用于治疗糖尿病的方法和组合物以及用于富集编码分泌蛋白的mRNA的方法

用于治疗糖尿病的方法和组合物以及用于富集编码分泌蛋白的mrna的方法1.相关申请的交叉引用2.本申请要求2018年9月21日提交的美国临时申请第62/734,981号的权益。以上标识的申请的整个教示内容通过引用并入本文。3.政府资助4.本发明在由美国国家科学基金会授予的资助号2014182349的政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
：：5.根据世界卫生组织的数据，全世界有超过4.22亿人患有糖尿病。内分泌学会估计，到2021年，单独在美国，糖尿病的费用负担就将达到5120亿美元。用以治疗糖尿病患者的当前策略包括胰岛素注射、加强内源性胰岛素分泌、增加葡萄糖吸收、或增加葡萄糖排泄。6.糖尿病是一种由多种病因因素引起的疾病，并且特征在于空腹状态下血浆葡萄糖水平升高(高血糖症)。糖尿病有两种主要形式：(1)胰岛素依赖性或1型糖尿病(也称为青少年糖尿病)和(2)非胰岛素依赖性或ii型糖尿病(也称为niddm)。7.1型糖尿病由胰岛素缺乏引起，所述胰岛素缺乏由胰腺β细胞的丧失所致，所述丧失通常是由于朗格汉斯岛受到自体免疫破坏。因此，在罹患1型糖尿病的患者中，由胰岛细胞产生的胰岛素的量过低，从而导致血糖水平升高(高血糖症)。患有1型糖尿病的患者通常需要终生胰岛素治疗，但即使频繁每日注射胰岛素，也难以充分控制血糖水平。8.在2型糖尿病患者中，肝细胞和肌肉细胞丧失了它们对正常血液胰岛素水平起应答的正常能力(胰岛素抵抗)，从而导致高血糖水平。另外，ii型糖尿病患者展现β细胞功能受损和β细胞凋亡增加，从而导致β细胞总量随时间而降低。最终，变得必须在2型糖尿病患者中施用外源性胰岛素。9.用于治疗糖尿病的常规方法已包括在1型糖尿病的情况下施用液体和胰岛素，以及在ii型糖尿病的情况下施用各种降血糖药剂。不幸的是，许多已知降血糖药剂展现不合需要的副作用和毒性。因此，对于1型糖尿病与2型糖尿病两者，均需要新治疗形式。技术实现要素：10.本文公开了一种增加血糖清除的先前未表征的基因和基因产物。惊人地以及出乎意料地，这种基因产物(c1orf127基因产物)不依赖于胰岛素来降低血糖，并且不导致低血糖症。11.据预测，c1orf127基因编码分子量是73kda的具有684个氨基酸的蛋白质。它是一种仅存在于脊椎动物中的高度保守蛋白质。所预测序列缺乏用于分泌或膜插入的典型信号。c1orf127具有在脊椎动物中高度保守的具有215个氨基酸的n末端结构域。在这个结构域内有两个预测糖基化位点、一个预测磷酸化位点、五个保守半胱氨酸残基、以及推定内肽酶裂解位点(激素原转化酶2样，pc2)。因此，如同其他葡萄糖调控激素一样，c1orf127基因产物可被加工成迄今为止未鉴定的具有葡萄糖降低活性的较小蛋白质片段。半胱氨酸可参与蛋白质折叠或多聚化。12.对基因产物和它的活性的鉴定提供了一种用于治疗糖尿病和涉及血糖清除的其他疾病的新方法，还提供了一种了解涉及血糖清除的疾病的原因和影响的新途径。本文还描述了一种用于富集转录分泌蛋白和膜结合蛋白的mrna的方法。13.本公开的一些方面涉及一种治疗或预防对象中与血糖水平升高相关的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的增加c1orf127基因产物(在本文中有时也被称为erseq08)的水平或活性的药剂。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的水平或活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的表达。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的分泌。在一些实施方案中，药剂是c1orf127基因产物激动剂。14.在一些实施方案中，药剂包含小分子、蛋白质或核酸。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个不同翻译后修饰的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有不同活性或活性水平的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含c1orf127基因产物的功能性部分。在一些实施方案中，药剂包含含有弗林蛋白酶裂解位点的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含不具有pc2裂解位点的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含具有弗林蛋白酶裂解位点而不具有pc2裂解位点的c1orf127基因产物。15.在一些实施方案中，药剂还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，方法还包括施用额外抗糖尿病治疗剂。16.在一些实施方案中，药剂是表达c1orf127基因产物的细胞。在一些实施方案中，细胞是胰岛细胞或β‑细胞。在一些实施方案中，对于需要治疗的对象来说，细胞是自体的。在一些实施方案中，细胞是干细胞源性的。在一些实施方案中，干细胞源性细胞是干细胞源性β细胞。在一些实施方案中，细胞被包裹在微囊或半透膜中。17.在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂改善血糖清除。在一些实施方案中，药剂的血糖清除性质不依赖于胰岛素活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂不导致低血糖症。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂具有葡萄糖敏化剂活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加葡萄糖转换速率。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖酵解。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖原合成速率。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂具有升糖素样活性。18.在一些实施方案中，对象患有糖尿病。在一些实施方案中，对象是人或鼠。19.在一些实施方案中，药剂包含seqidno:2的c1orf127蛋白或其功能性部分或功能性变体。在一些实施方案中，药剂包含编码c1orf127基因产物、其功能性部分或功能性变体的核酸分子，并且其中所述核酸包含seqidno:1或其一部分的序列。在一些实施方案中，药剂包含编码c1orf127基因产物、其功能性部分或功能性变体的核酸，并且所述核酸包含与seqidno:1或其一部分具有至少90％同源性的序列。20.在一些实施方案中，药剂的施用修正对象中导致c1orf127基因产物的异常表达或活性的遗传缺陷。21.本公开的一些方面涉及一种当施用至对象时，增加c1orf127基因产物的水平或活性的药剂。22.在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的水平或活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的表达。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的分泌。23.在一些实施方案中，药剂包含小分子、蛋白质或核酸。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个不同翻译后修饰的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有不同活性或活性水平的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含c1orf127基因产物的功能性部分。24.在一些实施方案中，药剂还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，方法还包括施用额外抗糖尿病治疗剂。25.在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂改善血糖清除。在一些实施方案中，药剂的血糖清除性质不依赖于胰岛素活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂不导致低血糖症。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂具有葡萄糖敏化剂活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加葡萄糖转换速率。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖酵解。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖原合成速率。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂具有升糖素样活性。26.在一些实施方案中，对象患有糖尿病。在一些实施方案中，对象是人或鼠。27.在一些实施方案中，药剂包含seqidno:2的c1orf127蛋白或其功能性部分或功能性变体。在一些实施方案中，药剂包含编码c1orf127基因产物、其功能性部分或功能性变体的核酸，并且其中所述核酸包含seqidno:1或其一部分的序列。在一些实施方案中，药剂包含编码c1orf127基因产物、其功能性部分或功能性变体的核酸，并且所述核酸包含与seqidno:1或其一部分具有至少90％同源性的序列。28.本公开的一些方面涉及一种诊断测试个体中的c1orf127相关病症或发展出c1orf127相关病症的风险增加的方法，所述方法包括测定从所述测试个体获得的样品中的c1orf127基因产物水平，其中相较于正常个体中的c1orf127基因产物水平，所述测试个体中的c1orf127基因产物水平增加或降低指示c1orf127相关病症。在一些实施方案中，检测血液样品中的c1orf127基因产物水平。在一些实施方案中，用抗体检测c1orf127基因产物。在一些实施方案中，c1orf127相关病症是糖尿病。29.本公开的一些方面涉及一种诊断测试个体中的c1orf127相关病症或发展出c1orf127相关病症的风险增加的方法，所述方法包括筛查所述测试个体在c1orf127中的突变。在一些实施方案中，c1orf127相关病症是糖尿病。30.本公开的一些方面涉及一种筛选c1orf127基因产物受体激动剂的方法，所述方法包括使对c1orf127基因产物起应答的细胞与测试剂接触，以及测量细胞应答，其中如果所述细胞起应答，那么将所述测试剂鉴定为c1orf127基因产物受体激动剂。在一些实施方案中，细胞应答是葡萄糖摄取。在一些实施方案中，还使细胞与胰岛素受体拮抗剂接触。31.本公开的一些方面涉及一种富集编码分泌蛋白和膜结合蛋白的mrna的方法，所述方法包括：a)提供包含内质网(er)易位子的细胞，所述易位子包含标记，b)对所述细胞进行亚细胞分级分离并且分离含有所述标记的er级分，以及c)分离和测序含有所述标记的经分离er级分中含有的mrna。在一些实施方案中，er易位子组分sec61b包含标记。在一些实施方案中，标记是荧光标记。在一些实施方案中，b)包括使细胞与蛋白质合成抑制剂接触，使细胞质膜溶解，以及使er免疫沉淀。在一些实施方案中，用对标记具有特异性的抗体使er免疫沉淀。在一些实施方案中，蛋白质合成抑制剂是环己酰胺。在一些实施方案中，用逐步浓度的清洁剂来溶解细胞质膜(或细胞质膜继之er膜)。在一些实施方案中，清洁剂是毛地黄皂苷、ddm、或两者。在一些实施方案中，通过下一代测序来对mrna测序。32.在一些实施方案中，细胞是β‑细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导干细胞，或从诱导干细胞分化。在一些实施方案中，细胞是患病细胞或展现异常状态。在一些实施方案中，当与蛋白质合成抑制剂接触时，细胞正经受应激应答。在一些实施方案中，当与蛋白质合成抑制剂接触时，细胞正对刺激起应答。33.在一些实施方案中，方法还包括对对照细胞进行如本文所述的富集编码分泌蛋白和膜结合蛋白的mrna的方法，以及将从细胞分离的mrna与从所述对照细胞分离的mrna进行比较。34.本发明的一些方面涉及能够表达经标记sec61b蛋白的非人动物。在一些实施方案中，经标记蛋白的表达是诱导型的。在一些实施方案中，经标记蛋白具有cre依赖性表达。在一些实施方案中，非人动物在β‑细胞中具有经标记sec16b蛋白的诱导型表达。标记不受限制，并且可为本领域中的任何适合标记。在一些实施方案中，标记是荧光蛋白。在一些实施方案中，标记是绿色荧光蛋白(gfp)。在一些实施方案中，非人动物是小鼠或大鼠。在一些实施方案中，非人动物是糖尿病模型(例如nod1型糖尿病模型、1型糖尿病模型)。