生胆固醇晶体的堆积[11-13]。

存在其他与胆固醇或其衍生物或代谢物的结晶或聚集相关或由胆固醇或其衍生物或代谢物的结晶或聚集引起的医学状况。它们是：在红斑狼疮的滑液[14]、过熟性白内障患者的眼前段[15]、牙源性囊肿[16]中的胆固醇晶体堆积，在中耳和鼻旁窦[17]、肾[18]、垂体[19]和甲状腺[20]的慢性疾病中观察到的胆固醇肉芽肿生长。

因此存在治疗和预防胆固醇晶体的形成和生长的需求，特别是因为本领域需要用于治疗、预防或改善动脉粥样硬化的新方法。

概述

本发明人发现类胡萝卜素化合物对胆固醇晶体的形成、生长和稳定性以及它们的结构和/或尺寸有作用。这一发现可以应用于治疗受试者中与胆固醇晶体的存在相关的许多疾病。

在一方面中，提供了用于在治疗受试者中与胆固醇晶体的存在相关的疾病中使用的类胡萝卜素化合物，其中类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成、尺寸或生长中的一种或更多种和/或改变胆固醇晶体结构。例如，类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成速率和/或生长速率。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物使结晶速率降低。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物改变胆固醇结构。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物破坏胆固醇晶体。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物延迟胆固醇晶体的形成。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物促进胆固醇晶体的分解和/或溶解。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物选自番茄红素、叶黄素、玉米黄质、内消旋玉米黄质、虾青素、胡萝卜素、隐黄质、黄黄质、新黄质或另一种四萜类。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物是番茄红素。

在一种实施方案中，疾病选自心血管疾病、脑血管疾病、外周动脉疾病、主动脉瘤或动脉瘤、胆石症和胆结石疾病、肾动脉狭窄、眼中风(eyestroke)、勃起功能障碍、肠系膜或肠缺血、红斑狼疮、过熟性白内障、牙源性囊肿、中耳和鼻旁窦慢性疾病、肾病或甲状腺疾病。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物作为食品的一部分施用。

在一种实施方案中，食品是膳食补充物、营养化妆品(nutracosmetic)或营养保健品。

在一方面中，我们提供了用于预防或治疗受试者中与胆固醇晶体的存在相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用类胡萝卜素化合物，其中所述类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的生长、尺寸和/或形成和/或破坏胆固醇晶体、促进胆固醇晶体的分解或溶解。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的生长和/或形成。例如，类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成速率和/或生长速率。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物破坏胆固醇晶体或促进胆固醇晶体的分解或溶解。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物选自番茄红素、叶黄素、玉米黄质、内消旋玉米黄质、虾青素、胡萝卜素、隐黄质、黄黄质、新黄质或另一种四萜类。在一种实施方案中，化合物是番茄红素。

在一种实施方案中，疾病选自心血管疾病、红斑狼疮、过熟性白内障、牙源性囊肿、中耳和鼻旁窦的慢性疾病、肾病或甲状腺疾病。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物作为食品的一部分施用。

在一种实施方案中，食品是膳食补充物、营养化妆品或营养保健品。

在另一方面中，本发明提供了类胡萝卜素化合物在制备用于预防或治疗与胆固醇晶体相关的疾病的支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它生物相容性材料中的用途，其中所述类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成或破坏胆固醇晶体。

在又另一方面中，本发明提供了涂覆有类胡萝卜素化合物的支架或其他移植物、医疗装置、假体或其他生物相容性材料。

本发明还提供了用于制备支架或其他移植物、医疗装置、假体或其他生物相容性材料的方法，所述方法包括用类胡萝卜素化合物涂覆支架或其他移植物、医疗装置、假体或其他生物相容性材料的步骤。

我们还提供了用于改变胆固醇晶体结构、降低胆固醇晶体的形成、生长或尺寸的体外或体内方法，所述方法包括使胆固醇晶体暴露于类胡萝卜素化合物。

我们还提供了通过上述方法获得或可获得的胆固醇晶体。

附图

本发明通过以下非限制性附图来进一步说明。

图1.番茄红素防止或减缓胆固醇结晶的形成。a)18小时；b)56小时；c)67小时；d)80小时；e)和f)91小时；g)和h)138小时；i)和j)204小时；k)和l)278小时；m)和n)332小时。

图2.在对照溶液中形成板状胆固醇晶体(在左侧)，而在番茄红素的影响下形成针状晶体(在右侧)。a)和b)实验1，番茄红素与胆固醇的比为1:100,000；c)和d)实验2，番茄红素与胆固醇的比为1:1,000,000；e)和f)实验3(e-胆固醇，f-番茄红素-胆固醇，g-番茄红素-油树脂)。

图3.a-d)在含有番茄红素(右侧)和不含番茄红素(左侧)的情况下形成的不同类型的胆固醇晶体。干燥晶体，实验b。

图4.在番茄红素的影响下形成针类型的胆固醇晶体(lc)，番茄红素与胆固醇的比为1:1,000,000。a)正在生长的lc；b)针/管lc。

图5.对照胆固醇晶体cc和在番茄红素的存在下形成的胆固醇晶体lc的光学显微术检查。a)cc1；b)cc2；c)lc1；d)lc2；e)cc；f)lc。

图6.a)对照胆固醇晶体cc和b)在番茄红素的存在下形成的胆固醇晶体lc的共聚焦显微术检查。

图7.a)通过不同浓度的番茄红素溶解胆固醇晶体，实验1。k1和k2-对照样品，l0-0.01μg/ml，l1-0.05μg/ml，l2-0.1μg/ml。b-f)通过不同浓度的番茄红素溶解胆固醇晶体，实验2。b)对照；c)番茄红素-胆固醇的比为1:1,000,000；d)番茄红素-胆固醇的比为1:100,000；e)番茄红素-胆固醇的比为1:10,000；f)番茄红素-胆固醇的比为1:1,000。

