本申请对2018年12月18日提交的第201821022667号印度临时专利申请和2018年11月19日提交的第201821043455号印度临时专利申请的权益进行了声明，其全部公开内容通过引用包含本申请中。
【技术领域】
本发明是关于一种重组凝集素蛋白与其他治疗药物的生物制药组合，特别是一种重组凝集素蛋白与其他治疗药物的生物制药组合及其在控制肿瘤细胞不受控制增殖方面的抗增殖作用。
背景技术：
癌症始于原发性肿瘤，这是由细胞过度生长和分裂引起的肿胀或病态增大。肿瘤分为良性肿瘤、癌变前肿瘤和恶性肿瘤，也可以表示不会发生癌变的病变。良性肿瘤为非癌性肿瘤，恶性肿瘤为癌性肿瘤。癌症是异常细胞不受控制地分裂。癌症有时会扩散到身体的其他部位，这种现象称为继发性肿瘤或转移。
癌症治疗方法包括手术切除癌组织、化疗、综合化疗、放疗、免疫治疗等。这些疗法通常属于侵入性技术，会同时作用于正常的健康细胞和癌细胞。为实现增效，可以联合使用这些方法，从而增强药物成分的治疗效果、减少药物剂量、降低药物毒性，并延迟耐药性诱导。
根据癌细胞的增殖方式，确定是否采用化学疗法治疗癌症。不同的化疗药物具有不同的作用，如抗代谢药物可以干扰癌症所需代谢物的产生或使用；抗微管药物可以干扰有丝分裂所需微管的形成；烷化剂可以通过阻断dna复制来干扰dna烷基化；铂类药物可以使dna交联；抗肿瘤抗生素和拓扑异构酶抑制剂可以抑制dna复制所需的拓扑异构酶。
癌胚thomsen-friedenreich抗原(gaipi-3galnac-a-0-ser/thr、t或tf)存在于90％以上的癌症中，包括口腔癌、结肠癌、卵巢癌和膀胱癌，tf表达与肿瘤的进展和转移相关。申请人先前的专利申请350/mum/2009公开了一种从齐整小核菌的菌核体分离的重组凝集素蛋白，所述蛋白对癌胚tf碳水化合物抗原具有较高的结合特异性。
由于健康细胞具有不良的细胞毒性，因此联合疗法是治疗癌症的有效方法。癌症的一些特性，比如复杂性、向原发部位之外扩散、对某些药物产生耐药性、遗传多样性等，说明了需要采用多种方法进行治疗。联合疗法不仅可以提高癌症治愈或长期缓解的可能性，而且相较于单一疗法，对重要器官和组织的损伤更小。一种治疗方法有时会使肿瘤更容易被第二种治疗方法治疗。例如，某些化疗药物会使放疗对肿瘤的治疗效果更好。在其他情况下，同时服用两种以上药物可能会产生协同作用，增强各药物的药效强度，因此联合用药效果大于单药效果。联合用药可以产生倍增效应，将获益放大数倍。us5053386(1991)描述了一种通过凝集素、相思子蛋白和相思子凝集素来抑制术后恶性肿瘤转移的组合物和疗法。本发明还公开了一种蛋白质结合放疗和/或化疗的联合治疗方法。
《分子和细胞生物化学》(第394卷(1-2)；第225-235页；2014年)公开了联合使用和单独使用从韩国槲寄生中提取的凝集素(viscumalbumvar.coloratumagglutinin，vca)和多柔比星(dox)在mcf-7(雌激素受体阳性)和mda-mb231(雌激素受体阴性)人乳腺癌方面的治疗效果。与单独使用vca或dox治疗相比，联合使用vca和dox在抑制细胞生长方面具有显著的协同作用。
《肿瘤标靶》(第8卷(26)，第42466-42477页，2017年)公开了一种联合使用培美曲塞和从美国牛蛙卵母细胞(csbl)中分离的唾液酸结合凝集素进行治疗的方法，与培美曲塞和顺铂药物组合(间皮瘤的标准治疗)相比，这种联合疗法的剂量依赖性细胞毒性作用更明显。
但是，难点在于并非所有这些联合疗法都会产生有益的效果。因此，目前的研究重点是开发新的抗增殖药物组合。
要战胜像癌症这样危及生命的疾病，当务之急是开发预防和治疗癌症的最佳方法。联合疗法似乎是其中一种选择。
技术实现要素：
本发明的主要目的是提供一种治疗或预防癌细胞生长的替代方法。更具体说，本发明的主要目的是开发一种经济、有效的方法来治疗或预防癌细胞生长。
本发明的另一个目的是提供一种预防或治疗癌症的有效疗法。确切地说，本发明的目的是提供一种预防或治疗癌症的联合疗法，其中联合系指包含重组凝集素蛋白的协同药物组合。
本发明的另一个目的是提供一种治疗上有效的药物组合，来预防和/或治疗癌症。
本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗癌症的治疗上有效的药物组合的有效浓度。
本发明的另一个目的是提供一种药学上可接受的，用于预防和/或治疗癌症且治疗上有效的药物组合的有效浓度配方。
本发明的另一个目的是提供一种具有seqidno:1氨基酸序列，用于预防、治疗或抑制癌细胞增殖的重组凝集素蛋白组合疗法。
本发明的主要方面关于一种由重组凝集素蛋白和一种或多种其他治疗药物组成的治疗上可接受的药物组合。
优选具有协同作用的药物组合。
重组凝集素蛋白浓度优选0.5μg/ml–100μg/ml。
优选治疗上有效的药物组合，用于预防或治疗受试者癌症。
本发明的第二个方面提供了一种治疗或预防受试者罹患癌症的重组凝集素蛋白，其中重组凝集素蛋白与一种或多种其他治疗药物联合给药，其中，所述其他治疗药物可以同时、分别或依次给药。本发明的第三个方面提供了一种治疗、预防癌症或抑制受试者肿瘤细胞生长的方法，包括对受试者联合使用有效剂量的重组凝集素蛋白以及一种或多种其他治疗药物，其中，所述其他治疗药物可以同时、分别或依次给药。
本发明的第四个方面提供了一种预防、防增生、治疗或治愈受试者癌症或肿瘤的联合疗法，包括重组凝集素蛋白与一种或多种其他治疗药物联合给药，其中，所述其他治疗药物可以同时、分别或依次给药。
有利的是，其他治疗药物为抗癌药。
所述抗癌药优选抗肿瘤抗生素。
所述抗癌药优选抗代谢物、烷基化抗肿瘤剂、抗微管剂和/或拓扑异构酶i抑制剂。
所述抗癌药更优选恶唑磷、氮芥、烷基化抗肿瘤剂、拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷、抗叶酸剂或嘧啶拮抗剂。
所述抗代谢物更优选5-氟脲嘧啶(5-fu)、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞或卡培他滨。
所述烷基化抗肿瘤剂更优选顺铂或卡铂等铂类抗肿瘤剂。
所述抗微管剂更优选紫杉醇、多西他赛、注射用紫杉醇或多西紫杉醇。
所述拓扑异构酶i抑制剂更优选伊立替康或拓扑替康。
有利的是，所述抗癌药为顺铂时，所述联合疗法可用于预防或治疗受试者的口腔癌、卵巢癌或膀胱癌。
所述癌症为口腔癌时，优选的重组凝集素浓度为10-90μg/ml，顺铂浓度为0.1-1.5μm，或者优选的重组凝集素浓度为5μg/ml，顺铂浓度为0.5-1.5μm。
所述癌症为卵巢癌时，优选的重组凝集素浓度为1-2.5μg/ml，顺铂浓度为0.25-5μm，或者优选的重组凝集素浓度为5μg/ml，顺铂浓度为0.1-5μm，或者优选的重组凝集素浓度为10-20μg/ml，顺铂浓度为0.01-5μm。
所述癌症为膀胱癌时，优选的重组凝集素浓度为5-80μg/ml，顺铂浓度为1–500μm。
有利的是，所述抗癌药选用5-fu时，所述联合疗法可用于预防或治疗口腔癌、胰腺癌或结肠癌。
所述癌症为口腔癌时，优选的重组凝集素浓度为5–90μg/ml，5-fu浓度为0.01–5μm。
所述癌症为胰腺癌时，优选的重组凝集素浓度为10-80μg/ml，5-fu浓度为1-250μm，或者优选的重组凝集素浓度为5μg/ml，5-fu浓度为1-50或250μm。
所述癌症为结肠癌时，优选的重组凝集素浓度为5–80μg/ml，5-fu浓度为10–200μm，或者优选的重组凝集素浓度为1μg/ml，5-fu浓度为50–200μm。
有利的是，所述抗癌药选用伊立替康时，所述联合疗法可用于预防或治疗结肠癌。
优选的重组凝集素浓度为40–80μg/ml，伊立替康浓度为1–50μm，或者优选的重组凝集素浓度为20μg/ml，伊立替康浓度为1或10–50μm。
有利的是，所述抗癌药为紫杉醇时，所述联合疗法可用于预防或治疗卵巢癌或乳腺癌。
所述癌症为卵巢癌时，优选的重组凝集素浓度为1–20μg/ml，紫杉醇浓度为0.25–5nm。
所述癌症为乳腺癌时，优选的重组凝集素浓度为20–80μg/ml，紫杉醇浓度为0.1–10nm；或者优选的重组凝集素浓度为10μg/ml，紫杉醇浓度为1–10nm。
有利的是，所述抗癌药为吉西他滨时，所述联合疗法可用于预防或治疗膀胱癌或胰腺癌。