附图说明35.通过结合附图参考以下具体实施方式，将更充分了解本发明的这些特征和其他特征。本专利或申请文件含有至少一个以彩色制作的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。36.图1a至图1b显示c1orf127不依赖于胰岛素作用来改善葡萄糖清除。在流体动力学尾部静脉注射(htv)之后第三天进行葡萄糖耐量测试(gtt‑2.0mg/dl葡萄糖团注)。图1a：在htv注射之后第3天在icr远交小鼠中进行的gtt证明，相比于对照，c1orf127可更快地从循环清除葡萄糖。图1b：在htv注射之后第3天在用胰岛素受体拮抗剂s961给药的c57bl6动物中进行的gtt。应注意，相对于a，b中血糖水平升高，并且相对于对照，经c1orf127处理动物中的血糖水平在60分钟时开始强力降低。在未显示的实验中，由c1orf127介导的葡萄糖降低早在葡萄糖注射后15分钟就开始了。37.图2a至图2c显示表达gfp‑sec61β的hpsc细胞系的产生。图2a：gfp标签被工程改造至sec61β的胞质结构域中以有助于分离在er膜处的核糖体/易位子复合物。图2b：用于talen介导的将caags::gfp‑sec61β转基因敲入至aavs1基因座中的策略，以及gfp在hpsc中的核周表达。图2c：用于crispr介导的将gfp‑sec61β敲入至胰岛素基因的末个外显子中的策略。图2b至图2c的底部图显示使用这个细胞系分化的sc‑β细胞中的gfp表达。38.图3a至图3d显示er‑seq富集易位子复合物和相关核糖体的组分。图3a：用于逐步分离胞质、er和核组分的连续生物化学分级分离方法。对er级分进行对核糖体/易位子复合物和相关rna的免疫纯化。图3b：在生物化学分级分离之后在多个亚细胞级分中的sec61β、gfp和核糖体蛋白l13a的western印迹。图3c：18s和28s核糖体rna亚单位的rna胶和鉴定。图3d：基于蛋白质组学的对与易位子复合物相关的蛋白质的鉴定。列出了uniprot登录标识符、全长蛋白质的肽覆盖度、以及鉴定的肽的数目。t：总体；cy：胞质级分；nu：核级分；un：在免疫沉淀之后的未结合er级分；ip：免疫纯化er级分。39.图4a至图4c显示自我更新人胚胎干细胞中编码er相关过程中涉及的因子的mrna的选择性富集。图4a：在ip和未分级分离细胞提取物中检测到的基因的对数归一化微阵列信号强度的散点图。每个点代表一个基因。差异性表达的基因以淡灰色着色。标记了候选分泌或易位子相关因子，并且以红色着色。图4b：ip富集基因的预测亚细胞定位的饼形图。图4c：ip富集基因的最重要的基因本体术语。40.图5a至图5f显示er‑seq富集在sc‑β细胞中表达的分泌因子的mrna。图5a：在胰岛素表达性β细胞中表达gfp‑sec61β的转基因hpsc细胞系的图解。图5b：用于使用ins::gfp‑sec61β细胞系来产生sc‑β细胞的定向分化方案。图5c：在ip和总体未分级分离rna中检测到的基因的log10归一化表达的散点图。标记了候选基因，并且以红色着色。差异性表达的基因以淡灰色着色。图5d：ip富集基因(相对于总体，倍数变化>2)的预测定位的饼形图。图5e：相对于总体未分级分离rna，被预测是分泌蛋白质组或胞质性/核性(cytonuc)部分的基因的log2富集。显示了相对于总体rna，ip表达的富集。图5f：ip富集基因的最重要的基因本体术语。41.图6a至图6g显示易位子相关mrna的阶段特异性表达样式。图6a：sc‑β细胞的定向分化方案以及使用hpsc细胞系中的每一者所处的相关阶段的图解。图6b：在多个分化阶段通过er‑seq鉴定的差异性表达基因的热图。图6c至图6d：对在sc‑β细胞中优先表达的基因的基因本体分析以及生物过程(图6c)和细胞组分(图6d)的最重要术语。图6e‑图6f：在所有分化阶段显示β细胞特异性表达样式的内分泌特异性(图6e)和未注释(图6f)基因的热图。图6g：sc‑β细胞中具有未知功能的基因的热图。42.图7a至图7e显示对c1orf127作为葡萄糖降低活性物的鉴定。图7a：来自流体动力学尾部静脉注射筛选的结果。图7b：空腹血糖水平低于55mg/dl的动物被从进一步分析移除。图7c：相比于测试的其他活性物，c1orf127(红线)更快地从循环清除葡萄糖。图7d：出于明晰目的，所有其他处理被平均化，并且以灰色显示。胰岛素htv注射动物(紫色)充当阳性对照，并且也显示鲁棒的葡萄糖降低活性。图7e：对葡萄糖降低作用的定量显示差异是统计显著的。43.图8a至图8b显示c1orf127在脊椎动物之中是充分保守的。图8a：蛋白质比对揭示这种蛋白质在进化期间具有高度保守性。图8b：人c1orf127与它的小鼠直系同源物gm572的比对。红色棒条，用于产生c1orf127抗体的肽区域，所述抗体用于免疫荧光分析和western印迹(可商购获得的抗体)。c1orf127是一种缺乏信号肽的高度保守73kda蛋白质。c1orf127在sc‑β细胞和来自内分泌谱系的初期的发育小鼠胰腺中表达。c1orf127还在成年人和小鼠β‑细胞中表达。44.图9a至图9b显示c1orf127基因表达。图9a：在人尸体胰岛中，c1orf127主要在β‑细胞中表达。图9b：在sc‑β中，c1orf127主要由在较晚分化阶段的sc‑β细胞表达。45.图10a至图10b显示c1orf127基因表达。图10a：在sc‑β分化方案的晚期阶段的t‑sne投影。c1orf127由sc‑β细胞、sc‑肠嗜铬细胞以及在内分泌祖细胞中共表达。图10b：c1orf127的小鼠直系同源物gm572由内分泌祖细胞表达。46.图11显示c1orf127基因表达。对来自人尸体胰岛的公开单细胞rna测序数据的分析显示c1orf127主要由β‑细胞表达，但它还由生长激素抑制素表达性细胞表达。t‑sne图。47.图12显示c1orf127的免疫荧光和western印迹分析。上部，使用可商购获得的针对c1orf127的抗体获得的免疫荧光，显示c1orf127由来自人尸体的胰岛中的β‑细胞表达。应注意，与胰岛素染色高度共定位，并且不存在于升糖素表达性细胞中。下部，western印迹，来自sc‑β细胞的提取物在c1orf127的预测分子量处显示c1orf127。48.图13a至图13b显示表达c1orf127的其他人组织。图13a：来自gtex联盟的基因表达分析显示在小脑和肌肉中表达。图13b通过免疫荧光染色确认了两个表达部位。c1orf127与层粘连蛋白在肌肉中共定位以及与tuj1在小脑中共定位。49.图14显示s961模型验证。急性施用胰岛素受体拮抗剂s961足以致使小鼠血糖增高。改变自schafferl.等人，biochemicalandbiophysicalresearchcommunications，2008。50.图15显示c1orf127不依赖于胰岛素作用来降低血糖。在葡萄糖注射之前2小时、与葡萄糖一起、以及在葡萄糖注射之后45分钟注射s961。即使在s961存在下，c1orf127也清除了血糖。1.5mg/dl葡萄糖团注。51.图16显示c1orf127不依赖于胰岛素作用来改善葡萄糖清除，如通过er‑seq08在链脲佐菌素(stz)诱导的糖尿病模型中的作用所显示。通过施用stz来致使小鼠患上糖尿病(应注意，在流体动力学尾部静脉注射hti之前患有高血糖症)。相较于对照，过度表达c1orf127的糖尿病小鼠在血糖水平方面显著降低。52.图17显示在2型糖尿病的高脂肪膳食肥胖症模型中，c1orf127可降低血糖。dio‑膳食诱导的肥胖症小鼠。f‑ins‑用f‑ins‑具有弗林蛋白酶裂解位点的胰岛素转染的dio小鼠。胰岛素由肝排泄。53.图18a至图18c显示er‑seq08改善葡萄糖清除，并且不导致低血糖症。图18a：在htv注射之后第3天在icr远交小鼠中进行的gtt证明，相比于对照，er‑seq08可更快地从循环清除葡萄糖。所有时间点都是显著不同的。图18b：来自a的曲线下面积测量结果，所述测量结果证明，相对于对照，经er‑seq08注射的小鼠中的葡萄糖清除得以显著改善。图18c：在16小时禁食之前和之后，经er‑seq08注射的动物中的血糖水平，应注意，相对于对照，在血糖水平方面不存在显著变化。54.图19a至图19b显示c1orf127具有肽激素的一级结构特征。图19a：c1orf127一级结构，其中紫色棒条：功能未知的进化保守结构域；pc2位点：推定内肽酶裂解位点‑通常存在于肽激素(即胰岛素、升糖素和胰淀素)中；红色棒条：针对以红色表示的区域产生的定制兔多克隆抗体识别全长蛋白质(73kda)和约57kda的蛋白质。这个57kda种类与假定pc2裂解位点相关联。图19b：是western印迹：总蛋白质提取物由来自非糖尿病(nd)和2型糖尿病(t2d)患者的人尸体胰岛制得。抗体特异性通过与用于使兔免疫的肽的竞争来确定。尽管预期c1orf127的葡萄糖降低活性存在于功能未知的保守结构域(紫色框)中，但活性可存在于其余部分(57kda区域)上。c1orf127还由朗格汉斯岛中的δ和γ细胞表达，并且在肌肉和小脑中表达。尽管推测c1orf127的葡萄糖降低活性为β‑细胞所特有，但其他c1orf127表达储库也可能具有葡萄糖调节活性。55.图20显示用胰岛素抗体或c1orf127抗体对成年小鼠切片的免疫荧光染色。出乎我们的意料的是，c1orf127似乎由不表达胰岛素的囊泡表达。应注意，在630x插图中缺乏重叠。此时，我们不能排除c1orf127还可能在一些含有胰岛素的囊泡中表达。这表明c1orf127从β‑细胞的分泌可不依赖于胰岛素的分泌而受调节，并且可导致发现专门促进c1orf127分泌的一类新药物。56.图21显示c1orf127(即erseq08)是β‑细胞消除的小鼠中葡萄糖体内平衡的强力调节物。链脲佐菌素(stz)诱导的糖尿病是1型糖尿病的一种常见小鼠模型。当不限量喂食(fed)时，所有动物都是糖尿病性的。在过夜禁食之后，血糖水平下降。随后注射葡萄糖。相比于对照动物(用红色荧光蛋白注射)，c1orf127能够更快地从循环清除葡萄糖。惊人地，c1orf127的作用致使动物进入血糖量正常范围。这些结果表明c1orf127不依赖于胰岛素作用来起效。结果还表明c1orf127具有升糖素样活性。57.图22显示表达c1orf127的肿瘤不依赖于胰岛素作用来抑制高血糖症。将表达c1orf127(erseq80)或对照荧光蛋白(tdtomato)的稳定转染hepg2细胞系植入在scid/米色小鼠的肾囊下，并且使肿瘤生长一个月。在四小时禁食之后，在胰岛素受体(ins‑r)拮抗剂s961存在下进行葡萄糖耐量测试。应注意，对照小鼠在实验期间快速变为并保持高血糖。c1orf127抑制这个高血糖偏移。58.图23显示hepg2细胞表达c1orf127蛋白。可商购获得的c末端抗体用于对来自表达c1orf127或对照的稳定转染hepg2细胞的提取物进行免疫印迹分析。容易地检测到了预期约73kda产物。59.图24显示用针对识别c1orf127的肽片段(以上示意图中的红色棒条)产生的兔多克隆抗体获得的免疫印迹。在健康胰岛与2型糖尿病胰岛两者的情况下均观察到约34kda的特异性蛋白质条带，并且当使抗体与封闭肽一起孵育时，所述条带消失。显示持家蛋白粘着斑蛋白以用于比较。这与rna表达数据一致。2型糖尿病胰岛似乎具有更多c1orf127。兔多克隆抗体针对c1orf127的保守结构域中位于n末端与pc2裂解位点之间的部分产生。60.图25a至图25c显示绿色er小鼠报告体。图25a：用于mes靶向的构建体。将mes阳性克隆用cre病毒感染以显示loxp盒的切除以及对er的标记。图25b：来自与遍在性报告体杂交的绿色er小鼠的尾部顶端纤维母细胞。应注意，er染色是典型的。图25c：β‑细胞绿色er小鼠显示在胰岛素产生性细胞中的组织特异性重组以及适当亚细胞定位。61.图26显示在htvi之后的用gfp转导的小鼠肝。62.图27a至图27b显示在消除模型中，c1orf127不依赖于胰岛素作用来降低血糖。图27a：用c1orf127进行尾部静脉注射的经链脲佐菌素(stz)加以消除处理的动物中的血糖水平。将这些动物禁食过夜，并且施用以葡萄糖，接着监测它们的血糖水平。这个较大群组显示与先前相同的葡萄糖清除表型。图27b：八周后，将同一群组再次用c1orf127(erseq08)或tdtomato进行尾部静脉注射。三天后，将这些小鼠禁食过夜，并且在葡萄糖注射之前2小时以及在葡萄糖注射时用s961处理。监测它们的血糖水平。尽管足以在小鼠中导致重度糖尿病，但链脲佐菌素消除保留了胰岛素产生性β‑细胞的小型群体。s961胰岛素拮抗剂对经消除处理的动物的处理显示残余胰岛素不导致葡萄糖清除表型。注意：两个实验均利用最大读数是750mg/dl而非先前600mg/dl最大值的血糖仪。具体实施方式63.本文所述的本发明的实施方案产生于一种富集与内质网相关并因此可能编码分泌蛋白的mrna的新型方法。当对β‑细胞进行这个方法时，分离了先前未表征的mrna。当在小鼠中表达编码这个mrna的基因产物(c1orf127基因产物)的核酸序列时，小鼠具有不依赖于胰岛素的改善的血糖清除。因此，c1orf127基因产物提供了一种用于治疗涉及血糖清除的疾病和疾患诸如糖尿病的新方法。64.