图8.a)通过叶黄素溶解胆固醇晶体，实验1。左侧-对照胆固醇晶体，右侧-叶黄素比胆固醇为1:100,000。b-c)通过叶黄素溶解胆固醇晶体，实验2，b)胆固醇对照晶体；c)叶黄素:胆固醇的比为1:50,000。

图9.a-i)磷脂酰胆碱、不同的油和生育酚对胆固醇晶体溶解的作用，实验1。a)对照；b)磷脂酰胆碱；c)橄榄油；d)花生(groundnut)油；e)葡萄籽油；f)菜籽油；g)椰子油；h)鳄梨油；i)榛子油。j-m)磷脂酰胆碱、不同的油和生育酚对胆固醇晶体溶解的作用，实验2。j)对照；k)杏仁油；l)向日葵油；m)生育酚。

图10.腹主动脉胆固醇和钙(磷酸盐)晶体。对胆固醇晶体的作用。a-b)pbs-乙醇，a)0天和b)13天；c-f)pbs乙醇中的番茄红素，c)0天，d)13天，e)0天，f)13天。

详细描述

现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每一方面可以与任何其他一方面或多于一方面组合，除非清楚指示相反的情况。具体地，被指示为优选的或有利的任何特征可以与被指示为优选的或有利的任何其他一个特征或多于一个特征组合。

本发明涉及治疗受试者中与胆固醇晶体的存在相关的疾病，特别是与胆固醇晶体的形成和/或存在及其分解或溶解的过程相关的疾病。特别地，本发明提供了用于治疗、预防或减轻受试者中与胆固醇晶体相关的疾病的方法和用途。本发明的方法包括向受试者施用类胡萝卜素化合物。

在wo2013/088156中已经描述了类胡萝卜素化合物对血清中的胆固醇(即非结晶形式的循环胆固醇)的水平的作用。但是，该公开内容涉及血液中的循环胆固醇，而未教导类胡萝卜素对胆固醇晶体特别是在受试者中已经形成的胆固醇晶体的作用。

本发明人惊奇地发现，类胡萝卜素化合物影响胆固醇晶体的形成、生长，胆固醇结晶速率，改变胆固醇晶体的物理特性和结构并破坏/分解胆固醇晶体。特别地，当胆固醇晶体暴露于类胡萝卜素化合物时，胆固醇晶体的形成和/或生长降低。在实施方案中，当胆固醇晶体暴露于类胡萝卜素化合物时，胆固醇晶体的形成速率和/或生长速率降低。术语“降低(reduced)”或“降低(reduction)”是指与未处理的样品或晶体相比的降低。降低可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。

因此，类胡萝卜素化合物可以用于治疗特征为胆固醇晶体的存在的疾病。

因此，在一方面中，本发明涉及用于在治疗与胆固醇晶体的存在相关的疾病中使用的类胡萝卜素化合物，其中类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成(诸如降低胆固醇晶体的形成速率)、降低胆固醇晶体的生长(诸如降低胆固醇晶体的生长速率)、改变胆固醇晶体结构(例如破坏胆固醇晶体)和/或改变胆固醇晶体的尺寸。

在另一方面中，本发明提供了用于预防和/或治疗受试者中与胆固醇晶体相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用类胡萝卜素化合物，其中所述类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成(诸如降低胆固醇晶体的形成速率)、降低胆固醇晶体的生长(诸如降低胆固醇晶体的生长速率)、改变胆固醇晶体结构(例如破坏胆固醇晶体)和/或改变胆固醇晶体的尺寸。

在另一方面中，本发明提供了类胡萝卜素化合物在制备用于预防或治疗与胆固醇晶体相关的疾病的药物中的用途，其中所述类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成(诸如胆固醇晶体的形成速率)、降低胆固醇晶体的生长(诸如胆固醇晶体的生长速率)、改变胆固醇晶体结构(例如破坏胆固醇晶体)和/或改变胆固醇晶体的尺寸。

在另一方面中，本发明提供了类胡萝卜素化合物在制备用于预防或治疗与胆固醇晶体相关的疾病的支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它生物相容性材料中的用途，其中所述类胡萝卜素化合物降低胆固醇晶体的形成(诸如降低胆固醇晶体的形成速率)、降低胆固醇晶体的生长(诸如降低胆固醇晶体的生长速率)、改变胆固醇晶体结构(例如破坏胆固醇晶体)和/或改变胆固醇晶体的尺寸。因此，在这些材料中类胡萝卜素的存在阻止了胆固醇晶体在材料面向循环血液、血浆和/或组织流体的表面上形成。

在又另一方面中，本发明提供了涂覆有类胡萝卜素化合物的支架或其他移植物、医疗装置、假体或其他生物相容性材料。

本发明还提供了用于制备支架或其他移植物、医疗装置、假体或其他生物相容性材料的方法，所述方法包括用类胡萝卜素化合物涂覆支架或其他移植物、医疗装置、假体或其他生物相容性材料的步骤。