所述癌症为膀胱癌时，优选的重组凝集素浓度为2.5–80μg/ml，吉西他滨浓度为1–300μm。
所述癌症为胰腺癌时，优选的重组凝集素浓度为5–20μg/ml，吉西他滨浓度为5–25μm；或者优选的重组凝集素浓度为40–80μg/ml，吉西他滨浓度为1–25μm。
有利的是，所述抗癌药为卡铂时，所述联合疗法可用于预防或治疗乳腺癌。
优选的重组凝集素浓度为5–80μg/ml，卡铂浓度为50–1000μm；或者优选的重组凝集素浓度为2.5μg/ml，卡铂浓度为100–1000μm。
有利的是，重组凝集素蛋白是一种具有seqidno:1、2或3所示氨基酸序列，或与seqidno:1、2或3所示氨基酸序列具有60％、70％、80％、90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的蛋白。
重组凝集素蛋白浓度优选0.5μg/ml–100μg/ml。重组凝集素蛋白浓度更优选范围为1μg/ml–90μg/ml。
其他治疗药物浓度优选0.001nm–1000μm。
顺铂浓度优选0.01μm–500μm。
5-氟脲嘧啶(5-fu)浓度优选0.01μm–250μm。
伊立替康浓度优选0.1μm–50μm。
紫杉醇浓度优选0.001nm–10μm。
吉西他滨浓度优选0.01μm–300μm。
卡铂浓度优选10μm–1000μm。
有利的联合疗法包括一定剂量的重组凝集素和一定剂量的适合疗效实现的其他治疗药物。
重组凝集素优选剂量为体内重组凝集素浓度达到0.5μg/ml–100μg/ml。
其他治疗药物优选剂量为体内治疗药物浓度达到0.001nm–1000μm。
顺铂优选剂量为体内顺铂浓度达到0.01μm–500μm。
5-氟脲嘧啶(5-fu)优选剂量为体内5-fu浓度达到0.01μm–250μm。
伊立替康优选剂量为体伊立替康内浓度达到0.1μm–50μm。
紫杉醇优选剂量为体内paclitaxel浓度达到0.001nm-10nm。
吉西他滨优选剂量为体内吉西他滨浓度达到0.01μm–300μm。
有利的是，重组凝集素蛋白和其他治疗药物的组合为一种组合物。优选方案是所述组合物包含一种或多种药学上可接受的辅料。
本发明的第五方面还提供了与一种或多种其他治疗药物联合预防或治疗癌症的重组凝集素蛋白，其中，所述其他治疗药物选用5-氟脲嘧啶(5-fu)、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂或伊立替康中的一种或多种。
重组凝集素用于治疗口腔癌、卵巢癌或膀胱癌时，优选重组凝集素蛋白与顺铂联合给药，其中，顺铂可以同时、分别或依次给药。
重组凝集素用于治疗口腔癌、胰腺癌或结肠癌时，优选重组凝集素蛋白与5-fu联合给药，其中，5-fu可以同时、分别或依次给药。
重组凝集素用于治疗结肠癌时，优选重组凝集素蛋白单独给药或与伊立替康联合给药，其中，伊立替康可以同时、单独或依次给药。
重组凝集素用于治疗卵巢癌或乳腺癌时，优选重组凝集素蛋白单独给药或与紫杉醇联合给药，其中，紫杉醇可以同时、单独或依次给药。
重组凝集素用于治疗膀胱癌或胰腺癌时，优选重组凝集素蛋白单独给药或与吉西他滨联合给药，其中，吉西他滨可以同时、分别或依次给药。
重组凝集素用于治疗乳腺癌时，优选重组凝集素蛋白单独给药或与卡铂联合给药，其中，卡铂可以同时、分别或依次给药。
本发明的第六方面还提供了一种与重组凝集素蛋白联合预防或治疗癌症的治疗药物，其中，所述治疗药物选用5-氟脲嘧啶(5-fu)、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂或伊立替康中的一种或多种。
用于治疗口腔癌、卵巢癌或膀胱癌时，所述治疗药物优选顺铂，所述与重组凝集素蛋白联合给药，其中，重组凝集素蛋白可以同时、分别或依次给药。
用于治疗口腔癌、胰腺癌或结肠癌时，所述治疗药物优选5-fu，所述5-fu与重组凝集素蛋白联合给药，其中，重组凝集素蛋白可以同时、分别或依次给药。
用于治疗结肠癌时，所述治疗药物优选伊立替康，所述伊立替康与重组凝集素蛋白联合给药，其中，重组凝集素蛋白可以同时、分别或依次给药。
用于治疗卵巢癌或乳腺癌时，所述治疗药物优选紫杉醇，所述紫杉醇与重组凝集素蛋白联合给药，其中，重组凝集蛋白可以同时、分别或依次给药。
用于治疗膀胱癌或胰腺癌时，所述治疗药物优选吉西他滨，所述吉西他滨与重组凝集素蛋白联合给药，其中，重组凝集素蛋白可以同时、分别或依次给药。
用于治疗乳腺癌时，所述治疗药物优选卡铂，所述卡铂与重组凝集素蛋白联合给药，其中，重组凝集素蛋白可以同时、分别或依次给药。
【具体实施方式】
本文所用“蛋白质”一词系指氨基酸残基聚合物。
本文所用“氨基酸”一词系指天然氨基酸和合成氨基酸，以及具有与天然氨基酸相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸系指由遗传密码编码的氨基酸，包括蛋白质氨基酸。天然氨基酸也包括在细胞内转译后修饰的氨基酸。合成氨基酸包括非标准氨基酸，如硒半半胱氨酸和吡咯赖氨酸。通常情况下，合成氨基酸不属于蛋白质氨基酸。
“癌症”和“肿瘤”一词在本发明中可以互换使用，其具有本领域技术人员所理解的相同含义。正常细胞生长失控并排斥身体健康细胞时，就形成了癌症。这些增生的细胞会影响组织、器官或生物体的正常机能。癌症可以出现在身体任何部位，也可能扩散到身体的其他部位。当癌细胞在体内扩散时，称为癌细胞转移。
“重组”一词系指通过人为干预人为改变或合成的(即非天然)核酸或多肽。这种改变可以在物质的自然环境或状态中进行，也可以将物质从其自然环境或状态中移除。例如，“重组核酸”系指对核酸重组后形成的核酸，例如通过克隆、基因改组或其他众所周知的分子生物学过程形成的核酸。“重组dna分子”是由通过分子生物学技术连接在一起的dna片段组成。本文所用的“重组蛋白质”或“重组多肽”一词系指通过重组dna分子表达的蛋白质分子。
本文所用的“凝集素”一词系指碳水化合物结合蛋白。更具体地说，本发明中的重组凝集素蛋白是来源于齐整小核菌凝集素(srl)的凝集素。齐整小核菌凝集素(srl)是一种从土传植物病原真菌齐整小核菌菌核中分离出来的凝集素。
本文所用的“同源性”或“同源”一词系指在给定区域或部位上至少有部分一致的两个或以上的参照实体。具有同源性或同一性的部位、区域或结构域系指两个或以上参照实体中相同或相似的部分。因此，当两个序列在一个或多个序列区域上相同时，它们在这些区域内具有相同性。实质上的同源性系指在结构上或功能上保守的分子，至少具有或预计具有与参考分子相似的结构或功能(例如，生物功能或活性)。或者可能意味着该分子的相关/相应区域或部分与参考分子的同源性相同。
在一个实施例中，使用带默认参数，通过blastp算法来确定两个序列之间的“同源性”百分比(altschul等人，核酸研究，1997年9月1日；25(7)：3389-402)。具体可以通过网址https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi.查阅blast算法。在另一个实施例中，对于序列全局比对，两个序列之间的同源性百分比使用默认参数，通过embossneedle算法来确定。具体可以通过网址https://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/查阅embossneedle算法。
除非另有说明，“同源性”一词在本说明书中可与“序列同一性”一词互换使用。
本文使用的“重组凝集素蛋白”一词涵盖任何药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药或在患者用药后能够(直接或间接)提供本文所述化合物的任何其他化合物。可以通过本领域已知的方法来制备药用盐、溶剂化物、水合物、前药。
本文使用的“疗法”一词可以指用于治疗、预防和/或控制疾病或其一种或多种症状的任何方法、组合物和/或活性成分。
说明部分使用的“联合疗法”一词包括在同一时间或不同时间对癌症患者使用相同或不同的药物配方。如果治疗药物在不同时间给药，则给药时间应足够接近，以确保增效或协同作用。
“化疗”一词系指使用药物治疗癌症。本文所用的“化疗药物”是一种用于治疗癌症的化合物。