治疗或预防与血糖水平升高相关的病症的方法65.本公开的一些方面涉及一种治疗或预防对象中的与血糖水平升高相关的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的调节c1orf127基因产物的水平或活性的药剂。66.如本文所用，与血糖水平升高相关的病症是其中对象具有升高的血糖水平的任何病症。在一些实施方案中，病症是糖尿病(例如i型糖尿病或ii型糖尿病)、代谢综合征、葡萄糖不耐受、或肥胖症。67.如本文所用，“对象”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拔鼠、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括母牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种例如家猫，犬科物种例如狗、狐狸、狼，鸟类物种例如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或对象包括前述各者的任何子组，例如以上全部，但排除一个或多个群组或物种诸如人、灵长类动物或啮齿动物。在某些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”、“个体”和“对象”在本文中可互换使用。优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或母牛，但不限于这些实例。可有利地使用除人以外的哺乳动物，例如作为代表例如糖尿病的动物模型的对象。此外，本文所述的方法可用于治疗驯化动物和/或宠物。对象可为雄性或雌性。68.对象可为以下对象：所述对象先前已被诊断有或鉴定为罹患或患有需要治疗的疾患(例如糖尿病)或一种或多种与此种疾患相关的并发症，并且任选地，但无需已经受针对疾患或一种或多种与所述疾患相关的并发症的治疗。或者，对象还可为先前尚未被诊断为患有需要治疗的疾患或一种或多种与此种疾患相关的并发症者。更确切来说，对象可包括展现疾患或一种或多种与疾患相关的并发症的一种或多种风险因素者。就特定疾患来说“需要治疗的对象”可为患有那个疾患，被诊断为患有那种疾患，或相对于给定参考群体，处于发展出那种疾患的风险增加的情况下的对象。69.如本文所用的术语“药剂”意指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“药剂”可为任何化学物质、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的蛋白质实体和非蛋白质实体。在一些实施方案中，药剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、dna酶、糖蛋白、sirna、脂蛋白、适体、以及它们的修饰形式和组合等。在一些实施方案中，药剂选自由核酸、小分子、多肽和肽组成的组。在某些实施方案中，药剂是具有化学部分的小分子。举例来说，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯(macrolide)、来普霉素(leptomycin)、以及它们的相关天然产物或类似物。可已知化合物具有所需活性和/或性质，或化合物可选自不同化合物的文库。[0070]“小分子”定义为分子量小于10kd，通常是小于2kd，并且优选是小于1kd的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含有无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物、以及抗体模拟物。作为治疗剂，相比于大分子，小分子可更容易穿透细胞，更不易经受降解，并且更不易于引发免疫应答。[0071]如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”用于指定一系列通过相邻残基的α‑氨基与羧基之间的肽键来彼此连接的氨基酸残基。术语“多肽”是指包括经修饰氨基酸(例如磷酸化、糖化、糖基化等)的蛋白质氨基酸和氨基酸类似物的聚合物，无论它的大小或功能如何。术语“肽”经常用于指小型多肽，但在本领域中，这个术语的用法与“蛋白质”或“多肽”重叠。示例性多肽包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其他等同物、以及前述各物的天然存在的和非天然存在的变体、片段和类似物。[0072]术语“核酸”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且应被理解为包括双链多核苷酸、单链(诸如有义或反义)多核苷酸、以及部分双链多核苷酸。核酸经常包含通常见于天然存在的dna或rna中的通过磷酸二酯键来接合的标准核苷酸(其可包括修饰，诸如甲基化核苷碱基)。在一些实施方案中，核酸可包含一个或多个非标准核苷酸，在各种实施方案中，所述非标准核苷酸可为天然存在的或非天然存在的(即人工的；不见于自然界中)，并且/或者所述非标准核苷酸可含有经修饰糖或经修饰骨架键联。核酸修饰(例如碱基、糖和/或骨架修饰)、非标准核苷酸或核苷等，诸如本领域中公认为可出于研究或治疗目的而用于rna干扰(rnai)、适体、crispr技术、多肽产生、重新编程或基于反义序列的分子的情形下的那些，可并入各种实施方案中。此类修饰可例如增加稳定性(例如通过降低对由核酸酶达成的裂解的敏感性)，降低体内清除，增加细胞摄取，或赋予改善翻译、效能、功效、特异性或另外致使核酸更适于预期用途的其他性质。核酸修饰的各种非限制性实例描述于例如deleaveygf等人，sirna的化学修饰(chemicalmodificationofsirna)curr.protoc.nucleicacidchem.2009；39:16.3.1‑16.3.22；crooke,st(编)《反义药物技术：原则、策略和应用(antisensedrugtechnology:principles,strategies,andapplications)》，布卡拉顿：crc出版社，2008；kurreck,j.(编)《治疗性寡核苷酸(therapeuticoligonucleotides)》，rscbiomolecularsciences.剑桥：英国皇家化学学会，2008；美国专利第4,469,863；5,536,821；5,541,306；5,637,683；5,637,684；5,700,922；5,717,083；5,719,262；5,739,308；5,773,601；5,886,165；5,929,226；5,977,296；6,140,482；6,455,308号中，以及/或者pct申请公布wo00/56746和wo01/14398中。在双链核酸的两个链中可使用不同修饰。核酸可均一地或仅在其一部分上加以修饰，并且/或者可含有多个不同修饰。当核酸或核酸区域的长度以核苷酸(nt)的数目给出时，应了解，除非有另外指示，否则所述数目是指单链核酸中或双链核酸的每个链中核苷酸的数目。“寡核苷酸”是相对较短的核酸，长度通常在约5与约100nt之间。[0073]术语“调节c1orf127基因产物水平或活性”是指上调(活化或增加活性)或下调(抑制)基因产物(例如c1orf127蛋白)水平、活性或功能。在一个实施方案中，调节通过直接增加或抑制基因产物的活性，即通过与所述基因产物的直接物理相互作用来发生。在一个实施方案中，间接调节基因产物的活性，例如在信号传导的情况下，通过活化或抑制基因产物活性的上游效应物。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的水平或活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的表达。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的分泌。在一些实施方案中，药剂是内源性c1orf127基因产物的激动剂。[0074]术语“减少”、“降低”和“抑制”在本文中全都通常用于意指相对于参考，减少某一统计显著量。然而，为避免疑问，“降低”或“减少”或“抑制”通常意指相较于参考水平，减少至少10％，并且可包括例如相较于参考水平，减少至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％，直至并且包括例如完全不存在给定实体或参数，或相较于不存在给定治疗，在10‑99％之间的任何减少。[0075]术语“增加”或“增强”或“活化”在本文中全都用于通常意指增加某一统计显著量；为避免任何疑问，术语“增加”或“增强”或“活化”意指相较于参考水平，增加至少10％，例如相较于参考水平，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或直至并且包括100％增加，或在10‑100％之间的任何增加，或相较于参考水平，增加至至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或增加至2倍与10倍之间的任何倍数，或增加至大于10倍。[0076]如本文所用，“治疗”在关于疾病、病症或医学状况使用时是指针对疾患的治疗性治疗，其中目标在于逆转、缓和、改善、抑制、减缓或停止症状或疾患的进展或严重性。术语“治疗”包括减轻或缓和疾患的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志被减轻，那么治疗是大体上“有效的”。或者，如果疾患的进展被降低或停止，那么治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志的改善，而且还包括停止或至少减缓症状的预期将在不存在治疗下发生的进展或恶化。[0077]本文所述的方法可导致减轻病症的一种或多种症状的严重性，或缓和病症的一种或多种症状。糖尿病的症状包括例如空腹血糖水平升高，血压处于或高于140/90mm/hg；血脂水平异常，诸如高密度脂蛋白(hdl)小于或等于35mg/dl，或甘油三酯大于或等于250mg/dl(mg/dl＝每分升血液的毫克数)。糖尿病的其他症状包括例如排尿频繁、过度口渴、极度饥饿、异常重量减轻、疲劳增加、易怒、或视力模糊。[0078]在一些实施方案中，本文公开的方法延迟糖尿病的发作。延迟糖尿病在对象中的发作是指使糖尿病的至少一种症状的发作延迟至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年、至少30年、至少40年或更久，并且可包括对象的整个寿命，所述至少一种症状例如是高血糖症、低胰岛素血症、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病变、失明、记忆丧失、肾衰竭、心血管疾病(包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、动脉粥样硬化和高血压)、神经病变、自主神经功能异常、高血糖性高渗性昏迷、或它们的组合。[0079]如本文所用，“预防”在关于疾病、病症或医学状况使用时是指降低或消除发展出所述疾病、病症或医学状况的可能性。[0080]如本文所用，术语“施用”是指通过导致递送至作用部位的方法或途径来将如本文公开的药剂放置至对象中。药剂可通过在对象中导致有效治疗的任何适当途径来施用。因此，特别考虑通过静脉内途径进行的施用。然而，在适当配制的情况下，考虑其他途径，包括例如鼻内、动脉内；冠状动脉内；口服、通过吸入、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内、或通过由本领域技术人员所知的其他手段。药剂以可与药剂量制药剂相容的方式，并且以治疗有效量加以施用。待施用的数量和时间选择取决于待治疗的对象、对象的系统利用活性成分的能力、以及所需治疗作用程度。[0081]“治疗有效量”是足以在例如血糖清除方面产生统计显著可测量变化的药剂量。此类有效量可在临床试验以及动物研究中测定。如术语“有效治疗”在本文中所使用，如果在用如本文所述的药剂治疗之后，征象或症状中的任一者或全部得以改善或变好例如至少10％，那么治疗被视为“有效治疗”。功效还可通过个体没有恶化来量度，所述恶化如以住院或需要医学干预来评估(即疾病的进展被停止)。测量这些指标的方法为技术人员所知。[0082]在一些实施方案中，药剂包含小分子、蛋白质或核酸。在特定方面，合乎需要的药剂(例如化合物)增加c1orf127基因产物(例如c1orf127蛋白)的水平或活性(例如通过增加表达和/或分泌)。适合化合物/药剂包括但不限于化学化合物和化学化合物的混合物，例如有机或无机小分子；糖；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白质和肽类似物和衍生物；肽模拟物；核酸；核酸类似物和衍生物；由生物材料诸如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织制得的提取物；天然存在的或合成的组合物；肽；适体；以及抗体或其片段。[0083]化合物/药剂可为核酸rna或dna，并且可为单链或双链。