本发明还提供了用于以下的方法：降低胆固醇晶体的形成(诸如降低胆固醇晶体的形成速率)、降低胆固醇晶体的生长(诸如降低胆固醇晶体的生长速率)、改变胆固醇晶体结构(例如破坏胆固醇晶体)和/或改变胆固醇晶体的尺寸。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物抑制或降低胆固醇晶体的形成(例如通过影响胆固醇结晶的速率)。特别地，类胡萝卜素化合物抑制已经形成的胆固醇晶体的进一步生长。在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物改变胆固醇晶体结构。在以上阐述的多种方面和实施方案的一种实施方案中，类胡萝卜素化合物破坏或分解现有的胆固醇晶体，即已经在受试者中形成的胆固醇晶体。因此，胆固醇晶体被破碎、分解或溶解，并且例如在样品或受试者中存在的胆固醇晶体的量降低。特别地，在一种实施方案中，本发明旨在治疗、降低、分解受试者中存在的胆固醇晶体。因此，施用类胡萝卜素化合物以便特异性地靶向现有的胆固醇晶体，即呈晶体形式的胆固醇，并降低进一步的结晶，改变晶体结构和/或分解现有的胆固醇晶体。在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物不是用于降低呈非结晶形式的循环胆固醇。

多种用途和方法可以任选地另外包括以下步骤中的一个或更多个：鉴定具有胆固醇晶体的受试者，在治疗前评估受试者中是否存在胆固醇晶体，以及在治疗后评估受试者中是否存在胆固醇晶体的步骤。

类胡萝卜素化合物是包含长多烯链的四萜类。类胡萝卜素化合物包括叶黄素类(xanthophylls)诸如叶黄素(lutein)和玉米黄质，以及胡萝卜素诸如β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素和番茄红素化合物。

在特定实施方案中，类胡萝卜素是叶黄素。在一种实施方案中，叶黄素(xanthophyll)选自由以下组成的组：α-隐黄质(α-cryptoxantin)、β-隐黄质(β-cryptoxantin)、金盏花红素(adonirubin)、金盏花黄素(adonixanthin)、别黄素(alloxanthin)、amarouciaxanthina、环氧玉米黄质(antheraxanthin)、虾青素(astaxanthin)、金黄质(auroxanthin,)、眉藻黄素(caloxanthin)、鸡油菌素(cantaxanthin)、辣椒红素(capsanthin)、辣椒红素-5-6-环氧化物(capsanthin-5-6-epoxide)、辣椒玉红素(capsorubin)、隐藻黄素(crocoxanthin)、硅甲藻黄素(diadinoxanthin)、硅藻黄素(diatoxanthin)、海胆烯酮(echinenone)、岩藻黄素(fucoxanthin)、岩藻黄醇(fucoxanthinol)、异岩藻黄素(iso-fucoxanthin)、异岩藻黄醇(iso-fucoxanthinol)、叶黄素(lutein)、黄体黄质(luteoxanthin,)、橘黄质(mutatoxanthin)、新黄质(neoxanthin)、nostoxanthin、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)及其组合。

在一种实施方案中，类胡萝卜素是胡萝卜素。在另一种实施方案中，胡萝卜素选自由以下组成的组：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、番茄红素、链孢红素(neurosporene)、八氢番茄红素(phytoene)、六氢番茄红素(phytofluene)及其组合。

在一种实施方案中，以上描述的胡萝卜素和叶黄素是指其全反式形式。在其他种实施方案中，用于本发明的叶黄素和胡萝卜素包括含有一个或更多个顺式双键的衍生物。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物是番茄红素化合物。番茄红素化合物可以包括番茄红素、1-ho-3',4'-二脱氢番茄红素、3,1'-(ho)2-γ-胡萝卜素、1,1'-(ho)2-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素、1,1'-(ho)2-3,4-二脱氢番茄红素。

在一些实施方案中，类胡萝卜素化合物是番茄红素化合物，诸如番茄红素。番茄红素是结构i的开链不饱和c40类胡萝卜素(化学文摘社(chemicalabstractsservice)登记号502-65-8，c40h56)。

结构i

番茄红素天然存在于植物诸如番茄、番石榴、玫瑰果、西瓜和粉红葡萄柚中，并且任何这样的来源的番茄红素可以例如被采用。

用于如本文描述的使用的番茄红素可以包含一种或更多种不同的异构体。例如，番茄红素可以包含顺式番茄红素异构体、反式番茄红素异构体以及顺式异构体和反式异构体的混合物。番茄红素可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％(z)-异构体、(全-e)-异构体或顺式异构体，诸如5-顺式异构体或9-顺式异构体或13-顺式异构体，它们相对于反式异构体具有改善的生物可利用度。反式异构体可以在体内或在储存和加工期间异构化为顺式形式。

用于如本文描述的使用的类胡萝卜素化合物，诸如番茄红素，可以是天然的，即从天然来源获得，例如从富含类胡萝卜素的水果、蔬菜或其它植物，诸如番茄或甜瓜，或从真菌、藻类或细菌提取。在一种情况下，类胡萝卜素化合物可以是或包含油树脂，特别是番茄油树脂。