化疗药物优选可以与重组凝集素蛋白联合使用的治疗药物。可以用于本发明涉及疗法的化疗药物没有限制(“化疗药物”一词具有本领域技术人员已知的相同含义)。所述化疗药物非限制性示例包括烷化剂(如丝裂霉素c、环磷酰胺、白消安、异环磷酰胺、同型物异环磷酰胺、美法仑、六甲基三聚氰胺、噻替哌、苯丁酸氮芥、氮芥或达卡巴嗪)、抗代谢剂(如吉西他滨、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、2-氟脱氧胞苷、甲氨蝶呤、依达曲沙、雷替曲塞或三甲曲沙)、拓扑异构酶ii抑制剂(如多柔比星、表阿霉素、依托泊苷、替尼泊苷或米托蒽醌)、拓扑异构酶i抑制剂(如伊立替康(cpt-11)、7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)或拓扑替康)、抗有丝分裂药物(例如紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱或长春瑞滨)以及铂类衍生物(例如顺铂、奥沙利铂、螺铂或卡铂)。化疗药物可大致分为上述几类。
还可以进一步划分为下表所述的亚类。
“放射治疗”或“放疗”一词系指通过电离辐射治疗癌症和其他疾病。在放疗过程中，沉积的电离辐射能量可以破坏细胞遗传物质，损害或破坏电离辐射区域的细胞，使这些细胞无法继续生长。尽管辐射对癌细胞和正常细胞都有损害，但正常细胞能够自我修复并正常工作。本发明中的放射治疗包括但不限于使用伽马射线、x射线和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。其他形式的dna破坏因子也在考虑之列，如微波和紫外线照射。本发明中的放疗还可以进一步包括使用放射性标记抗体，将一定辐射量直接递送到癌症部位(放射免疫治疗)和/或包括使用放射增敏剂。“免疫疗法”一词系指利用免疫效应细胞和分子来靶定和破坏癌细胞。抗体本身可以作为治疗的效应细胞，也可以招募其他细胞来杀伤癌细胞。抗体也可以与药物或毒素(化疗药物、放射性核素、蓖麻毒素a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)共扼，仅作为靶向剂。或者，效应细胞可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接或间接与肿瘤细胞靶点相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。联合治疗方法(直接细胞毒活性和抑制或减少erbb2)在治疗erbb2过度表达癌症方面具有疗效。
本文使用的“药学上可接受的盐”一词系指保留化合物生物效应和特性而无生物方面或其他副作用的盐。药学上可接受的盐系指药学上可接受的化合物盐，所述化合物盐来自本领域众所周知的各种有机和无机反离子。
“药物组合”一词系指第一类和第二类药物成分的任何组合，包括混合成单一组合物和分别保存的情况。“药物组合物”或“药学上可接受的组合物”或“药学上可接受的制剂”一词系指本文公开的化合物与药物辅料的混合物，如稀释剂或载体(例如，参见remington，药学科学与实践第22版，医药出版社(2012年9月15日)和《药用辅料手册》第6版，raymondrowe，医药出版社(2009))。所述药物组合物有助于对生物体使用所述化合物。药物组合物通常会根据具体的给药途径进行调整。
“有效”或“治疗上有效”一词系指足以引起预期生物反应的效果。如本领域普通技术人员所理解的一样，本发明描述的药物组合的疗效因期望的生物终点、所递送药物的药代动力学、所治疗的疾病、给药方式和患者等因素而有所不同。如果一种或多种症状缓解或临床指标减轻，则治疗通常是“有效”的。或者，如果疾病、紊乱情况或病情进展放缓或停止，则认为治疗是“有效”的。
联合指数(ci)值基于loewe可加性模型确定，用于评估药物-药物相互作用的性质，对于各种药物-药物浓度和作用水平(fa，受影响部分；抑制癌细胞增殖)，药物-药物相互作用可以是相加的(cl＝1)、拮抗的(cl>1)或协同的(ci<1)。使用compusyn软件(combosyninc.,paramus,n.j.)并按照chou等人的方法，根据线性回归趋势线计算cl值，即将双曲线和sigmoidal剂量效应曲线转化为线性形式(choutc(2010)，使用chou-talay法对药物组合物的协同作用进行定量研究。《癌症研究》70:440-6，可以登录combosyn,inc.网站(www.combosyn.com)查阅相关说明。
通过协同作用，使用单一疗法的较小剂量就可以有效治疗疾病。小剂量用药不仅可以降低毒性，而且不会影响疗效。此外，协同作用还可以提高治疗效果。最后，与任何单一疗法相比，协同治疗可以更好地避免或减轻疾病。“相加作用”一词系指组合中的任意两种或多种治疗药物之和。本文所用的“拮抗”一词系指阻断(例如，降低或防止)生物活性。“抑制”一词系指降低可测定量。
本文使用的“抗癌药”一词系指通过体外或体内方式抑制癌细胞功能，抑制癌细胞形成和/或破坏癌细胞本身的物质或治疗方法(如放射疗法)。
“抗肿瘤抗生素”一词系指具有抗肿瘤作用的化学物质。一些实施例中使用的“抗肿瘤抗生素”并非用于治疗感染的抗菌抗生素。抗肿瘤抗生素是一种通过干扰dna来阻断细胞生长的抗癌药物。
本文在描述治疗药物对癌细胞系作用时使用的“细胞毒性”一词系指“对细胞有毒”。有效破坏癌细胞的治疗药物称为细胞毒性剂或描述为具有细胞毒性。
“ic50”或“ic50”一词系指将给定的可定量测定的参数抑制50％所需的抑制剂量。通过这种定量测量可以知道将特定生物参数、生化参数或化学参数(或参数的组成部分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半所需的特定药物或其他物质(抑制剂)的剂量。
“协同”一词系指两种或多种治疗药物的组合，其疗效优于任何两种或多种单一药物的相加作用。通过计算联合指数(ci)值，可以量化药剂的协同作用。
cl值可以根据a、b两种药物的ic50测定值计算，公式如下。
其中
da(50)＝联合药物b使用时，产生50％细胞毒性所需的药物a浓度
ica(50)＝单独使用药物a产生50％细胞毒性所需的浓度
db(50)＝联合药物a使用时，产生50％细胞毒性所需的药物b浓度
icb(50)＝单独使用药物b产生50％细胞毒性所需的浓度
其中，药物a是本发明的凝集素(如由seqidno.1所示氨基酸序列组成的蛋白质)，药物b是受测的其他治疗药物。
协同作用、相加作用或拮抗作用根据以下标准确定：
cl>1-具有拮抗作用
cl＝1-具有相加作用
cl<1-具有协同作用
因此，如果计算出的ci值小于1，则表明药物a和b有协同作用。
本文使用的“受试者”系指作为治疗、观察或实验对象的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物和无脊椎动物，如鱼类、贝类、爬行动物，特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类动物，如猴子、黑猩猩和猿猴，特别是人类。
此外，本文提到的任何药物可以是非晶态或晶态的游离化合物或溶合物(如水合物)，这两种形态均在本发明范围内。溶剂化方法在本领域内众所周知的方法。
伴生序列简述：
seqidno:1：表示srl氨基酸序列的一种变体(在wo2010/095143中报告为rec-2)。
seqidno:2：表示srl氨基酸序列的一种变体(在wo2010/095143中报道为rec-3)。
seqidno:3：表示srl氨基酸序列的一种变体(在wo2014/203261中报道)。
具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素蛋白
tykitvrvyqtnpdaffhpvektvwkyanggtwtitddqhvltmggsgtsgtlrfhadngesftatfgvhnykrwcdivtnlaadetgmvinqqyysqknreearerqlsnyqvknakgrnfqivyteaegndlhanliig
具有seqidno:2所示氨基酸序列的重组凝集素蛋白