实例核酸化合物包括但不限于编码蛋白质活化子或抑制子(例如转录活化子或抑制子)的核酸、寡核苷酸、核酸类似物(例如肽‑核酸(pna)、假互补性pna(pc‑pna)、锁定核酸(lna)等)、反义分子、核酶、小型抑制性或活化性核酸序列(例如rnai、shrnai、sirna、微小rnai(mrnai)、反义寡核苷酸等)。[0084]蛋白质和/或肽药剂可为调节基因表达或蛋白质活性的任何蛋白质。非限制性实例包括突变蛋白质；治疗性蛋白质和截短蛋白质，例如其中蛋白质通常不存在于靶标细胞中或在较低水平下在靶标细胞中表达。蛋白质还可选自经遗传工程改造蛋白质、肽、合成肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、中型抗体、微型抗体、微型三功能抗体、人源化蛋白质、人源化抗体、嵌合抗体、经修饰蛋白质、以及它们的片段。增加基因的表达或增加由基因编码的蛋白质的水平或活性的化合物或药剂也被称为活化药剂或活化性化合物。降低基因的表达或降低由基因编码的蛋白质的水平或活性的化合物或药剂也被称为抑制剂或抑制性化合物。在一些实施方案中，蛋白质或多肽药剂可为天然c1orf127基因产物的功能性变体或功能性片段。[0085]在一些实施方案中，c1orf127具有seqidno:1的核苷酸序列：[0086]atggggttggagcggagtgatcgctacataatgaagtgtccgatgctaaggtcaaggctgggtcaggaaagcgtccactgtgggcccatgttcatccaggtctcccggcccctgcccctgtggagggacaatagacagactccatggctgctgtcccttcgaggggagctggtggcttctcttgaagacgccagcctgatgggactgtatgtggacatgaatgccaccactgtcaccgtccaaagcccgagacaaggccttcttcagaggtgggaggtgctgaacacctctgctgagctcctgccactatggctggtgagcggtcaccatgcctattctttagaagctgcttgcccaccggtgtcattccagccagagtcggaggtcttagttcacatccccaagcagagactgggtctagtcaaaagaggttcctacattgaggaaaccctgagcctcagattcctccgagtccaccagtccaacatctttatggtgactgagaacaaggactttgtggtggtcagcattccggcggccggggtgctccaggtccagcgatgccaagaagtcggaggaaccccgggaacacaagctttctatagggtagacctgagcctggaatttgccgagatggctgccccggtcctctggacagtggagagcttcttccagtgtgtgggttcaggaacagagtcgcctgcctcaactgctgcactgaggaccactccctccccaccatccccaggaccagagacccctccagcgggagtgccacctgctgcttcctcccaggtgtgggctgcaggaccagctgcccaggaatggctttctcgggacctcctgcaccggccttccgacgcactggccaaaaaggggcttggaccattcctgcaaacagccaaaccggcgagaagaggccagacatctgcctccattctccccagagtggtgcaagctcagcgaggtccccagcctcccccaggggaagcagggatccctggacaccccacacctccagccacgctcccctcggagcctgtagagggtgtccaggctagtccctggcggccacgtccagtcttgccaacgcacccggctctgaccctgcccgtgtcctcagatgcctcctctccttcaccgccagccccgaggcctgaacgacctgaatcacttctggtctcaggaccatctgtcaccctgactgaaggtctaggaactgtgaggcctgaacaggaccccgccaagtctccaggaagtcccctcctgctgagaggcttgtcaagcggggatgtggctgcacctgagcccatcatgggggagcccggccaagccagtgaggagttccagccattggcgaggccctggcgggccacactggctgcagaggagctggtttctcaccgttctcccggagagccccaggaaacgtgctctggaacggaggtggagaggccacgccagacagggcctggtctccccagggagggggccagggggcacatggacctttcatcctcagaaccaagccaggacatagaggggccgggactctccatcctgccagcgagggatgccacattctccaccccaagtgtgaggcagccagaccccagtgcctggctgagttcaggacctgaactcaccgggatgcccagggtgaggctggcagcgcccctggcagttcttcctatggaacctctgccaccagaacctgttcgcccagcagctcttctgacacccgaagcctcatctgtgggagggccagaccaggcccgatacctggagtcagcccctggctggcctgtgggccaggaggagtggggggttgcacacacgtccagccctccatccacgcaaaccctgagcctgtgggctcccacaggagtgttgctacccagcctggtggagcttgaataccccttccaggctggccggggggcctcactccagcaggagctgacagagcccaccttggccctcagtgctgaaagccacaggcctcctgagcttcaagacagtgtggaggggctttctgagaggccctcacgc。[0087]在一些实施方案中，c1orf127具有与seqidno:1具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。[0088]在一些实施方案中，c1orf127基因产物具有seqidno:2的氨基酸序列：[0089]mglersdryimkcpmlrsrlgqesvhcgpmfiqvsrplplwrdnrqtpwllslrgelvasledaslmglyvdmnattvtvqsprqgllqrwevlntsaellplwlvsghhaysleaacppvsfqpesevlvhipkqrlglvkrgsyieetlslrflrvhqsnifmvtenkdfvvvsipaagvlqvqrcqevggtpgtqafyrvdlslefaemaapvlwtvesffqcvgsgtespastaalrttpsppspgpetppagvppaassqvwaagpaaqewlsrdllhrpsdalakkglgpflqtakparrgqtsasilprvvqaqrgpqpppgeagipghptppatlpsepvegvqaspwrprpvlpthpaltlpvssdasspsppaprperpesllvsgpsvtlteglgtvrpeqdpakspgsplllrglssgdvaapepimgepgqaseefqplarpwratlaaeelvshrspgepqetcsgteverprqtgpglpregarghmdlsssepsqdiegpglsilpardatfstpsvrqpdpsawlssgpeltgmprvrlaaplavlpmeplppepvrpaalltpeassvggpdqarylesapgwpvgqeewgvahtssppstqtlslwaptgvllpslveleypfqagrgaslqqelteptlalsaeshrppelqdsveglserpsr。[0090]在一些实施方案中，c1orf127基因产物具有与seqidno:2具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。[0091]在一些实施方案中，药剂包含c1orf127基因产物或其功能性部分或功能性变体的保守结构域。在一些实施方案中，保守结构域具有seqidno:3的氨基酸序列：[0092]kcpmlrsrlgqesvhcgpmfiqvsrplplwrdnrqtpwllslrgelvasledaslmglyvdmnattvtvqsprqgllqrwevlntsaellplwlvsghhaysleaacppvsfqpesevlvhipkqrlglvkrgsyieetlslrflrvhqsnifmvtenkdfvvvsipaagvlqvqrcqevggtpgtqafyrvdlslefaemaapvlwtvesffqc。[0093]在一些实施方案中，药剂包含对应于seqidno:4的保守结构域的部分或其功能性部分或功能性变体：[0094]gsyieetlslrflrvhqsnifmvtenkdfvvvsipaagvlqvqrcqevggtpgtqafyrvdlslefaemaapvlwtvesffqc。[0095]在一些实施方案中，药剂包含通过裂解c1orf127基因产物或其功能性部分或功能性变体来产生的约57kda蛋白质。在一些实施方案中，约57kda蛋白质具有seqidno:5的氨基酸序列：[0096]gsyieetlslrflrvhqsnifmvtenkdfvvvsipaagvlqvqrcqevggtpgtqafyrvdlslefaemaapvlwtvesffqcvgsgtespastaalrttpsppspgpetppagvppaassqvwaagpaaqewlsrdllhrpsdalakkglgpflqtakparrgqtsasilprvvqaqrgpqpppgeagipghptppatlpsepvegvqaspwrprpvlpthpaltlpvssdasspsppaprperpesllvsgpsvtlteglgtvrpeqdpakspgsplllrglssgdvaapepimgepgqaseefqplarpwratlaaeelvshrspgepqetcsgteverprqtgpglpregarghmdlsssepsqdiegpglsilpardatfstpsvrqpdpsawlssgpeltgmprvrlaaplavlpmeplppepvrpaalltpeassvggpdqarylesapgwpvgqeewgvahtssppstqtlslwaptgvllpslveleypfqagrgaslqqelteptlalsaeshrppelqdsveglserpsr。[0097]在一些实施方案中，c1orf127基因产物具有与seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。[0098]在一些实施方案中，药剂包含编码seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5的c1orf127基因产物或其功能性部分或功能性变体的核苷酸序列。在一些实施方案中，药剂包含编码与seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5、或它们的功能性部分或功能性变体具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽的核苷酸序列。[0099]在一些实施方案中，药剂包含c1orf127或c1orf127基因产物(例如c1orf127蛋白)。在一些实施方案中，药剂是相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个不同翻译后修饰的c1orf127基因产物。此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化(例如o连接的寡糖、n连接的寡糖等)、磷酸化、脂质化和酰化。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，相比于天然c1orf127基因产物，c1orf127基因产物具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，c1orf127基因产物比天然c1orf127基因产物少1、2、3、4或5个半胱氨酸。在一些实施方案中，缺少的1、2、3、4或5个半胱氨酸对应于如seqidno:3中所示的保守半胱氨酸。[0100]在一些实施方案中，c1orf127基因产物以不同于天然存在的c1orf127基因产物的方式被磷酸化。在一些实施方案中，c1orf127基因产物比天然存在的c1orf127基因产物少一个磷酸化。在一些实施方案中，c1orf127基因产物比天然存在的c1orf127基因产物多一个磷酸化。在一些实施方案中，不同磷酸化存在于c1orf127基因产物的对应于seqidno:4或seqidno:5的部分中(例如在seqidno:4或seqidno:5中的推定磷酸化位点中)。