从植物提取、浓缩和/或纯化类胡萝卜素的一系列方法是本领域已知的。例如，可以采用使用乙醇、dmso、乙酸乙酯、己烷、丙酮、大豆油或其他植物油或非植物油的溶剂提取。

用于如本文描述的使用的类胡萝卜素化合物，诸如番茄红素，可以是合成的，即通过人工手段例如通过化学合成产生。用于化学合成番茄红素和其他类胡萝卜素的一系列方法是本领域已知的。例如，可以采用基于用于类胡萝卜素合成的标准维蒂希烯化反应(wittigolefinationreaction)方案的三阶段化学合成，其中产生在二氯甲烷(dcm)中的ci5甲磺酸鏻有机溶液和在甲苯中的ci0二醛有机溶液，并且将两种有机溶液与甲醇钠溶液逐渐混合并经历缩合反应以形成粗制番茄红素。然后可以使用常规技术纯化粗制番茄红素，例如通过将冰乙酸和去离子水添加到混合物中，剧烈搅拌，允许水相和有机相分离，并且萃取含有dcm和粗制番茄红素以及水的有机相。将甲醇添加到有机相中，并且经由减压蒸馏去除dcm。然后将粗制甲醇番茄红素溶液加热并冷却为结晶浆液，过滤并用甲醇洗涤。然后可以将番茄红素晶体重结晶并在加热的氮气下干燥。合成的类胡萝卜素，诸如番茄红素，也可以从商业供应商获得(例如basfcorp,njusa)。

相对于天然类胡萝卜素化合物，合成的类胡萝卜素化合物，诸如番茄红素，可以包含比例增加的顺式异构体。例如，合成的番茄红素可以是最多25％的5-顺式异构体、1％的9-顺式异构体、1％的13-顺式异构体和3％的其他顺式异构体，而由番茄产生的番茄红素可以是3％-5％的5-顺式异构体、0％-1％的9-顺式异构体、1％的13-顺式异构体和<1％的其他顺式异构体。因为顺式番茄红素相对于反式番茄红素具有增加的生物可利用度，所以在一些实施方案中合成的番茄红素是优选的。

如以上描述的类胡萝卜素衍生物可以通过类似于以上描述的合成的化学合成或通过从植物材料提取的天然类胡萝卜素的化学修饰来产生。

在一种实施方案中，胆固醇晶体位于动脉壁中、或胆囊中、或滑液腔中、或导管中。在一种实施方案中，胆固醇晶体位于富含动脉粥样化的组织中。

在一种实施方案中，胆固醇晶体位于聚集物或晶体或动脉粥样化组织中，位于动脉支架或其他血管内或血管装置或血管移植物中。因此，本发明还旨在当将医疗装置植入受试者中时，降低医疗装置上胆固醇晶体的形成，包括降低现有的胆固醇晶体。

在一种实施方案中，疾病是动脉粥样硬化和/或其临床并发症。在一种实施方案中，疾病是心血管疾病。在另一种实施方案中，病理是脑血管疾病。在另一种实施方案中，动脉粥样硬化并发症是外周动脉疾病。

在一种实施方案中，疾病是胆囊疾病、与胆固醇晶体沉积相关的关节炎、或由胆固醇结晶引起的导管狭窄或阻塞。

动脉粥样硬化是一种影响动脉血管的综合征。动脉粥样硬化由动脉壁的慢性炎性应答引起，并且是死亡和心血管发病率的主要原因。动脉粥样硬化涉及动脉壁的增厚，并且特征为动脉斑块的发展以及血流的最终受限或阻塞。目前的动脉粥样硬化治疗包括膳食和生活方式的改变(例如戒烟)、药物干预(例如，他汀类、抗凝血剂等)以及外科手术(例如，血管成形术、支架、旁路外科手术等)。

根据本发明的某些实施方案，可以通过本发明的方法治疗的受试者包括但不限于患有或被诊断患有动脉粥样硬化或处于发展成动脉粥样硬化风险的受试者。相应地，在某些实施方案中，本发明的方法包括选择患有动脉粥样硬化或处于发展成动脉粥样硬化风险的受试者，并向该受试者施用一种或更多种剂量的类胡萝卜素化合物。如本文使用的，“处于发展成动脉粥样硬化风险”的受试者可以包括具有或表现出一种或更多种动脉粥样硬化风险因素的受试者。动脉粥样硬化的风险因素是本领域熟知的，并且包括但不限于血清低密度脂蛋白(ldl)胆固醇水平升高、血清甘油三酯(tg)水平升高、血清高密度脂蛋白(hdl)胆固醇水平降低、高血压、糖尿病、家族史和吸烟。评估特定受试者的动脉粥样硬化风险因素的方法也是本领域熟知的。在一种实施方案中，受试者已经被诊断为具有胆固醇晶体。

在另一种实施方案中，疾病是胆固醇栓塞。

在另一种实施方案中，疾病是炎性疾病。这样的疾病的实例是慢性根尖周炎，因为胆固醇晶体与介导慢性炎症相关。

在另一种实施方案中，疾病是胆囊结石，其中胆固醇的沉淀可以导致胆结石和胆囊炎症。在另一种实施方案中，疾病选自但不限于红斑狼疮，白内障，牙源性囊肿，中耳和鼻旁窦、肾、垂体和甲状腺的慢性疾病。