vykitvrvyqtnpdaffhpvektvwkyanggtwsitddqhvltmggsgtsgtlrfhadngesftatfgvhnykrwcdivtnlaadetgmvinqqyysqknreearerqlsnyqvknakgrnfqivyteaegndlhanliig
具有seqidno:3所示氨基酸序列的重组凝集素蛋白
vykitvrvyqtnpdaffhpvektvwkyadggtwsitddqhvltmggsgtsgtlrfhadngesftatfgvhdykrwcdivtdlaadetgmvinqeyysekdreearerqnsnyevkdakgrnfeivyteaegndlhadliig
发明详述
本发明总体上涉及一种由重组凝集素蛋白和一种或多种其他治疗药物组成的治疗上有效的药物组合。
在某些实施例中，提供了一种由重组凝集素蛋白和一种或多种其他治疗药物组成的治疗上有效的药物组合，其中，所述药物组合具有协同作用。一些实施例中，重组凝集素蛋白浓度为0.5μg/ml–100μg/ml。
治疗
本发明中所述的治疗上有效的药物组合用于预防肿瘤生长或转移以及治疗或治愈癌症。在一些实施例中，通过具有协同作用的药物组合可预防或治疗腺癌、鳞状细胞癌、移行上皮细胞癌、基底细胞癌、肉瘤、淋巴瘤、上皮细胞癌或非上皮细胞癌。在某个特定的实施例中，通过本发明所述的联合疗法可预防或治疗胰腺癌、腹部癌、肝癌、前列腺癌、口腔癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、乳腺癌、骨髓癌、黑色素瘤、白血病或中枢神经系统癌。
在具体的实施例中，通过联合疗法可以预防或治疗胰腺癌、口腔癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等。
凝集素蛋白
重组凝集素蛋白具有seqidno:1所示氨基酸序列，或者，在一些实施例中，蛋白包含与seqidno:1所示氨基酸序列具有至少60％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，重组凝集素蛋白可能包含与seqidno:2或3所示氨基酸序列具有至少60％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，重组凝集素蛋白包含与seqidno:1所示氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，重组凝集素蛋白包含seqidno:1、2或3所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述的凝集素蛋白包含的氨基酸残基少于200个，优选少于150个氨基酸残基。
其他治疗药物
在一些实施例中，其他治疗药物系指用于治疗癌症时化疗中使用的抗癌药。在一些实施例中，其他治疗药物选用烷化剂(如丝裂霉素c、环磷酰胺、白消安、异环磷酰胺、同型物异环磷酰胺、美法仑、六甲基三聚氰胺、噻替哌、苯丁酸氮芥、氮芥或达卡巴嗪)、抗代谢剂(如吉西他滨、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、2-氟脱氧胞苷、甲氨蝶呤、依达曲沙、雷替曲塞或三甲曲沙)、拓扑异构酶ii抑制剂(如多柔比星、表阿霉素、依托泊苷、替尼泊苷或米托蒽醌)、拓扑异构酶i抑制剂(如伊立替康(cpt-11)、7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)或拓扑替康)、抗有丝分裂药物(例如紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱或长春瑞滨)以及铂类衍生物(例如顺铂、奥沙利铂、螺铂或卡铂)。
根据美国癌症协会(www.cancer.org)，用于治疗乳腺癌的化疗药物选用紫杉醇、多西他赛紫杉萜、多柔比星、表阿霉素、顺铂、卡铂、长春瑞滨、卡培他滨、吉西他滨、伊沙匹隆和艾日布林。同样，治疗胰腺癌的化疗药物选用吉西他滨、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、紫杉醇、卡培他滨、顺铂和伊立替康。另外，口腔癌和口咽部癌症治疗时，化疗药物选用顺铂、卡铂、5-氟尿嘧啶(5-fu)、紫杉醇、多西他赛和羟基脲。类似地，治疗结肠癌或直肠癌时，化疗药物选用5-fu、卡培他滨、伊立替康、奥沙利铂以及三氟胸苷和替吡拉西组合药物。卵巢癌治疗时，药物选用铂类化合物(如顺铂或卡铂)和紫杉烷(如紫杉醇或多西他赛或其组合；治疗膀胱癌时，化疗药物选用吉西他滨、顺铂、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、卡铂或其组合。
根据本发明的具体实施例，其他治疗药物可从紫杉醇、顺铂和卡铂中选择，用于治疗乳腺癌或卵巢癌，口腔癌可以选用顺铂和5-fu，膀胱癌可以选用顺铂和吉西他滨，胰腺癌可以选用5-fu和吉西他滨以及结肠癌可以选用5-fu和伊立替康。
给药方案
治疗上有效的联合疗法可能包括以相同或不同的药物配方，在相同或不同的时间对受试者使用重组凝集素蛋白和其他治疗药物，其中，重组凝集素蛋白和其他治疗药物可以同时、分别或依次给药。
本文使用的“同时给药”一词系指包含重组凝集素蛋白和其他治疗药物的组合药物给药时间间隔不超过约15分钟，更具体地说，不超过约10、5或1分钟。当重组凝集素蛋白和治疗药物同时给药时，重组凝集素蛋白和治疗药物可以包含在同一组合药物中(例如，由重组凝集素蛋白和一种或多种治疗药物组成的组合药物)，或包含在单独的组合药物中(例如，重组凝集素蛋白包含在一种组合药物中，一种或多种治疗药物包含在另一种组合药物中)。
在“依次给药”时，其他治疗药物在重组凝集素蛋白给药之前或之后给药。在依次给药中，重组凝集素蛋白和其他治疗药物的给药时间间隔超过约15分钟，更具体地说，超过约20、30、40、50和60分钟或更长时间。重组凝集素蛋白或其他治疗药物不分给药顺序。重组凝集素蛋白和其他治疗药物包含在不同的组合药物中，所述组合药物可以采用相同或不同包装。
在“分别给药”时，重组凝集素蛋白和其他治疗药物可按顺序给药，其中一种先给药，另一种后给药，反之亦然。两次给药的时间间隔超过60分钟。
在另一个实施例中，提供了使用重组凝集素蛋白治疗或预防癌症，包括将具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素蛋白和其他治疗药物联合给药，其中，其他治疗药物可以同时、分别或依次给药。
在一个具体实施例中，提供了使用重组凝集素蛋白预防或治疗受试者癌症，包括对受试者联合使用有效剂量的重组凝集素和其他抗癌药，所述其他抗癌药包括抗代谢剂、烷基化抗肿瘤剂、抗微管剂和拓扑异构酶i抑制剂，其中，抗代谢物可选用5-fu、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞或卡培他滨，烷基化抗肿瘤剂可选用顺铂或卡铂等铂类抗肿瘤剂，抗微管剂可选用紫杉醇、多西他赛、艾布拉西或多西紫杉醇，拓扑异构酶i抑制剂可选用伊立替康或拓扑替康，其中，其他抗癌药可以同时、分别或依次给药。
而在另一个具体实施例中，提供了使用重组凝集素蛋白治疗或预防癌症，包括重组凝集素蛋白与其他抗癌药联合给药，所述其他抗癌药可选用紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、伊立替康和吉西他滨，其中，其他抗癌药可以同时、分别或依次给药。
本发明的另一方面关于一种治疗或预防受试者癌症的方法，包括对受试者联合使用有效剂量的重组蛋白和其他治疗药物，其中，所述其他治疗药物可以同时、分别或依次给药。
在一个具体实施例中，提供了一种治疗或预防受试者癌症的方法，包括对受试者联合使用有效剂量的重组凝集素蛋白和其他抗癌药，所述抗癌药包括抗代谢剂、烷基化抗肿瘤剂、抗微管剂和拓扑异构酶i抑制剂，其中，抗代谢物可选用5-fu、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞或卡培他滨，烷基化抗肿瘤剂可选用顺铂或卡铂等铂类抗肿瘤剂，抗微管剂可选用紫杉醇、多西他赛、艾布拉西或多西紫杉醇，拓扑异构酶i抑制剂可选用伊立替康或拓扑替康，其中，其他抗癌药可以同时、分别或依次给药。