[0101]在一些实施方案中，c1orf127基因产物以不同于天然存在的c1orf127基因产物的方式被糖基化。在一些实施方案中，c1orf127基因产物比天然存在的c1orf127基因产物少一个糖基化。在一些实施方案中，c1orf127基因产物比天然存在的c1orf127基因产物少两个糖基化。在一些实施方案中，c1orf127基因产物比天然存在的c1orf127基因产物多一个糖基化。在一些实施方案中，c1orf127基因产物比天然存在的c1orf127基因产物多两个糖基化。在一些实施方案中，不同糖基化存在于c1orf127基因产物的对应于seqidno:4或seqidno:5的部分中(例如在seqidno:4或seqidno:5中的推定糖基化位点中)。[0102]在一些实施方案中，c1orf127基因产物是二聚体、三聚体或多聚体。在一些实施方案中，c1orf127基因产物是同二聚体、同三聚体或同多聚体。在一些实施方案中，相比于天然存在的c1orf127基因产物，c1orf127基因产物以不同多聚化状态存在。[0103]在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有不同组成、活性或活性水平的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，相比于天然c1orf127基因产物，c1orf127基因产物具有的血糖清除活性是约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍或更多倍。在一些实施方案中，相比于天然c1orf127基因产物，c1orf127基因产物具有的血糖清除活性是约1％、2.5％、5％、7.5％、10％、20％、30％、40％、50％或更小。在一些实施方案中，药剂包含c1orf127基因产物的功能性部分(即功能性片段)。在一些实施方案中，药剂包含以下c1orf127基因产物的功能性片段：对应于seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5，或与seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列。[0104]在一些实施方案中，药剂包含含有弗林蛋白酶裂解位点的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含不具有pc2裂解位点(例如seqidno:2中的lvkrg)的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含具有弗林蛋白酶裂解位点而不具有pc2裂解位点的c1orf127基因产物。[0105]在一些实施方案中，药剂是表达c1orf127基因产物的细胞。在一些实施方案中，细胞是胰岛细胞或β‑细胞。在一些实施方案中，细胞是胰腺δ‑细胞。在一些实施方案中，对于需要治疗的对象来说，细胞是自体的。在一些实施方案中，细胞是干细胞源性的。在一些实施方案中，干细胞源性细胞是干细胞源性β细胞。本领域中教导了获得β细胞的方法。参见例如2015年1月8日公开的wo2015/002724，所述专利通过引用以它的整体并入本文。在一些实施方案中，细胞被包裹在微囊或半透膜中。[0106]本公开的方面涉及包含本文所述的经分离细胞群体的微囊，所述细胞例如是表达c1orf127基因产物或其功能性变体或功能性片段的细胞。微囊在本领域中是熟知的。微囊的适合实例描述于文献中(例如jahansouz等人，“在糖尿病中β‑细胞替代疗法的进化：胰岛细胞移植(evolutionofβ‑cellreplacementtherapyindiabetesmellitus:isletcelltransplantation)”journaloftransplantation2011；第2011卷，文章标识符247959；orive等人，“用于受控递送生物治疗剂的细胞囊封的应用(applicationofcellencapsulationforcontrolleddeliveryofbiologicaltherapeutics)”，advanceddrugdeliveryreviews(2013)，http://dx.doi.org/10.1016/j.addr.2013.07.009；hernandez等人，“用于原位细胞递送的微囊和微载体(microcapsulesandmicrocarriersforinsitucelldelivery)”，advanceddrugdeliveryreviews2010；62:711‑730；murua等人，“细胞微囊封技术：面向临床应用(cellmicroencapsulationtechnology:towardsclinicalapplication)”，journalofcontrolledrelease2008；132:76‑83；以及zanin等人，“囊封细胞技术用作神经和感觉疾病疗法的发展(thedevelopmentofencapsulatedcelltechnologiesastherapiesforneurologicalandsensorydiseases)”，journalofcontrolledrelease2012；160:3‑13)。微囊可以多种方式配制。示例性微囊包含由聚阳离子层包围的海藻酸盐核心，所述聚阳离子层由外部海藻酸盐膜覆盖。聚阳离子膜形成赋予稳定性和生物相容性的半透膜。聚阳离子的实例包括但不限于聚l‑赖氨酸、聚l‑鸟氨酸、壳聚糖、经乳糖修饰的壳聚糖、以及光聚合生物材料。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生包含具有共价缀合的寡肽的海藻酸盐核心的骨架，所述寡肽具有rgd序列(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生以共价方式强化的微囊，所述微囊具有稳定性得以增强的以化学酶法工程改造的海藻酸盐。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生通过丙烯酸酯官能化磷脂的原位聚合来组装的膜模拟薄膜。在一些实施方案中，微囊由使用差向异构酶以酶法修饰的海藻酸盐组成。在一些实施方案中，微囊在微囊膜的相邻层之间包含共价键联。在某一实施方案中，微囊包含含有与酚部分偶联的海藻酸盐的亚筛尺寸囊。在一些实施方案中，微囊包含含有海藻酸盐‑琼脂糖的骨架。在一些实施方案中，细胞在囊封在海藻酸盐内之前用peg加以修饰。在一些实施方案中，经分离细胞群体被囊封在光反应性脂质体和海藻酸盐中。应了解，微囊中采用的海藻酸盐可用其他适合生物材料替换，所述生物材料包括但不限于peg、壳聚糖、pes中空纤维、胶原、透明质酸、具有rgd的右旋糖酐、ehd和pegda、pmbv和pva、pgsas、琼脂糖、具有明胶的琼脂糖、plga、以及这些生物材料的多层实施方案。[0107]在一些实施方案中，药剂还包含药学上可接受的载体或赋形药剂。如本文所用，“药学上可接受的载体”意图包括可与药物施用相容的任何和所有溶药剂、分散介质、包覆药剂、抗细菌药剂和抗真菌药剂、等张药剂和吸收延迟药剂等。适合载体描述于作为本领域中的标准参考教科书的最新版的《雷明顿药物科学》中，所述教科书通过引用并入本文。此类载体或稀释药剂的优选实例包括但不限于：水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、以及5％人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水性媒介物诸如不挥发性油。将此类介质和药剂用于药物活性物质在本领域中是熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其用于药剂/组合物中。补充性活性化合物也可并入至药剂/组合物中。[0108]在一些实施方案中，本文公开的方法还包括向对象施用一种或多种额外抗糖尿病治疗剂(例如阿卡波糖(precose)、阿必鲁肽(tanzeum)、阿格列汀(尼欣那)、阿格列汀和二甲双胍(kazano)、阿格列汀和匹格列酮(oseni)、甲磺酸溴麦角环肽(cycloset、parlodel)、卡格列净(怡可安)、卡格列净和二甲双胍(invokamet)、达格列净(安达唐)、达格列净和二甲双胍(xigduoxr)、度拉鲁肽(度易达)、恩格列净(欧唐静)、恩格列净和利格列汀(糖顺平)、恩格列净和二甲双胍(synjardy)、艾塞那肽(百泌达)、格列美脲(亚莫利)、格列本脲(diabeta、glynase)、格列本脲和二甲双胍(glucovance)、门冬胰岛素(novolog)、德谷胰岛素(tresiba)、甘精胰岛素(basaglar、来得时、toujeo)、低精蛋白胰岛素(优泌林n、诺和灵n)、低精蛋白胰岛素/普通胰岛素(优泌林70/30、诺和灵70/30)、赖脯胰岛素(优泌乐)、利格列汀(欧唐宁)、利拉鲁肽(诺和力)、二甲双胍(格华止)、米格列醇(glyset)、那格列奈(starlix)、匹格列酮(actos)、瑞格列奈(prandin)、罗格列(avandia)、罗格列酮和格列美脲(avandaryl)、罗格列酮和二甲双胍(avandamet)、沙格列汀(安立泽)、索马鲁肽(ozempic)、或西格列汀(捷诺维))。[0109]在一些实施方案中，药剂的施用改善血糖清除。在一些实施方案中，药剂的施用使血糖水平从病理水平恢复至非病理水平(例如从高血糖状态恢复至正常状态)。在一些实施方案中，药剂的施用使血糖水平降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或更多。在一些实施方案中，药剂的施用使血糖水平降低至约小于140mg/dl、约小于100mg/dl、约60‑90mg/dl、或约70‑80mg/dl。在一些实施方案中，药剂的施用不在对象中导致低血糖症(例如血糖小于约70mg/dl，血糖小于约60mg/dl，或达到其中对象不展现低血糖症的征象的血糖水平)。在一些实施方案中，药剂的血糖清除性质不依赖于胰岛素活性。[0110]在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂具有葡萄糖敏化剂活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加胰岛素活性、产生或分泌。在一些实施方案中，药剂的施用使胰岛素活性、产生或分泌增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多。在一些实施方案中，药剂的施用使胰岛素活性、产生或分泌增加至约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、5倍、10倍、50倍或更多倍。[0111]在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加葡萄糖转换速率。在一些实施方案中，药剂的施用使葡萄糖转换增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多。在一些实施方案中，药剂的施用使葡萄糖转换增加至约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、5倍、10倍、50倍或更多倍。[0112]在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖酵解。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖酵解速率。在一些实施方案中，药剂的施用使糖酵解增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多。在一些实施方案中，药剂的施用使糖酵解增加至约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、5倍、10倍、50倍或更多倍。[0113]在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖原合成速率。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加糖原合成速率。在一些实施方案中，药剂的施用使糖原合成增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多。在一些实施方案中，药剂的施用使糖原合成增加至约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、5倍、10倍、50倍或更多倍。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂具有升糖素样活性。[0114]在一些实施方案中，对象患有糖尿病(例如i型糖尿病或ii型糖尿病)、代谢综合征、葡萄糖不耐受、或肥胖症。在一些实施方案中，对象患有糖尿病。在一些实施方案中，对象的基因组包含c1orf127的突变体或变体形式。