如本文使用的，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指抑制或缓解疾病或紊乱。例如，治疗可以包括延缓与疾病或紊乱相关的症状的发展，和/或降低将会或预期会伴随所述疾病发展的这些症状的严重性。这些术语包括改善现有症状、预防另外的症状以及改善或预防这些症状的潜在原因。因此，这些术语表示有益结果正在被赋予给被治疗的哺乳动物中的至少一些，例如人类患者。许多医学治疗对经受治疗的一些但不是全部患者有效。

术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物。仅通过实例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，诸如非人类灵长类、鼠、牛、马、犬、羊或猫。

类胡萝卜素化合物的施用途径包括，例如，口服施用和/或皮下、静脉内、腹膜内、肌内、或滑膜内、或硬膜外、或皮内注射，从而在患者中提供类胡萝卜素化合物的连续、持续的水平。

在一种实施方案中，递送可以是局部的。施用类胡萝卜素化合物以便特异性地靶向现有的胆固醇晶体，并降低进一步的结晶，改变晶体结构或分解胆固醇晶体。因此，局部递送至可能已经形成胆固醇晶体处是一种递送模式。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物作为支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它生物相容性材料的一部分施用，所述支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它生物相容性材料具有暴露于血液或组织流体的表面或部分。因此，类胡萝卜素化合物可以形成支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它生物相容性材料的涂层的一部分。所得支架或其他移植物、医疗装置、假体或其他生物相容性材料具有降低的或零水平的胆固醇晶体堆积。

在特定紊乱或状况的治疗中有效/有活性的类胡萝卜素化合物的量将取决于紊乱或状况的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，体外或体内测定可以任选地用于辅助鉴定最佳剂量范围。待在组合物中使用的精确剂量还将取决于施用的途径和疾病或紊乱的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。应考虑因素如年龄、体重、性别、膳食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病的严重性。如本文使用的，术语“有效量”意指当施用至受试者时，在施用条件下有效实现期望的治疗或预防效果的类胡萝卜素化合物的量。例如，待施用的类胡萝卜素化合物的量随动脉粥样硬化的严重性而变化。以降低动脉粥样硬化的影响或症状的剂量施用组合物，所述剂量通过本领域技术人员已知的方法确定。

通常，该量为按组合物的重量计至少约0.01％的类胡萝卜素化合物。当意图用于口服施用时，该量可以在按组合物的重量计从约0.1％至约80％的范围内变化。优选的口服组合物可以包含按组合物的重量计从约4％至约50％的本发明活性物。

本发明的一些组合物被制备，使得肠胃外剂量单位包含按重量计从约0.01％至约2％的类胡萝卜素化合物。

对于通过注射施用，组合物通常可以包含从约0.1mg/kg动物体重至约250mg/kg动物体重，优选地，在约0.1mg/kg动物体重和约20mg/kg动物体重之间，并且更优选地在约1mg/kg动物体重至约10mg/kg动物体重之间。在一种实施方案中，组合物以约1至30mg/kg，例如，约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药时间表可以从例如每周一次变化到每2周、3周或4周一次。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物作为食品的一部分提供。食品可以是功能性或医疗食品或饮料、膳食补充物或营养保健品。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物作为包含药学上可接受的载体的药物组合物的一部分提供。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物作为支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它用于植入物的生物相容性材料的一部分提供，并且所述支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它用于植入物的生物相容性材料与循环血液接触。因此，本发明还涉及涂覆有类胡萝卜素化合物的支架或其它移植物、医疗装置、假体或其它生物相容性材料。涂层防止了胆固醇晶体在植入物上堆积，从而降低心血管疾病的风险。在一种实施方案中，涂层可以包含其他生物活性化合物。支架可以是冠状动脉支架。在一种实施方案中，支架还洗脱类胡萝卜素。在另一种实施方案中，支架不洗脱类胡萝卜素。

药物组合物可以通过任何方便的途径施用，包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻内、肺、皮内、滑膜内、硬膜外、玻璃体内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、透皮、经粘膜、通过吸入或局部施用，特别是向耳、鼻、眼或皮肤施用或通过吸入施用。

肠胃外施用包括，例如，静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、滑膜内、硬膜外、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。优选地，组合物被肠胃外施用。

药学上可接受的载体或媒介物可以是颗粒，因此组合物呈例如片剂或粉末的形式。术语“载体”是指类胡萝卜素与其一起施用的稀释剂、辅助剂或赋形剂。这样的药物载体可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。水是一种载体。盐溶液和水性左旋糖和甘油溶液也可以被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，诸如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果期望，组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。

药物组合物可以呈液体例如溶液、乳液或悬浮液的形式。液体可以用于通过注射、输注(例如，iv输注)或皮下递送。

当意图用于口服施用时，组合物可以呈固体或液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文所视为固体或液体的形式内。液体可以用于口服施用或通过注射递送。当意图用于口服施用时，组合物可以包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或更多种。在用于通过注射施用的组合物中，还可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或更多种。

作为用于口服施用的固体组合物，组合物可以配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄片等形式。这样的固体组合物通常包含一种或更多种惰性稀释剂。另外，可以存在以下中的一种或更多种：粘合剂诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂诸如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂诸如藻酸、藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂诸如硬脂酸镁；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；调味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂；以及着色剂。当组合物呈胶囊形式(例如明胶胶囊)时，除了以上类型的材料之外，组合物可以含有液体载体，诸如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。