而在另一个具体实施例中，提供了一种治疗或预防受试者癌症的方法，包括对受试者联合使用有效剂量的重组凝集素蛋白和其他抗癌药，所述抗癌药可选用紫杉醇、5-fu、顺铂、卡铂、伊立替康和吉西他滨，其中，其他抗癌药可以同时、分别或依次给药。
联合疗法示例
重组凝集素蛋白在单独使用时具有细胞毒性。然而，与其他治疗药物联合使用时，对测试细胞系产生的作用非常令人惊讶。所述联合疗法既有相加作用，又有较高的协同作用。所述组合对抑制癌细胞的生长非常有效。
在本发明的另一个具体实施例中，提供了一种由重组凝集素蛋白和其他抗癌药组成的协同药物组合，所述其他抗癌药可选用紫杉醇、5-fu、卡铂、顺铂、伊立替康和吉西他滨。通过该组合，可用于治疗或预防癌症。
本发明的主要方面是涉及一种包含具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素蛋白和顺铂的协同药物组合，其中，通过该组合可用于治疗或预防乳腺癌、口腔癌、卵巢癌或膀胱癌。
本发明的另一个主要方面涉及一种包含重组凝集素蛋白和5-fu的协同药物组合，其中，通过该组合可用于治疗或预防胰腺癌、口腔癌或结肠癌。
本发明的另一个主要方面涉及一种包含重组凝集素蛋白和伊立替康的协同药物组合，其中，通过该组合可用于治疗或预防结肠癌。
而本发明的另一个主要方面涉及一种包含重组凝集素蛋白和紫杉醇的协同药物组合，其中，通过该组合可用于治疗或预防卵巢癌和乳腺癌。
而本发明的另一个主要方面涉及一种包含重组凝集素蛋白和吉西他滨的协同药物组合，其中，通过该组合可用于治疗或预防膀胱癌和胰腺癌。
本发明的另一个主要方面涉及一种包含重组凝集素蛋白和卡铂的协同药物组合，其中，通过该组合可用于治疗或预防乳腺癌。
而在另一个实施例中，联合治疗可以包括在放疗时使用本发明描述的各种成分。
药物组合物
本发明的另一方面是提供一种组合物，即由重组凝集素蛋白联合其他治疗药物和一种或多种药学上可接受的辅料组成的组合物。
本发明所述的组合制剂是合适的、药学上可接受的剂型/药物组合物。所述制剂可以是口服剂型或注射剂型或植入剂型。例如，所述制剂可以是片剂、胶囊、含片、悬浮液、溶液、乳剂、粉剂或糖浆，用于静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射、皮内注射、仓库注射、鞘内注射、经皮注射、舌下注射、肝内注射、口服或吸入。
本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料系指技术人员已知的配方中的非活性药物成分，如稳定剂、增溶剂、防腐剂、崩解剂、粘合剂、填充剂和润滑剂或本领域技术人员已知的任何其他物质。
本发明中使用的组合物包括50mmtris碱(三羟甲基氨基甲烷)、150mm氯化钠(酸碱度为8.0±0.2)。但是，所述胃肠外给药的组合物包含辅料，不限于作为张力调节剂的葡萄糖、甘油、氯化钠或甘露醇；作为抗氧化剂的抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、亚硫酸盐(亚硫酸氢盐、焦亚硫酸氢盐)或单硫代甘油；作为抗菌剂的苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯(甲基、丙基、丁基)、氯丁醇、硫柳汞和苯基汞盐(乙酸盐、硼酸盐、硝酸盐)；作为螯合剂的钙二钠、乙二胺四乙酸(edta)、edta二钠、edta钠、钙或二乙烯三胺五乙酸；作为表面活性剂的聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(吐温80)、山梨醇酐单油酸酯-聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(吐温20)、卵磷脂、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(pluronics)或山梨醇三油酸酯(司盘85)；作为共溶剂丙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇、山梨醇、二甲基乙酰胺聚氧乙烯蓖麻油。其他药物组合物是根据本领域技术人员的现有知识，使用标准书籍中列出并为各国监管当局所接受的辅料制备。
药物组合物中重组凝集素蛋白和其他治疗药物的优选剂量视组合物的剂型、给药途径、受试者类型、年龄和基因组成、癌症阶段和治疗方法的不同而有所不同。
浓度和剂量
一些实施例中的重组凝集素蛋白有效浓度为0.5μg/ml–100μg/ml。特定实施例中的有效浓度为1μg/ml–90μg/ml。一些实施例中的其他治疗药物有效浓度为0.001nm–1000μm。技术人员需了解，在联合疗法中，有效浓度系指各种成分联合后可以产生协同作用的浓度。因此，重组凝集素蛋白的有效浓度会根据其他治疗药物、治疗方法和癌症类型而有所不同。同样，各种其他治疗药物与重组凝集素蛋白联合使用或单独使用时，其浓度也会因癌症类型而有所不同。例如，在本发明中，用于卵巢癌细胞系时，重组凝集素蛋白的有效协同浓度为1μg/ml–20μg/ml，用于乳腺癌细胞系时，重组凝集素蛋白浓度在2.5μg/ml时，没有发现协同作用，即使两种情况下均使用紫杉醇作为其他治疗药物。同样，用于这两种癌症时，紫杉醇的有效协同浓度也不同。因此，所有活性剂的浓度根据癌症种类而变化，本领域的技术人员对此非常清楚。
本发明人对不同的癌细胞系进行了多项研究，以检验单独使用重组凝集素蛋白或与上述治疗药物联合使用时对几种癌症的疗效。本发明人选用吉西他滨和5-fu治疗胰腺癌，紫杉醇和卡铂治疗乳腺癌，顺铂和5-fu治疗口腔癌，5-fu和伊立替康治疗结肠癌，顺铂和紫杉醇治疗卵巢癌，顺铂和吉西他滨治疗膀胱癌。
所述治疗或预防可以包括按治疗上有效的剂量，对受试者使用凝集素。在一些实施例中，凝集素给药剂量为0.1-1000mg/kg、0.5-100mg/kg或1-50mg/kg。技术人员能够根据治疗疾病的性质和受试者的病情来确定凝集素的剂量。
所述治疗或预防可以包括按治疗上有效的剂量，对受试者使用其他治疗药物。在一些实施例中，其他治疗药物给药剂量为每单位体表面积(mg/m2)1–10000mg，优选10–1000mg/m2，最好为50–600mg/m2。
因此，本发明还提供了一种包含凝集素蛋白和药学上可接受的稀释剂或辅料的药物组合物。示例性稀释剂和辅料包括无菌水、生理盐水和/或药学上可接受的缓冲剂。凝集素或组合物可以通过任何合适途径给药，包括但不限于注射(包括静脉注射(推注或输注)、动脉注射、腹膜内注射、皮下注射(推注或输注)、脑室内注射、肌肉注射或蛛网膜下腔注射)、口服(如片剂、凝胶、锭剂或液体)、吸入、通过粘膜(如口腔、鼻腔或直肠粘膜)局部给药(包括喷雾剂、片剂、透皮贴剂、皮下植入剂或栓剂)。在一些实施例中，所述的凝集素(如具有seqidno:1、2、3所示氨基酸序列的凝集素)或药物组合物可以经肠道、胃肠外或局部对受试者给药。凝集素或药物组合物可以各种剂型给药，包括固体(如片剂或胶囊)、冻干粉、液体(如溶液或悬浮液)、半固体或本领域技术人员已知的任何其他剂型。凝集素或药物组合物可以通过对受试者静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射或皮内注射、仓库注射溶液或悬浮液给药，也可以通过鞘内注射、经皮注射、舌下注射或口服、局部或吸入方式给药。受试者可以是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人类。受试者尤其可以是罹患癌症的人类受试者。
示例
本发明中的示例是为了说明单独使用seqidno:1以及与具有代表性的抗癌药联合使用时对选定癌细胞的疗效。所选抗癌药系指各类化疗药物，即抗代谢剂、烷化剂、抗肿瘤剂、抗微管剂和拓扑异构酶i抑制剂。但是，本领域技术人员需清楚了解，下列示例中未列出的任何其他抗癌药也属于上述化疗药物类，在不同浓度下会表现出类似的协同作用。因此，下列示例仅用于说明，不以任何方式限制本发明的范围。
实验中使用的细胞系来自美国典型培养物保藏中心(atcc)。
示例1：seqidno:1、吉西他滨和5-氟尿嘧啶(5-fu)单独给药时对胰腺癌细胞(panc-1细胞系)的细胞毒性作用以及seqidno:1联合吉西他滨和5-氟尿嘧啶给药时对胰腺癌细胞(panc-1细胞系)的协同细胞毒性作用