在一些实施方案中，变体是以下中的一者：1_11014118_c_t、1_11015165_a_g、1_11008102_g_a、1_11009679_g_a、1_11007881_g_t、1_11008778_t_a,c、1_11008799_g_c、1_11008417_g_a、1_11008127_c_t、1_11009703_c_t、1_11008594_a_t、1_11007997_c_t、1_11024271_g_t,a、1_11008685_t_c、1_11009716_c_g、1_11009844_g_a、1_11008417_g_a、1_11036248_g_a、1_11024271_g_t,a、1_11009844_g_a、1_11008799_g_c、1_11008778_t_a,c、1_11008685_t_c、1_11014118_c_t、1_11009716_c_g、1_11008102_g_a、1_11007895_g_t、1_11008127_c_t、1_11009703_c_t、1_11008594_a_t、1_11009679_g_a、1_11014127_c_t、1_11008844_c_g,t、1_11015165_a_g、1_11009703_c_t、1_11009679_g_a、1_11008594_a_t、1_11008102_g_a、1_11009844_g_a、1_11007895_g_t、1_11008127_c_t、1_11008417_g_a、1_11007724_c_t、1_11024271_g_t,a、1_11008778_t_a,c、1_11009716_c_g、1_11015165_a_g、1_11014118_c_t、1_11008799_g_c、1_11007881_g_t、1_11008685_t_c、1_11007997_c_t、1_11015165_a_g、1_11008102_g_a、1_11008685_t_c、1_11008799_g_c、1_11008127_c_t、1_11009679_g_a、1_11014118_c_t、1_11009703_c_t、1_11007724_c_t、1_11008594_a_t、1_11009716_c_g、1_11007895_g_t、1_11007881_g_t、1_11008778_t_a,c、1_11024271_g_t,a或1_11007997_c_t。[0115]在一些实施方案中，c1orf127变体与糖尿病和高bmi相关联。在一些实施方案中，与糖尿病和高bmi相关联的c1orf127变体是1_11033415_g_a。在一些实施方案中，c1orf127变体与空腹葡萄糖水平升高相关联。在一些实施方案中，与空腹葡萄糖水平升高相关联的c1orf127变体是1_11014118_c_t。在一些实施方案中，变体与1型糖尿病相关联。在一些实施方案中，变体与2型糖尿病相关联。在一些实施方案中，变体与高bmi相关联。[0116]在一些实施方案中，药剂的施用修正对象中导致c1orf127基因产物的异常表达或活性的遗传缺陷。在一些实施方案中，遗传缺陷是如本文鉴定的c1orf127变体。在一些实施方案中，遗传缺陷是变体1_11033415_g_a。在一些实施方案中，遗传缺陷是变体1_11014118_c_t。在一些实施方案中，药剂包含可靶向核酸酶。在一些实施方案中，药剂还包含使核酸酶靶向遗传缺陷的grna。在一些实施方案中，药剂还包含用于在由可靶向核酸酶在缺陷位点处产生dna断裂之后，通过同源性引导的修复(hdr)来修正缺陷的供体核酸。[0117]可靶向核酸酶(例如位点特异性核酸酶)在基因组中在所选靶标位点处产生dna断裂，并且可用于产生精确基因组修饰。dna断裂，例如双链dna断裂，可通过各种dna修复路径来修复。同源性重组(hr)介导的修复(也被称为同源性引导的修复(hdr))使用同源性供体dna作为模板来修复断裂。如果供体dna的序列不同于基因组序列，那么这个过程导致将序列变化引入至基因组中。通过提供包含适当序列的供体dna，可对基因组进行精确修饰。可使用可靶向核酸酶来产生的修饰包括一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，或在基因组中所选位置处引入外源性dna区段诸如表达盒(包含待表达的序列和用以导致所述序列在细胞中表达的适当表达控制元件诸如启动子的核酸)或标签。[0118]当前有四种主要类型的可靶向核酸酶在使用：锌指核酸酶(zfn)、转录活化子样效应物核酸酶(talen)、和rna引导的核酸酶(rgn)诸如ii型crispr/cas系统的cas蛋白、以及经工程改造兆碱基大范围核酸酶。zfn和talen包含限制酶foki的核酸酶结构域(或其经工程改造变体)，所述核酸酶结构域融合于被适当设计来使蛋白质靶向所选dna序列的位点特异性dna结合结构域(dbd)。在zfn的情况下，dna结合结构域包含锌指dbd。在talen的情况下，位点特异性dbd基于由转录活化子样效应物(tale)采用的dna识别密码来设计，所述转录活化子样效应物是见于植物病原性细菌诸如黄单胞菌属种(xanthomonasspecies)中的一个家族的位点特异性dna结合蛋白。ii型成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)系统是一种已被改进来作为用于基因组工程改造的rna引导的核酸内切酶技术的细菌适应性免疫系统。细菌系统包含被称为crrna和tracrrna的两种内源性细菌rna以及crispr相关(cas)核酸酶例如cas9。tracrrna与crrna具有部分互补性，并且与它形成复合物。cas蛋白由crrna/tracrrna复合物引导至靶标序列，所述复合物形成在crrna序列与靶标中的同源序列之间的rna/dna杂合物。对于在基因组修饰中使用，经常将crrna和tracrrna组分组合成单一嵌合引导rna(sgrna或grna)，其中crrna的靶向特异性和tracrrna的性质被组合至单一转录物中，所述转录物使cas蛋白定位于靶标序列，以致cas蛋白可裂解dna。sgrna经常包含互补于所需靶标序列的具有约20个核苷酸的引导序列，和随后的约80nt的杂合crrna/tracrrna。本领域普通技术人员了解引导rna无需完全互补于靶标序列。举例来说，在一些实施方案中，它可具有一个或两个不匹配。[0119]在一些实施方案中，一种或多种引导序列(例如引导rna、grna)是天然存在的rna序列、经修饰rna序列(例如包含一个或多个经修饰碱基的rna序列)、合成rna序列、或它们的组合。如本文所用，“经修饰rna”是包含一个或多个修饰的rna(例如包含一个或多个非标准以及/或者非天然存在的碱基和/或对骨架、一个或多个核苷间键联和/或糖的修饰的rna)。修饰rna的碱基的方法在本领域中是熟知的。此类经修饰碱基的实例包括核苷5‑甲基胞苷(5mc)、假尿苷(ψ)、5‑甲基尿苷、2'0‑甲基尿苷、2‑硫代尿苷、n‑6甲基腺苷、次黄嘌呤、二氢尿苷(d)、肌苷(i)和7‑甲基鸟苷(m7g)中含有的那些。应注意，在各种实施方案中，可修饰rna序列中任何数目的碱基、糖或骨架键联。还应了解可使用不同修饰的组合。在一些实施方案中，rna包含一个或多个选自以下的修饰：硫代磷酸酯、2’‑ome、2’‑f、2’‑约束乙基(2’‑cet)、2’‑ome3’硫代磷酸酯(ms)、以及2’‑ome3‑硫代pace(msp)修饰。在一些实施方案中，修饰可使rna稳定，并且/或者增加它对互补性序列的结合亲和力。[0120]在一些实施方案中，一种或多种引导序列包含至少一个锁定核酸(lna)单元，诸如1、2、3、4、5、6、7或8个lna单元，诸如3–7或4–8个lna单元，或3、4、5、6或7个lna单元。在一些实施方案中，一种或多种引导序列的所有核苷酸都是lna。在一些实施方案中，一种或多种引导序列可同时包含β‑d‑氧基‑lna以及以下lna单元中的一者或多者：呈β‑d构型或α‑l构型的硫代‑lna、氨基‑lna、氧基‑lna和/或ena、或它们的组合。在一些实施方案中，所有lna胞嘧啶单元都是5’甲基‑胞嘧啶。[0121]在一些实施方案中，一种或多种引导序列是吗啉代寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸通常是合成分子，长度是约25个碱基，并且通过标准核酸碱基配对来结合互补rna序列。吗啉代寡核苷酸具有标准核酸碱基，但那些碱基结合于吗啉环而非脱氧核糖环，并且通过二氨基磷酸酯基团而非磷酸酯来连接。[0122]在一些实施方案中，引导序列在长度方面可从约8个碱基对(bp)至约200bp进行变化。在一些实施方案中，一种或多种引导序列中的每一者在长度方面可为约9至约190bp；约10至约150bp；约15至约120bp；约20至约100bp；约30至约90bp；约40至约80bp；约50至约70bp。[0123]化学修饰以及合成引导rna(引导序列)的方法在本领域中是已知的。参见wo/2016/164356，通过引用以它的整体并入本文。[0124]每种基因组序列(例如目标靶标序列、目标基因、遗传缺陷)中与每种引导序列互补或同源的部分在大小方面也可变化。在特定方面，每种基因组序列中与引导序列互补或同源的部分在长度方面可为约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、81、92、93、94、95、96、97、98或100个核苷酸(连续核苷酸)。在一些实施方案中，每种引导序列与每种基因组序列的部分的同一性、互补性或类似性可为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％等。在一些实施方案中，每种引导序列与每种基因组序列完全或部分同一、互补或类似。举例来说，每种引导序列距离与基因组序列的部分完全互补或同源可相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸等。在一些实施方案中，跨越基因组序列的至少约10至约25(例如约20)个核苷酸与一种或多种引导序列是完全互补的或同源的(100％)。[0125]基因组靶标序列(例如目标基因组基因座、目标基因、目标靶标序列、遗传缺陷)还应随后紧接着原间隔体邻近基序(pam)序列。pam序列存在于dna靶标序列中但不存在于引导序列中。cas蛋白将被引导至具有随后有pam序列的恰当靶标序列的任何dna序列。pam序列视cas蛋白所源于的细菌物种而变化。在一些实施方案中，可靶向核酸酶包含cas9蛋白。举例来说，可使用来自化脓性链球菌(streptococcuspyogenes，sp)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitides)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、嗜热链球菌(streptococcusthermophiles)或齿垢密螺旋体(treponemadenticola)的cas9。用于这些cas9蛋白的pam序列分别是ngg、nnnngatt、nnagaa、naaaac。位点特异性核酸酶的许多经工程改造变体已被开发，并且可在某些实施方案中使用。举例来说，cas9和fok1的经工程改造变体在本领域中是已知的。此外，应了解可使用生物活性片段或变体。其他变化包括使用杂合可靶向核酸酶。举例来说，在crisprrna引导的foki核酸酶(rfn)中，foki核酸酶结构域融合于催化活性失活的cas9蛋白(dcas9)的氨基末端。rfn以二聚体形式起作用，并且利用两种引导rna(tsai，qs等人，natbiotechnol.2014；32(6):569–576)。产生单链dna断裂的位点特异性核酸酶也可用于基因组编辑。此类核酸酶，有时被称为“切口酶”，可通过在包含两个核酸酶结构域的可靶向核酸酶(诸如zfn、talen和cas蛋白)的两个核酸酶结构域中的一者中的关键催化残基处引入突变(例如丙氨酸取代)来产生。此类突变的实例包括在spcas9中的d10a、n863a和h840a，或在其他cas9蛋白中同源性位置处的突变。在一些细胞类型中，切口可刺激低效率的hdr。靶向彼此接近并且在相对链上的一对序列的两个切口酶可在每个链上产生单链断裂(“双切口”)，从而有效地产生dsb，所述dsb可通过使用供体dna模板进行hdr来修复(ran,f.a.等人cell154,1380‑1389(2013))。[0126]术语“供体核酸”或“供体”是指外源性核酸区段，当例如连同可靶向核酸酶一起对细胞提供时，所述外源性核酸区段可用作通过同源性重组进行的dna修复的模板，并且由此导致位点特异性基因组修饰(有时被称为“基因组编辑”)。修饰可包括一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，或在基因组中所选位置处引入外源性dna区段诸如表达盒或标签。供体核酸通常包含与基因组的待进行基因组修饰所处的区域具有同源性的序列。供体可含有一个或多个单一碱基变化、插入、缺失、或关于基因组序列的其他改变，只要它具有足以允许进行同源性引导的修复的同源性即可。在本发明中，供体核酸是包含由同源臂侧接的报告基因和wpre的核酸序列。