药物组合物可以配制成基本上在施用时立即释放或在施用后的任何预定时间或时间段释放类胡萝卜素化合物。后一类型的组合物通常被称为受控释放制剂，其包括(i)在延长的时间段内在体内产生基本恒定的药物浓度的制剂；(ii)在预定的滞后时间后，在延长的时间段内在体内产生基本恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定的有效水平而在预定时间段期间维持作用的制剂，同时伴随着与活性物质血浆水平波动(锯齿动力学模式)相关的不期望的副作用的最小化；(iv)通过例如将受控释放组合物在邻近或接触器官诸如心脏的空间放置来定位作用的制剂；(v)允许方便给药的制剂，诸如，例如每一周或两周施用一次的剂量；以及(vi)使用载体或化学衍生物以便将治疗剂递送至特定细胞类型(例如，内皮细胞或平滑肌细胞)的靶向动脉粥样硬化的制剂。对于一些应用，受控释放制剂消除了为使血浆水平维持在治疗水平而在白天期间频繁给药的需要。可以采用许多策略中的任一种，以便获得受控释放，其中释放速率超过所述药物的代谢速率。在一种实例中，通过适当选择多种制剂参数和成分，包括例如多种类型的受控释放组合物和包衣，来获得受控释放。因此，将类胡萝卜素化合物与适当的赋形剂一起配制成药物组合物，该药物组合物在施用后以受控的方式释放治疗剂。实例包括单个或多个单位的片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。

组合物可以采取一种或更多种剂量单位的形式。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物的施用是组合疗法的一部分。类胡萝卜素化合物可以与其他疗法共施用或在其他时间给予。在另一种实施方案中，受试者可能先前已经接受了另一种疗法，诸如基于他汀类的疗法。

本文还提供了用于改变或破坏胆固醇晶体结构的方法，所述方法包括使胆固醇晶体暴露于类胡萝卜素化合物。在一种实施方案中，胆固醇晶体的光学特性和/或电子转移特性被改变。本文还提供了用于降低胆固醇晶体的形成、形成速率、生长或生长速率的体外或体内方法，所述方法包括使胆固醇晶体暴露于类胡萝卜素化合物。在这些方法中，类胡萝卜素化合物与胆固醇的浓度比可以是例如1:10至1:10⁶。

另一方面涉及通过以上描述的方法获得或可获得的胆固醇晶体。如从实例中可见的，暴露于胆固醇产生针状晶体。

除非本文另外定义，否则关于本公开内容使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然前述公开内容提供了包含在本发明的范围内的主题，包括进行和使用本发明的方法以及其最佳模式的一般描述，但是提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实践本发明并提供其完整的书面描述。但是，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，本发明的范围应从本公开内容所附的权利要求及其等同物来理解。鉴于本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。

本说明书中提及的所有文件通过引用以其整体并入本文。

在本文中使用的“和/或”应被认为是两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。例如“a和/或b”应被认为是(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，如同每一个在本文中单独列出一样。除非上下文另有指示，否则上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

在以下非限制性实施例中进一步描述了本发明。

实施例

实施例1.

防止或干扰胆固醇晶体的形成。

将1g胆固醇(sigma)在99％乙醇中的198ml溶液分成相等的两部分。在一部分中添加1ml含有100μg溶解的番茄红素的乙醇。这提供了番茄红素与胆固醇的1:10⁶的比。在另一部分即对照中，添加1ml的乙醇本身。然后将两个样品在20-22℃条件下留置在暗室中蒸发。至少以每天或甚至更短的间隔对两个样品的状态进行记录。在图1a-n中呈现了本实验的一些结果。

观察到浓度低于每百万分子胆固醇一分子番茄红素的番茄红素的存在可以显著影响胆固醇结晶速率。首先，在蒸发两天后，在对照样品中已经观察到漂浮的胆固醇晶体。在番茄红素存在的情况下，即使在第4天，也未观察到这些晶体的迹象，并且它们在实验的第6天才开始出现在那。同时，结晶胆固醇的固体壳已经覆盖了对照溶液的所有表面。在第12天，对照中没有溶剂剩余，胆固醇变成固体结晶物质，而在番茄红素存在的样品中，结晶过程仍在进行。到第14天，结晶过程完成。

实施例2.

胆固醇晶体物理特性的变化。

在一系列实验中，其中胆固醇与番茄红素的比从1,000个胆固醇分子比1个番茄红素分子到至少10,000,000个胆固醇分子比1个番茄红素分子不同，观察到晶体物理特性的显著变化。

在所有对照实验中，胆固醇结晶成板状晶体，参见图2b和图2d。有时，他们可以形成若干厘米宽的厚平板，如实验2中的玻璃杯底部上的厚平板，图2c。但是，当介质中存在番茄红素时，观察到新型晶体的形成。有显著更小且呈针状或窄管状的形状的晶体:

-图2b、图2c，以及

-图3b、图3d和图4b。

在光学显微术和共聚焦显微术下，两种类型的胆固醇晶体在尺寸和形状上的这些差异更明显(图5a-f和图6a-b)。

感兴趣的是，观察到由番茄红素引起的结晶过程的减缓是由乙醇蒸发速率减慢引起的。这可以解释为该类胡萝卜素通过破坏胆固醇折叠成晶体结构，降低了在该过程期间释放的熵，并基本上冷却了溶剂及其蒸发。因此，在含有番茄红素的样品中乙醇的量几乎是对照样品中的两倍—图2中的实验1。

此外，番茄红素不仅改变了胆固醇晶体本身的物理特性，而且番茄红素还能够掺入到新形成的晶体结构中。这形成了新类型的发色团晶体，预期其将具有不同的光学特性和电子转移特性。

总之，这些观察表明番茄红素可以显著影响胆固醇晶体折叠，改变胆固醇晶体的现有物理特性，并形成胆固醇晶体的新特性。

实施例3.