我们进行了一项研究，以确定seqidno:1与吉西他滨和5-氟尿嘧啶等化疗药物联合使用时对胰腺癌细胞系(panc-1)的协同细胞毒性作用。研究分两阶段进行，如示例1-1和示例1-2所述。
示例1-1-测定吉西他滨和5-fu在seqidno:1条件下对panc-1细胞毒性的ic50值
我们进行了一项研究，以确定重组凝集素(以seqidno:1为代表)浓度对吉西他滨对panc-1细胞毒性的ic50值的影响。相反地，我们也确定了吉西他滨浓度对重组凝集素(以seqidno:1为代表)ic50值的影响。
同样地，我们还对联合使用5-fu和具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素进行了研究。
将细胞与具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素和化疗药物接触48小时，测量细胞毒性作用(细胞毒性百分比)。细胞毒性作用采用众所周知的mtt比色法测定(mossman,t.1983年，细胞生长和存活的快速比色测定法：增殖和细胞毒性测定应用，免疫学方法杂志，第65卷，第55-63页)，以评估细胞的代谢活性。
根据细胞毒性百分比数据，采用4.01版graphpadprism软件计算ic50值。下列表1和表2给出了ic50测定值。
表1：seqidno:1和吉西他滨单独使用以及联合使用时对panc-1细胞系细胞毒性作用的ic50值
表2：seqidno:1和5-氟脲嘧啶(5-fu)单独使用以及联合使用时对panc-1细胞系的ic50值
表1和表2为seqidno:1单独使用或与吉西他滨或5-fu联合使用时的ic50值。可以看出，具有seqidno.1所示氨基酸序列的重组凝集素蛋白与吉西他滨或5-氟尿嘧啶(5-fu)联合使用时，对胰腺癌细胞的ic50值显著降低。
示例1-2-计算吉西他滨和5-fu与seqidno:1联合使用时的ci值。在进一步研究中，我们用吉西他滨(0.01μm–50μm)联合seqidno:1(2.5μg/ml–80μg/ml)对panc-1细胞进行治疗48小时。采用mtt比色法分别测定两种组合的细胞毒性作用。同样地，我们用5-fu(0.1μm–250μm)联合seqidno:1(2.5μg/ml–80μg/ml)对另一组细胞进行治疗。
采用与示例1-1相同的方法，测定吉西他滨在具有seqidno.1所示氨基酸序列的重组凝集素给定浓度下的ic50值，然后测定具有seqidno.1所示氨基酸序列的重组凝集素在吉西他滨给定浓度下的ic50值。实验中也分别测定了单独使用吉西他滨和具有seqidno.1所示氨基酸序列的重组凝集素的ic50值。用5-fu替换吉西他滨后重复实验步骤。
我们确定了每种药物浓度组合的联合指数(ci)值。ci值是根据通过下列公式计算得出的ci50值来确定的。
其中
da(50)＝联合药物b使用时，产生50％细胞毒性所需的药物a浓度
ica(50)＝单独使用药物a产生50％细胞毒性所需的浓度
db(50)＝联合药物a使用时，产生50％细胞毒性所需的药物b浓度
icb(50)＝单独使用药物b产生50％细胞毒性所需的浓度
其中，药物a为seqidno:1，药物b为受测的其他治疗药物。
协同作用、相加作用或拮抗作用根据以下标准确定：
cl>1-具有拮抗作用
cl＝1-具有相加作用
cl<1-具有协同作用
seqidno:1和吉西他滨以及5-fu的组合对panc-1细胞系的联合指数计算结果见下表。
表3：seqidno:1与吉西他滨联合作用于panc-1细胞系48h后的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对胰腺细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。seqidno:1与吉西他滨联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1浓度为5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml时，吉西他滨浓度为5μm和25μm。
seqidno:1浓度为40μg/ml和80μg/ml时，吉西他滨浓度为1μm、5μm和25μm。
可以看出，吉西他滨浓度为0.01μm、0.1μm和50μm时，seqidno:1所有浓度都表现出拮抗作用。seqidno:1浓度为2.5μg/ml时，吉西他滨所有浓度都表现出拮抗作用。seqidno:1浓度为5μg/ml和10μg/ml以及吉西他滨浓度为1μm时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为20μg/ml以及吉西他滨浓度为1μm时，有相加作用。
表4：seqidno:1与5-fu联合使用时对panc-1细胞系的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对胰腺细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用的一对浓度用下划线标出。可以看出，seqidno:1与5-fu联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1浓度为5μg/ml时，5-fu浓度为1μm-50μm以及250μm。
seqidno:1浓度为10μg/ml-80μg/ml时，5-fu浓度为1μm–250μm。
可以看出，seqidno:1和5-fu浓度较低时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为5μg/ml以及5-fu浓度为100μm时，有相加作用。
从表1至表4的结果可以看出，与吉西他滨和5-氟尿嘧啶联合使用时，seqidno:1表现出协同作用。这些药物组合对抑制癌细胞的生长非常有效。使用的seqidno:1浓度为约2.5μg/ml-约80μg/ml。在本发明中，除seqidno:1以外的其他治疗药物浓度为1μm-约250μm。
示例2：seqidno:1、紫杉醇和卡铂单独给药时对乳腺癌细胞(mda-mb-231细胞系)的细胞毒性作用以及seqidno:1与紫杉醇和卡铂联合给药时对乳腺癌细胞(mda-mb-231细胞系)的协同细胞毒性作用
我们进行了一项研究，以确定seqidno:1与紫杉醇和卡铂等化疗药物联合使用时对乳腺癌细胞系(mda-mb-231)的协同细胞毒性作用。研究分两阶段进行，如示例2-1和示例2-2所述。
示例2-1-测定紫杉醇和卡铂在seqidno:1条件下对mda-mb-231细胞的ic50值
我们进行了一项研究，以确定重组凝集素(以seqidno:1为代表)浓度对紫杉醇对mda-mb-231细胞毒性的ic50值的影响。相反地，我们也确定了紫杉醇浓度对重组凝集素(以seqidno:1为代表)ic50值的影响。
同样地，我们还对联合使用卡铂和具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素进行了研究。
我们使用了与示例1-1中相同的方法进行研究。下列表5和表6给出了ic50测定值。
表5：seqidno:1和紫杉醇单独使用以及联合使用时对mda-mb-231细胞系的ic50值
表6：seqidno:1和卡铂单独使用以及联合使用时对mda-mb-231细胞系的ic50值
表5和表6为seqidno:1单独使用以及与紫杉醇或卡铂联合使用时的ic50值。可以看出，seqidno.1与卡铂或紫杉醇联合使用时，对乳腺癌细胞的ic50值显著降低。
示例2-2-计算紫杉醇和卡铂与seqidno:1联合使用时的ci值
在进一步研究中，我们用紫杉醇(0.001nm–10nm)联合seqidno:1(2.5μg/ml–80μg/ml)对mda-mb-231细胞进行治疗48小时。同样地，我们用卡铂(10μm-1000μm)联合seqidno:1(2.5μg/ml–80μg/ml)对另一组细胞进行治疗。如示例1-2所述，测定每种药物组合的联合指数值，并测定产生的拮抗作用、相加作用或协同作用。结果如下表所示。