同源臂与侧接于基因组dna中待进行插入所处的位置(例如dna断裂)的基因组序列同源。本领域普通技术人员还了解，同源性无需一直延伸至dna断裂。举例来说，在一些实施方案中，同源性开始于相距断裂至多100bp处，例如相距断裂在1与100bp之间处，例如相距断裂1–50bp处，例如相距断裂1‑15bp处。[0127]在各种实施方案中，供体核酸可例如以dna质粒、pcr产物、或化学合成的寡核苷酸形式提供，并且可为双链或单链。供体核酸的大小可从小至约40个碱基对(bp)至约10千碱基(kb)或更大进行变化。在一些实施方案中，供体核酸的长度在约1kb与约5kb之间。[0128]本领域普通技术人员了解用于使用可靶向核酸酶进行位点特异性基因组修饰的方法，并且将能够将此类方法应用于修复如本文教导的与c1orf127的异常表达或活性相关的遗传缺陷。本领域普通技术人员可例如设计合适的引导rna、talen或zfn，以在基因组中的所选位置处产生dna断裂，可设计靶向载体(例如包含同源臂)以促进在由可靶向核酸酶产生的dna断裂处进行hdr，并且了解可用于向细胞中引入可靶向核酸酶，并且在适当时引入供体核酸和/或引导rna的适当方法。通过适当设计核酸酶或引导rna，可使可靶向核酸酶靶向哺乳动物细胞的基因组中的独特位点。核酸酶或引导rna可通过将编码它的核酸引入至细胞中来引入至细胞中。可使用标准方法，诸如质粒dna转染、病毒载体递送、用合成mrna(例如加帽多腺苷酸化mrna)进行的转染、或显微注射。如果引入编码核酸酶或引导rna的dna，那么编码序列应可操作地连接于合适的表达调控元件，诸如启动子和终止信号。在一些实施方案中，编码引导rna的序列可操作地连接于rna聚合酶iii启动子，诸如u6或trna启动子。在一些实施方案中，一种或多种引导rna和cas蛋白编码序列从同一核酸(例如质粒)转录。在一些实施方案中，多种引导rna从同一质粒或从不同质粒转录，或以其他方式引入至细胞中。多种引导rna可将cas9引导至基因组中的不同靶标序列，从而允许进行多路基因组编辑。在一些实施方案中，核酸酶蛋白(例如cas9)可包含或被修饰来包含核定位信号(例如sv40nls)。可例如使用蛋白质转导来将核酸酶蛋白引入至细胞中。可使用显微注射来引入核酸酶蛋白、引导rna、或两者。使用可靶向核酸酶例如来进行基因组编辑的方法描述于众多出版物中，所述出版物诸如是《酶学中的方法(methodsinenzymology)》，doudnaja，sontheimerej.(编)，crispr/cas9、zfn和talen在产生位点特异性基因组改变中的用途(theuseofcrispr/cas9,zfns,andtalensingeneratingsite‑specificgenomealterations).methodsenzymol.2014，第546卷(elsevier)；carroll,d.，用可靶向核酸酶进行基因组编辑(genomeeditingwithtargetablenucleases)，annu.rev.biochem.2014.83:409–39，以及这些出版物中的任一者中的参考文献。也参见美国专利公布第20140068797、20140186919、20140170753号和/或pct/us2014/034387(wo/2014/172470)。这些参考文献中的每一者通过引用以它的整体并入本文。[0129]药剂和组合物[0130]本公开的一些方面涉及当施用至对象时增加c1orf127基因产物的水平或活性的药剂。药剂可为如本文所述的任何药剂。c1orf127基因产物可为如本文所述的任何c1orf127基因产物。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂增加内源性c1orf127基因产物的水平或活性。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂调节(例如增加或降低)内源性c1orf127基因产物的表达。药剂可使表达增加或降低任何量，并且不受限制。在一些实施方案中，药剂使表达增加至约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、5倍或更多倍。在一些实施方案中，药剂使表达增加或使表达降低约1％、2.5％、5％、7.5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％、300％、500％或更多。[0131]在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂调节(例如增加或降低)内源性c1orf127基因产物的分泌。药剂可使分泌增加或降低任何量，并且不受限制。在一些实施方案中，药剂使分泌增加至约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、5倍或更多倍。在一些实施方案中，药剂使分泌增加或使分泌降低约1％、2.5％、5％、7.5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％、300％、500％或更多。[0132]在一些实施方案中，药剂包含小分子、蛋白质或核酸。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个不同翻译后修饰的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，药剂包含相比于天然c1orf127基因产物具有不同活性或活性水平的c1orf127基因产物。在一些实施方案中，其中药剂包含c1orf127基因产物的功能性部分。[0133]在一些实施方案中，药剂还包含药学上可接受的载体或赋形药剂。药学上可接受的载体或赋形药剂不受限制，并且可为本文所述的任何药学上可接受的载体或赋形药剂。[0134]含有至少一种药剂的治疗性组合物可常规地以例如单位药剂量施用。术语“单位药剂量”在关于治疗性组合物使用时是指适合作为单一药剂量用于对象的物理离散单元，每个单元含有被计算以产生所需治疗作用的预定量的活性物质以及所需生理上可接受的稀释药剂，即载体或媒介物。[0135]药剂的药剂量范围取决于效能，并且是足够大以致产生所需作用例如改善血糖清除的量。药剂量不应大到导致不可接受的不利副作用。通常，药剂量将随患者的年龄、状况和性别而变化，并且可由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，那么药剂量还可由单个医师加以调整。通常，药剂量可在0.001mg/kg体重至0.5mg/kg体重的范围内。在一个实施方案中，药剂量范围是5μg/kg体重至30μg/kg体重。[0136]可重复施用以上叙述的药剂量。在一些实施方案中，一天一次，或一天多次，例如但不限于一天三次来给与药剂量。在一些实施方案中，每日施用以上叙述的药剂量，持续数周或数月。治疗的持续时间取决于对象的临床进展和对疗法的响应性。[0137]活性成分的需要被施用的确切量取决于从业者的判断，并且对于每个个体来说是特定的。然而，适于全身性施加的药剂量范围在本文中加以公开，并且取决于施用途径。适合施用方案也是可变的，但典型的是进行初始施用，继之以通过后续施用来在一种或多种间隔下达成重复药剂量。或者，考虑足以将血液中的浓度维持在对于体内疗法所指定的范围内的连续静脉内输注。在一些实施方案中，药剂量范围足以将血液中的浓度维持在见于正常健康人对象的群体的血液中的范围内。[0138]在一些实施方案中，药剂包含额外抗糖尿病治疗剂。额外抗糖尿病治疗剂不受限制，并且可为本文所述的任何抗糖尿病治疗剂。额外抗糖尿病治疗剂可一起或单独施用。在一些实施方案中，额外抗糖尿病治疗剂在单一药剂型中。在一些实施方案中，额外抗糖尿病治疗剂在单独药剂型中。[0139]在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂改善血糖清除。在一些实施方案中，当施用至对象时，药剂不导致低血糖症。[0140]在一些实施方案中，对象患有糖尿病(例如i型糖尿病或ii型糖尿病)、代谢综合征、葡萄糖不耐受、或肥胖症。在一些实施方案中，对象患有糖尿病。在一些实施方案中，对象是人或鼠。[0141]在一些实施方案中，药剂包含seqidno:2的c1orf127基因产物或其功能性部分或功能性变体。在一些实施方案中，药剂包含编码c1orf127基因产物、其功能性部分或功能性变体的核酸，其中所述核酸包含seqidno:1或其一部分的序列。在一些实施方案中，药剂包含编码c1orf127基因产物、其功能性部分或功能性变体的核酸，其中所述核酸包含与seqidno:1或其一部分具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。[0142]在一些实施方案中，药剂修正对象中导致c1orf127基因产物的异常表达或活性的遗传缺陷。在一些实施方案中，药剂包含如本文所述的可靶向核酸酶。在一些实施方案中，药剂包含引导rna以及任选的如本文所述的供体核酸。[0143]诊断方法[0144]本公开的一些方面涉及诊断测试个体中的c1orf127相关病症或发展出c1orf127相关病症的风险增加的方法，所述方法包括测定从所述测试个体获得的样品中的c1orf127基因产物水平，其中相较于正常个体中的c1orf127基因产物水平，所述测试个体中的c1orf127基因产物水平增加或降低指示c1orf127相关病症。测试个体可为本文所述的任何对象。[0145]指示c1orf127相关疾患的c1orf127水平可规定为相比于来自已知无c1orf127相关病症的个体的样品中的c1orf127水平，来自已知患有c1orf127相关病症的个体的样品中存在的水平降低。在来自患有c1orf127相关病症的个体的样品中，c1orf127水平可为例如是至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.0倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5.0倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6.0倍、10倍、15倍、20倍、50倍或100倍高的，或是至少1/1.1、1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2.0、1/2.1、1/2.2、1/2.3、1/2.4、1/2.5、1/2.6、1/2.7、1/2.8、1/2.9、1/3.0、1/3.1、1/3.2、1/3.3、1/3.4、1/3.5、1/3.6、1/3.7、1/3.8、1/3.9、1/4.0、1/4.1、1/4.2、1/4.3、1/4.4、1/4.5、1/4.6、1/4.7、1/4.8、1/4.9、1/5.0、1/5.1、1/5.2、1/5.3、1/5.4、1/5.5、1/5.6、1/5.7、1/5.8、1/5.9、1/6.0、1/10、1/15、1/20、1/50或1/100低的。[0146]使用许多公认的免疫结合测定中的任一者来检测和/或定量c1orf127基因产物(例如蛋白质)(参见例如美国专利第4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168号)。对于一般性免疫测定的综述，也参见methodsincellbiology第37卷:《细胞生物学中的抗体(antibodiesincellbiology)》，asai编，纽约美国学术出版社(1993)；《基础和临床免疫学(basicandclinicalimmunology)》第7版，stites和terr编(1991)。[0147]在一些实施方案中，样品中的c1orf127基因产物还可使用免疫印迹(western印迹)分析来检测和定量。免疫印迹通常包括通过凝胶电泳基于分子量来分离样品，将经分离蛋白质转移至适合固体载体(诸如硝化纤维素滤膜、尼龙滤膜、或衍生尼龙滤膜)，以及使样品与特异性结合c1orf127基因产物的抗体一起孵育。抗c1orf127基因产物抗体特异性结合在固体载体上的c1orf127基因产物。这些抗体可被直接标记，或替代地，可随后使用特异性结合抗c1orf127基因产物抗体的经标记抗体(例如经标记绵羊抗小鼠抗体)来检测。[0148]在一些实施方案中，当测量的c1orf127基因产物水平大于或小于对照样品的测量或已知水平(例如正常健康个体的已知或测量水平，或同一个体的在不同时间测定的“基线/参考”水平)时，对c1orf127基因产物的定量测定被视为显示阳性结果，例如升高或降低的c1orf127基因产物水平。在一特别优选实施方案中，当样品与“对照”之间的差异是统计显著的(例如在85％或更大，优选是在90％或更大，更优选是在95％或更大，并且最优选是在98％或更大置信水平下)时，测定被视为显示阳性结果。[0149]在一些实施方案中，检测血液样品中的c1orf127基因产物水平。获得以及处理血液样品的方法在本领域中是已知的，并且在本文中不受限制。[0150]本公开的一些方面涉及诊断测试个体中的c1orf127相关病症或发展出c1orf127相关病症的风险增加的方法，所述方法包括筛查所述测试个体在c1orf127中的突变。