使用类胡萝卜素分解胆固醇晶体—番茄红素。

向100mg结晶胆固醇(sigma)中添加含有不同浓度的番茄红素的20ml乙醇溶液。作为对照，使用20ml相同但不含任何番茄红素的乙醇。在约20-22℃的室温条件下，温和搅拌若干分钟后，进行结果记录。

本实验在不同番茄红素浓度范围重复多次。在这些条件下，番茄红素能够以约1分子番茄红素/1,000,000分子胆固醇或更高的比降低胆固醇晶体的数目和尺寸。当比达到1比100,000时，观察到这些晶体完全分解(图7a-f)。

实施例4.

使用类胡萝卜素分解胆固醇晶体—叶黄素。

向100mg结晶胆固醇(sigma)中添加含有不同浓度的叶黄素的20ml乙醇溶液。作为对照，使用20ml相同但不含任何叶黄素的乙醇。在约20-22℃的室温，温和搅拌若干分钟后，进行结果记录。

本实验在不同叶黄素浓度范围重复多次。在这些条件下，叶黄素能够以约1分子叶黄素/100,000分子胆固醇或更高的比降低胆固醇晶体的数目和尺寸。当比达到1:20,000时，这些晶体发生完全分解(图7a-f)。

实施例5.

一些油、磷脂、疏水性维生素不促进胆固醇晶体分解的证据。

本实验有两个目标。一方面，检查番茄红素或叶黄素在以上描述的实验中的能力是由这些类胡萝卜素引起还是可能由油(油通常存在于类胡萝卜素的商业制品中)引起是重要的。另一方面，评估观察到的类胡萝卜素的破坏胆固醇折叠特性有多广泛是重要的。

向100mg结晶胆固醇(sigma)中添加含有不同浓度的多种生物活性疏水物质和油的20ml的乙醇溶液。作为对照，使用20ml相同但不含任何添加物的乙醇。在约20-22℃的室温，温和搅拌若干分钟后，进行结果记录。

在图9a-m中呈现的结果显示，通常用于制备一般的类胡萝卜素且特别是番茄红素和叶黄素的商业制品的橄榄油或葵花油，都不影响测试系统中胆固醇晶体的尺寸或数目。此外，当测试葡萄籽油、菜籽油、榛子油、鳄梨油、椰子油、花生油或杏仁油时，未发现对胆固醇晶体有作用。强乳化剂和生物系统中的主要磷脂之一，磷脂酰胆碱，也不能够影响胆固醇晶体。此外，最丰富的疏水性维生素之一，生育酚，也是无效的。

实施例6.

使用类胡萝卜素分解动脉壁中的胆固醇晶体。

确认类胡萝卜素且特别是番茄红素是否可以影响胆固醇晶体(不仅是生产商合成的，还有天然产生的，并且特别是在人类病理过程期间形成的胆固醇)的折叠是重要的。为此目的，我们使用了动脉粥样硬化的腹主动脉的片，这些片是在联合的血管移植和旁路外科手术期间获得的。

收集了可比较的动脉粥样硬化病灶类型。这是根据它们的发展阶段，具有嵌入主动脉壁的动脉粥样化组织中的尺寸相似的特征显著的胆固醇晶体。作为对照材料，我们收集了含有磷酸钙晶体的动脉粥样硬化的腹主动脉的片。

首先，制备1μg/ml番茄红素的乙醇溶液。然后将其用pbs稀释10倍。作为对照，用相同比的乙醇和pbs制备溶液，但不含番茄红素。然后，将主动脉的片在避光容器中在约20-22℃的室温孵育13天。在图10(a-f)中呈现了本实验的结果。

在pbs-乙醇溶液中孵育未影响病灶的尺寸、组成或结构。同时，将相似的病灶与番茄红素溶液一起孵育导致了显著的变化。这些变化包括：

-到孵育阶段结束时仅存在两个而非三个类晶体结构，

-这些剩余结构的尺寸降低了至少两倍，

-病灶周围富含胆固醇的动脉粥样化物质的尺寸也降低了约两倍。

令人感兴趣的是，在对照实验中，番茄红素-乙醇-pbs溶剂未影响动脉粥样硬化斑块中形成的磷酸钙晶体的尺寸或形状。这表明番茄红素可以破坏已经形成的胆固醇晶体的折叠，但不能破坏矿物质晶体。

总之，本实验表明类胡萝卜素且特别是番茄红素，不仅可以用于防止新胆固醇晶体的形成，而且有助于分解生物特别是人类组织中已经形成的胆固醇晶体。

参考文献

1.lawrencerajendran，hans-joachim&kaisimons-subcellulartargetingstrategiesfordrugdesignanddelivery.naturereviewsdrugdiscovery(2010)9，29-42.

2.davidjhawkesandjohnsonmak-lipidmembrane；anoveltargetforviralandbacterialpathogens.currentdrugtargts(2017)v.18，16，1615-1621.

3.dowingrh-review：pathogenesisofgallstones.alimentpharmacolther.2000may；14suppl2：39-47.