表7：seqidno:1与紫杉醇联合使用时对mda-mb-231细胞系的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对乳腺癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。可以看出，seqidno:1与紫杉醇联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1浓度为10μg/ml–80μg/ml时，紫杉醇浓度为1nm–10nm。
seqidno:1浓度为20μg/ml-80μg/ml，紫杉醇浓度为0.1nm。
可以看出，seqidno:1浓度(2.5μg/ml和5μg/ml)和紫杉醇浓度(0.001nm和0.01nm)较低时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为5μg/ml和紫杉醇浓度为5nm和10nm以及seqidno:1浓度为10μg/ml和紫杉醇浓度为0.1nm时，有相加作用。
表8：seqidno:1与卡铂联合使用时对mda-mb-231细胞系的cl值
可以看出，两种组合对乳腺癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。可以看出，seqidno:1与卡铂联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1浓度为2.5μg/ml-80μg/ml时，卡铂浓度为100μm–1000μm。
seqidno:1浓度为5μg/ml-80μg/ml，卡铂浓度为50μm。
可以看出，seqidno:1浓度为2.5μg/ml-20μg/ml和卡铂浓度为10μm时，有拮抗作用。seqidno:1浓度为2.5μg/ml和卡铂浓度为50μm时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为40μg/ml-80μg/ml以及卡铂浓度为10μm时，有相加作用。
从结果可以看出，与紫杉醇或卡铂联合使用时，seqidno:1表现出协同作用。
示例3：seqidno:1、5-fu和顺铂单独给药时对口腔癌细胞(kb细胞系)的细胞毒性作用以及seqidno:1与5-fu和顺铂联合给药时对口腔癌细胞(kb细胞系)的协同细胞毒性作用
我们进行了一项研究，以确定seqidno:1与5-fu和顺铂等化疗药物联合使用时对口腔癌细胞系(kb细胞系)的协同细胞毒性作用。研究分两阶段进行，如示例3-1和示例3-2所述。
示例3-1-测定5-fu和顺铂在seqidno:1条件下对kb细胞的ic50值
我们进行了一项研究，以确定重组凝集素(以seqidno:1为代表)浓度对5-fu对kb细胞毒性的ic50值的影响。相反地，我们也确定了5-fu浓度对重组凝集素(以seqidno:1为代表)ic50值的影响。
同样地，我们还对联合使用顺铂和具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素进行了研究。
我们使用了与示例1-1中相同的方法进行研究。下列表9和表10给出了ic50测定值。
表9：seqidno:1和5-fu单独使用以及联合使用时对kb细胞系的ic50值
表10：seqidno:1和顺铂单独使用以及联合使用时对kb细胞系的ic50值
表9和表10为seqidno:1单独使用以及与5-fu或顺铂联合使用时的ic50值。可以看出，seqidno.1与5-fu和顺铂联合使用时，对口腔癌细胞的ic50值显著降低。
示例3-2-计算5-fu和顺铂与seqidno:1联合使用时的ci值
在进一步研究中，我们用5-fu(0.01μm-5.0μm)联合seqidno:1(5.0μg/ml-90μg/ml)对kb细胞进行治疗48小时。同样地，我们用顺铂(0.1μm-1.5μm)联合seqidno:1(5.0μg/ml-90μg/ml)对另一组细胞进行治疗。如示例1-2所述，测定每种药物组合的联合指数值，并测定产生的拮抗作用、相加作用或协同作用。
结果如下表所示。
表11：seqidno:1与5-fu联合使用时对kb细胞系的cl值
表12：seqidno:1与顺铂联合使用时对kb细胞系的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对kb细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。seqidno:1和5-fu的组合在所有研究浓度(seqidno:1：5.0μg/ml-90μg/ml；5-fu：0.01μm-5μm)下都表现出协同作用。可以看出，seqidno:1和顺铂组合时，以下所有浓度也都表现出协同作用：
seqidno:1浓度为10μg/ml–90μg/ml时，顺铂浓度为0.1μm-1.5μm；seqidno:1浓度为5μg/ml时，顺铂浓度为0.5μm-1.5μm。
可以看出，seqidno:1和顺铂浓度较低时，有拮抗作用。
示例4：seqidno:1、5-fu和伊立替康单独给药时对结肠癌细胞(ht-29细胞系)的细胞毒性作用以及seqidno:1与5-fu和伊立替康联合给药时对结肠癌细胞(ht-29细胞系)的协同细胞毒性作用
我们进行了一项研究，以确定seqidno:1与5-fu和伊立替康等化疗药物联合使用时对结肠癌细胞系(ht-29)的协同细胞毒性作用。研究分两阶段进行，如示例4-1和示例4-2所述。
示例4-1-测定5-fu和伊立替康在seqidno:1条件下对ht-29细胞的ic50值
我们进行了一项研究，以确定重组凝集素(以seqidno:1为代表)浓度对5-fu对ht-29细胞毒性的ic50值的影响。相反地，我们也确定了5-fu浓度对重组凝集素(以seqidno:1为代表)ic50值的影响。
同样地，我们还对联合使用伊立替康和具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素进行了研究。
我们使用了与示例1-1中相同的方法进行研究。下列表13和表14给出了ic50测定值。
表13：seqidno:1和5-fu单独使用以及联合使用时对ht-29细胞系的ic50值
表14：seqidno:1和伊立替康单独使用以及联合使用时对ht-29细胞系的ic50值
表13和表14为seqidno:1单独使用以及与5-fu或伊立替康联合使用时的ic50值。可以看出，seqidno.1与5-fu和伊立替康联合使用时，对结肠癌细胞的ic50值显著降低。
示例4-2-计算5-fu和伊立替康与seqidno:1联合使用时的ci值在进一步研究中，我们用5-fu(5μm-200μm)联合seqidno:1(1μg/ml-80μg/ml)对fit-29细胞进行治疗48小时。同样地，我们用伊立替康(0.1μm-50μm)联合seqidno:1(1μg/ml-80μg/ml)对另一组细胞进行治疗。如示例1-2所述，测定每种药物组合的联合指数值，并测定产生的拮抗作用、相加作用或协同作用。结果如下表所示。
表15：seqidno:1与5-fu联合使用时对fit-29细胞系的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对结肠癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。可以看出，seqidno:1与5-fu联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1浓度为5μg/ml-80μg/ml时，5-fu浓度为10μm-200μm。
seqidno:1浓度为1μg/ml时，5-fu浓度为50μm-200μm。
可以看出，5-fu浓度为5μm时，在seqidno:1所有浓度下都有拮抗作用；seqidno:1浓度为1μg/ml且5-fu浓度为10μm时，也有拮抗作用。
表16：seqidno:1与伊立替康联合使用时对fit-29细胞系的cl值
可以看出，两种组合对结肠癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。seqidno:1与伊立替康联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1浓度为20μg/ml-80μg/ml时，伊立替康浓度为1μm-50μm(5μm除外)。