4.stevenmstrasberg-thepathogenesisofcholesterolgallstones-areview.journalofgastrointestinalsurgeryreact-text：552(2)：109-25.

5.lauram.stintonandeldona.shaffer-epidemiologyofgallbladderdisease：cholelithiasisandcancer.gutandliver，vol.6，no.2，april2012，pp.172-187.

6.georges.abela，andkusaiaziz-cholesterolcrystalsrupturebiologicalmembranesandhumanplaquesduringacutecardiovascularevents-anovellnsightintoplaquerupturebyscanningelectronmicroscopy.scanning(2006)v.28，1-10.

7.georges.abela，kusaiaziz，ameethvedre，dorothyr.pathak，johnd.talbott，andjoycedejong.-effectofcholesterolcrystalsonplaquesandintimainarteriesofpatientswithacutecoronaryandcerebrovascularsyndromes.theamericanjournalofcardiology(2009)，103，959-968.

8.georges.abela-cholesterolcrystalspiercingthearterialplaqueandintimatriggeriocalandsystemicinflammation.journalofclinicallipidology(2010)4，156-164.

9.richardjfrank-parallelcholesterolcrystals：asignofimpendingplaquerupture.jclinexpcardiolog(2013)，v4：4，p74.

10.richardconti-hypothermia：isitgoodforthebrainandnotforthearteries？jacc(2013)，vol.61，no.20，2110-4.

11.yamajik，inouek，nakahashit，noguchim，domeit，hyodom，sogay，shirais，andok，kondok，sakaik，iwabuchim，yokoih，nosakah，nobuyoshim，kimurat.-baremetalstentthrombosisandin-stentneoatherosclerosis.circcardiovascinterv.2012feb1；5(1)：47-54.

12.kangsj，ahnjm，hans，parkdw，leesw，kimyh，leecw，parksw，mintzgs，parksj.-multimodalityimagingofattenuatedplaqueusinggrayscaleandvirtualhistologyintravascularultrasoundandopticalcoherenttomography.cathetercardiovascinterv.2016jul；88(1)：e1-e11.

13.takigawat1，matsumaruy，kubot，fukuharan，hayakawam，usuim.-recurrentsubacutein-stentrestenosisaftercarotidarterystentingduetoplaqueprotrusion.neurolmedchir(tokyo).2009sep；49(9)：413-7.

14.marodríguez，hpaul，iabadí，etal.-multiplemicrocrystaldepositiondiseaseinapatientwithsystemiciupuserythematosus.annrheumdis198443：498-502.

15.iwjhurley，amvbrooks，dpreinehr，gbgrant，wegillies-identifyinganteriorsegmentcrystals.britishjournalofophthalmology，1991.75，329-331

16.firoziqbal-therelationshipbetweencholesterolcrystals，foamymacrophagesandhaemosiderininodontogeniccysts.mastersofdentalscience(2008)theuniversityofsydney，newsouthwales.australia.

17.cinthyabessadamottaalmada，deborarodriguesfonesca，rachelregovanzillotta，fábiopires-cholesterolgranulomaofthemaxillarysinus.brazdentj(2008)19(2)：171-174.

18.gowreesonthevendran1，mahmoudal-akraa1，stephenpowis1andneildavies-cholesterolgranulomaofthekidneymimickingatumour.nephroldialtransplant(2003)18：2449-2450.

19.f.parkesweber，c.worster-droughtandw.e.carnegiedickson-cholesteroltumour(craniopharyngioma)ofthepituitarybody.jneurolpsychopathol1934s1-15，39-45.

20.mauricen.richter，andkenneths.mccarty-anisotropiccrystalsinthehumanthyroidgland.amjpathol.1954jun；30(3)：545-553.

21.channabasaveshwarv.y.，govindaswamysh.，umas.h.andsubbaraok.p.-cholesterol-basednonsymmetricliquidcrystaldimers：anoverview.j.mater.chem.(2008)18，2927-2949.

22.rayabhijit-liquidcrystal-areview.asianjournalofresearchlnchamistry(2012)v.5，4，563-567.

23.jonghwajung，seok-hoonlee，jongshinyoo，kanameyoshida，toshimishimizu，seijishikai-creationofdoublesilicananotubesbyusingcrown-appendedcholesterolnanotubes.chemistryaeuropeanjournal(2003)v.9，21，p.5307-5313.

24.pengyaoxing，hongzhongchen，linyibaiandyanlizhao-photo-triggeredtransformationfromvesiclestobranchednanotubesfabricatedbyacholesterol-appendedcyanostilbene.chem.commun.(2015)51，9309-9312.

25.abela(2010)roleofcholesterolcrystalsinmyocardialinfarctionandstroke，clinicallipidology，5：1，57-69

26.ridkerthejupitertrialresults，controversies，andimplicationsforpreventioncirccardiovascqualoutcomes.2009；2：279-285

27.nidorfetaltargetingcholesterolcrystal-inducedinflammationforthesecondarypreventionofcardiovasculardiseasejournalofcardiovascularpharmacologyandtherapeutics00(0)，1-8，2013

28.johnsonetaltraditionalclinicalriskassessmenttoolsdonotaccuratelypredictcoronaryatheroscleroticplaqueburden：actangiographystudy，ajr：192，january2009235-243

29.petersenplasmalipidoxidationpredictsatheroscleroticstatusbetterthancholesterolindiabeticapolipoproteinedeficientmice.experimentalbiologyandmedicine2017；242：88-91