可以看出，seqidno:1浓度为1μg/ml-80μg/ml和伊立替康浓度为0.1μm时以及seqidno:1浓度为1μg/ml-10μg/ml和伊立替康浓度为0.01-50μm时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为20μg/ml以及伊立替康浓度为5μm时，有相加作用。
示例5：seqidno:1、顺铂和紫杉醇单独给药时对卵巢癌细胞(pa-1细胞系)的细胞毒性作用以及seqidno:1联合顺铂和紫杉醇给药时对卵巢癌细胞(pa-1细胞系)的协同细胞毒性作用
我们进行了一项研究，以确定seqidno:1与顺铂和紫杉醇等化疗药物联合使用时对卵巢癌细胞系(pa-1细胞系)的协同细胞毒性作用。研究分两阶段进行，如示例5-1和示例5-2所述。
示例5-1-测定顺铂和紫杉醇在seqidno:1条件下对pa-1细胞毒性的ic50值
我们进行了一项研究，以确定重组凝集素(以seqidno:1为代表)浓度对顺铂对mda-mb-231细胞毒性的ic50值的影响。相反地，我们也确定了顺铂浓度对重组凝集素(以seqidno:1为代表)ic50值的影响。
同样地，我们还对联合使用紫杉醇和具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素进行了研究。
我们使用了与示例1-1中相同的方法进行研究。下列表17和表18给出了ic50测定值。
表17：seqidno:1和顺铂单独使用以及联合使用时对pa-1细胞系的ic50值
表18：seqidno:1和紫杉醇单独使用以及联合使用时对pa-1细胞系的ic50值
表17和表18为seqidno:1单独使用以及与顺铂或紫杉醇联合使用时的ic50值。可以看出，seqidno.1与顺铂或紫杉醇联合使用时，对卵巢癌细胞的ic50值显著降低。
示例5-2-计算顺铂和紫杉醇与seqidno:1联合使用时的ci值
在进一步研究中，我们用顺铂(0.01μm-5μm)联合seqidno:1(1μg/ml-20μg/ml))对pa-1细胞进行治疗48小时。同样地，我们用紫杉醇(0.01nm-5nm)联合seqidno:1(1μg/ml-20μg/ml)对另一组细胞进行处理。如示例1-2所述，测定每种药物组合的联合指数值，并测定产生的拮抗作用、相加作用或协同作用。结果如下表所示。
表19：seqidno:1与顺铂联合使用时对pa-1细胞系的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对卵巢癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。可以看出，seqidno:1与顺铂联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1为所有测试浓度(1μg/ml–20μg/ml)，顺铂浓度为0.25μm–5μm。
seqidno:1浓度为5μg/ml–20μg/ml，顺铂浓度为0.1μm。
seqidno:1浓度为10μg/ml-20μg/ml，顺铂浓度为0.01μm。
可以看出，seqidno:1浓度为1μg/ml-5μg/ml和顺铂浓度为0.01μm时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为1μg/ml和顺铂浓度为0.1μm时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为2.5μg/ml以及顺铂浓度为0.1μm时，有相加作用。
表20：seqidno:1与紫杉醇联合使用时对pa-1细胞系的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对卵巢癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。可以看出，seqidno:1与紫杉醇联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1为所有测试浓度(1μg/ml-20μg/ml)，紫杉醇浓度为0.25nm-5nm。
可以看出，seqidno:1浓度为1μg/ml-15μg/ml和紫杉醇浓度为0.01nm-0.1nm时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为20μm以及紫杉醇浓度为0.01nm-0.1nm时，有相加作用。
从结果可以看出，与顺铂或紫杉醇联合使用时，seqidno:1表现出协同作用。
示例6：seqidno:1、顺铂和吉西他滨单独给药时对膀胱癌细胞(t24细胞系)的细胞毒性作用以及seqidno:1联合顺铂和吉西他滨给药时对膀胱癌细胞(t24细胞系)的协同细胞毒性作用
我们进行了一项研究，以确定seqidno:1与顺铂和吉西他滨等化疗药物联合使用时对膀胱癌细胞系(t24细胞系)的协同细胞毒性作用。研究分两阶段进行，如示例6-1和示例6-2所述。
示例6-1-测定顺铂和吉西他滨在seqidno:1条件下对t24细胞的ic50值
我们进行了一项研究，以确定重组凝集素(以seqidno:1为代表)浓度对顺铂对t24细胞毒性的ic50值的影响。相反地，我们也确定了顺铂浓度对重组凝集素(以seqidno:1为代表)ic50值的影响。
同样地，我们还对联合使用吉西他滨和具有seqidno:1所示氨基酸序列的重组凝集素进行了研究。
我们使用了与示例1-1中相同的方法进行研究。下列表21和表22给出了ic50测定值。
表21：seqidno:1和顺铂单独使用以及联合使用时对t24细胞系的ic50值
表22：seqidno:1和吉西他滨单独使用以及联合使用时对t24细胞系的ic50值
表21和表22为seqidno:1单独使用以及与顺铂和吉西他滨联合使用时的ic50值。可以看出，seqidno.1与顺铂和吉西他滨联合使用时，对膀胱癌细胞的ic50值显著降低。
示例6-2-计算顺铂和吉西他滨与seqidno:1联合使用时的ci值
在进一步研究中，我们用顺铂(1μm-500μm)联合seqidno:1(2.5μg/ml-80μg/ml)对t24细胞进行治疗48小时。同样地，我们用吉西他滨(1μm-300μm)联合seqidno:1(2.5μg/ml-80μg/ml)对另一组细胞进行治疗。如示例1-2所述，测定每种药物组合的联合指数值，并测定产生的拮抗作用、相加作用或协同作用。结果如下表所示。
表23：seqidno:1与顺铂联合使用时对t24细胞系的cl值
可以看出，本发明中的两种组合对膀胱癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。可以看出，seqidno:1与顺铂联合使用时，产生协同细胞毒性作用的seqidno:1有效浓度如下：
seqidno:1浓度为5μg/ml–80μg/ml时，顺铂为所有测试浓度(1μm-500μm)。
可以看出，seqidno:1浓度为2.5μm和顺铂浓度为1μm和10μm时，有拮抗作用。
可以看出，seqidno:1浓度为2.5μg/ml以及顺铂浓度为25μm-500μm时，有相加作用。
表24：seqidno:1与吉西他滨联合使用时对t24细胞系的cl值
可以看出，两种组合对膀胱癌细胞系具有协同作用，如上表所示。产生协同作用(即cl<1)的一对浓度用下划线标出。seqidno:1与吉西他滨联合使用时，可以看出，seqidno:1为所有浓度(2.5μm-80μm)以及吉西他滨浓度为1μm-300μm时有协同细胞毒性作用。
示例汇总
在本发明测试的细胞系中观察到协同作用的浓度见下表：
表25seqidno:1与不同治疗药物联合使用时对口腔、结肠、卵巢和膀胱癌细胞显示出协同作用的的浓度。
sequencelisting
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<211>141
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