检测遗传突变的方法在本领域中是已知的，并且不受限制。在一些实施方案中，c1orf127相关病症是糖尿病。[0151]筛选方法[0152]本公开的一些方面涉及筛选c1orf127基因产物受体激动剂的方法，所述方法包括使对c1orf127基因产物起应答的细胞与测试剂接触，以及测定所述细胞的应答，其中如果所述细胞起应答，那么将所述测试剂鉴定为c1orf127基因产物受体激动剂。在一些实施方案中，细胞应答是葡萄糖摄取。在一些实施方案中，还使细胞与胰岛素受体拮抗剂接触。在一些实施方案中，胰岛素受体拮抗剂是s961。在一些实施方案中，使用具有所述细胞的动物(例如如本文所述的对象)。[0153]用于富集编码分泌蛋白和膜结合蛋白的mrna的方法[0154]本公开的一些方面涉及富集编码分泌蛋白和膜结合蛋白的mrna的方法，所述方法包括：提供包含具有标记的内质网(er)易位子的细胞，对所述细胞进行亚细胞分级分离并且分离含有所述标记的er级分，以及分离和测序含有所述标记的经分离er级分中含有的mrna。[0155]具有标记的er易位子组分不受限制。在一些实施方案中，经标记er易位子组分是sec61、寡糖基转移酶复合物、trap复合物、或膜蛋白tram。在一些实施方案中，er易位子组分sec61b具有标记。[0156]将标记添加至er易位子组分的方法不受限制。在一些实施方案中，细胞被遗传修饰来将标记与易位子组分一起表达。对细胞进行遗传修饰的方法不受限制，并且是本领域中已知的任何方法。在一些实施方案中，使用如本文所述的可靶向核酸酶来遗传修饰细胞。在一些实施方案中，标记是荧光标记。在一些实施方案中，荧光标记是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或红外荧光蛋白。[0157]在一些实施方案中，标记短暂表达，或仅在某些细胞条件下表达。在一些实施方案中，某些条件是存在位点特异性重组酶(例如cre/lox)。举例来说，标记可连同由loxp侧接的终止密码子一起添加至基因组中。在活化/添加cre后，终止密码子将在重组期间被移除，并且标记连同易位子组分一起表达。[0158]术语“位点特异性重组酶”(在本文中也简称为“重组酶”)是指可识别dna分子中特定序列，并且催化所述特定序列之间的dna重组的蛋白质。此类序列可被称为那种特定重组酶的“重组序列”或“重组位点”。酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶是位点特异性重组酶的两个主要家族。位点特异性重组酶系统的实例包括cre/lox系统(cre重组酶介导loxp之间的重组)、flp/frt系统(flp重组酶介导frt位点之间的重组)、以及phic31系统(phic31重组酶在被称为attb和attp位点的序列处介导dna重组)。与cre类似的重组酶系统包括dre‑rox、vcre/vloxp和scre/sloxp系统(anastassiadisk等人(2009)dismodelmech2(9–10):508–515；suzukie,nakayamam(2011)nucl.acidsres.(2011)39(8):e49)。应了解提及特定重组酶系统意图涵盖重组酶和重组位点的各种经工程改造和突变形式，以及本领域中已知的编码序列的密码子优化形式。放置在两个loxp位点之间的dna被称为“经loxp侧接”。基因可通过插入允许通过cre介导的重组来切除经loxp侧接的基因区段的两个loxp位点加以修饰。在一些实施方案中，cre的表达可在细胞类型特异性、细胞状态特异性或诱导型表达控制元件(例如细胞类型特异性、细胞状态特异性或诱导型启动子)的控制下，或cre活性可通过小分子来调控。举例来说，cre可融合于受体(例如类固醇激素受体)的配体结合结构域，以致它的活性由受体配体调控。可使用cre‑er(t)或cre‑er(t2)重组酶，所述重组酶包含人雌激素受体(er)的突变配体结合结构域和cre的融合蛋白，cre的活性可通过例如4‑羟基‑他莫昔芬来诱导。适当放置lox序列允许进行多种基因组操控。[0159]在一些实施方案中，方法的步骤b)包括使细胞与蛋白质合成抑制剂接触，使细胞质膜溶解，以及使er免疫沉淀。[0160]蛋白质合成抑制剂不受限制，并且可为保持经标记易位子与er相关联的任何适合蛋白质合成抑制剂。在一些实施方案中，蛋白质合成抑制剂阻断翻译延伸。在一些实施方案中，蛋白质合成抑制剂是chan等人，由细胞毒性谱比较鉴定的真核蛋白质合成抑制剂(eukaryoticproteinsynthesisinhibitorsidentifiedbycomparisonofcytotoxicityprofiles)，rna2004.10:528‑543中鉴定的蛋白质合成抑制剂。在一些实施方案中，蛋白质合成抑制剂是环己酰胺。[0161]在一些实施方案中，用逐步浓度的清洁剂来溶解细胞质膜。在一些实施方案中，以逐步方式依次溶解质膜和er膜。本领域中已知的任何适合清洁剂或清洁剂的组合都可被使用，并且不受限制。使质膜溶解的方法可由本领域技术人员实施。在一些实施方案中，清洁剂是毛地黄皂苷和/或正十二基‑b‑d‑麦芽糖苷(ddm)。[0162]免疫沉淀的方法也不受限制，并且可通过本领域中已知的任何适合方法进行。在一些实施方案中，用对标记或对经标记易位子组分具有特异性的抗体使er免疫沉淀。在一些实施方案中，标记是gfp，并且抗体是抗gfp抗体。在一些实施方案中，抗体连接于磁珠或其他基底。[0163]对mrna测序的方法不受限制，并且可为本领域中已知的任何适合方法。在一些实施方案中，通过下一代测序来对mrna测序。[0164]本文所述的方法和组合物的细胞不受限制，并且可为任何适合细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞(例如胚胎干细胞、哺乳动物胚胎干细胞、人胚胎干细胞、鼠胚胎干细胞)。在一些实施方案中，细胞是胚胎干细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干细胞。[0165]在一些实施方案中，细胞包括体细胞、干细胞、有丝分裂细胞或有丝分裂后细胞、神经元、纤维母细胞或合子。干细胞可包括全能、多能、专能、寡能和单能干细胞。干细胞的具体实例包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞(ipsc)(例如参见美国公布申请第2010/0144031、2011/0076678、2011/0088107、2012/0028821号，所述申请全都通过引用并入本文)。[0166]体细胞可为原代细胞(非永生化细胞)，诸如从动物新鲜分离的那些，或可源于能够在培养中延长增殖(例如持续长于3个月)或无限增殖(永生化细胞)的细胞系。成体体细胞可从个体例如人对象获得，并且根据可为本领域普通技术人员所用的标准细胞培养方案加以培养。可用于本发明的方面的体细胞包括哺乳动物细胞，诸如像人细胞、非人灵长类动物细胞、或啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞。它们可通过熟知方法来从各种器官获得，所述器官例如是皮肤、肺、胰腺、肝、胃、肠、心脏、乳腺、生殖器官、肌肉、血液、膀胱、肾、尿道和其他泌尿器官等，通常从含有活的体细胞的任何器官或组织获得。可用于各种实施方案中的哺乳动物体细胞包括例如纤维母细胞、塞尔托利细胞、粒层细胞、神经元、胰腺细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(b和t淋巴细胞)、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等。在一些实施方案中，细胞是β‑细胞。[0167]在一些实施方案中，细胞是患病细胞或展现病理状态。在一些实施方案中，细胞是从诱导多能干细胞分化的细胞。在一些实施方案中，诱导多能干细胞源于患有目标疾病或疾患的对象。在一些实施方案中，诱导多能干细胞来自患有糖尿病或具有发展出糖尿病的风险的对象。[0168]疾病和疾患不受限制。在一些实施方案中，疾病或疾患选自代谢疾病、心血管疾病、循环或血管疾病、神经疾病、胃肠疾病(例如炎症性肠病、克罗恩氏病)以及与衰老相关的疾病。[0169]在一些实施方案中，细胞正经受应激应答(例如缺氧、高血糖、低血糖、缺氧/再灌注)。[0170]在一些实施方案中，当与蛋白质合成抑制剂接触时，细胞正对刺激起应答。在一些实施方案中，刺激是激素(例如胰岛素)。在一些实施方案中，刺激是环境条件(例如低氧、再灌注)。在一些实施方案中，刺激是胰岛素。[0171]在一些实施方案中，方法还包括对对照细胞进行富集编码分泌蛋白和膜结合蛋白的mrna的方法，以及将从细胞分离的mrna与从所述对照细胞分离的mrna进行比较。[0172]er‑seq的应用：[0173]1.通过特异性分离编码分泌蛋白的rna以及在两个测试组之间比较它们，er‑seq可用于比较在体外产生的来自非糖尿病患者和糖尿病患者的β‑细胞以发现新型疾病生物标志物。[0174]2.er‑seq可用于鉴定由功能异常性β细胞产生的分泌肽生物标志物。[0175]3.在体外诱导应激应答以鉴定β‑细胞功能异常的生物标志物[0176]4.通过产生寻求消除受损分泌蛋白的测定法，我们可找到用以在t1d发作时保护β‑细胞的方式。[0177]5.标记其他细胞，以及发现它们对分泌蛋白的补充。[0178]非人动物[0179]本发明的一些方面涉及能够表达经标记sec61b蛋白的非人动物。在一些实施方案中，经标记蛋白的表达是诱导型的。在一些实施方案中，经标记蛋白具有cre依赖性表达。在一些实施方案中，非人动物在β‑细胞中具有经标记sec16b蛋白的诱导型表达。标记不受限制，并且可为本领域中的任何适合标记。在一些实施方案中，标记是荧光蛋白。在一些实施方案中，标记是绿色荧光蛋白(gfp)。在一些实施方案中，非人动物是小鼠或大鼠。在一些实施方案中，非人动物是糖尿病模型(例如nod1型糖尿病模型、1型糖尿病模型)。[0180]除非有另外指示，否则本发明的实施将通常采用以下领域中在本领域的技能的范围内的常规技术：细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如dna)技术、免疫学以及rna干扰(rnai)。这些技术中的某些的非限制性描述见于以下出版物中：ausubel,f.等人(编)，《分子生物学中的现行方案(currentprotocolsinmolecularbiology)》、《免疫学中的现行方案(currentprotocolsinimmunology)》、《蛋白科学中的现行方案(currentprotocolsinproteinscience)》以及《细胞生物学中的现行方案(currentprotocolsincellbiology)》，全都由纽约约翰威立父子出版公司出版，版本截至2008年12月；sambrook,russell和sambrook，《分子克隆：实验室指南(molecularcloning:alaboratorymanual)》，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，2001；harlow,e.和lane,d.，《抗体‑实验室指南(antibodies–alaboratorymanual)》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，1988；freshney,r.i.，《动物细胞培养，基础技术指南(cultureofanimalcells,amanualofbasictechnique)》，第5版，新泽西霍博肯约翰威立父子出版公司2005。关于治疗剂和人类疾病的非限制性信息见于goodman和gilman的《治疗剂的药理基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)》，第11版，mcgrawhill，2005，katzung,b.(编)《基础和临床药理学(basicandclinicalpharmacology)》，mcgraw‑hill/appleton&lange；第10版(2006)或第11版(2009年7月)中。关于基因和遗传病症的非限制性信息见于mckusick,v.a.：《人类中的孟德尔遗传：人类基因和遗传病症目录(mendelianinheritanceinman.acatalogofhumangenesandgeneticdisorders)》，巴尔的摩约翰霍普金斯大学出版社，1998(第12版)或更新近在线数据库：在线人类中的孟德尔遗传(omimtm)，约翰霍普金斯大学mckusick‑nathans遗传医学研究所(马里兰州，巴尔的摩)和美国国立医学图书馆生物技术信息国家中心(马里兰州，贝塞斯达)，截至2010年5月1日，ncbi.nlm.nih.gov/omim/中，以及作为动物物种中的基因、遗传病症和性状的数据库，在omia.angis.org.au/contact.shtml处的在线动物中的孟德尔遗传(omia)中。本文提及的所有专利、专利申请和其他出版物(例如科学文章、书籍、网站和数据库)都通过引用以它们的整体并入本文。在说明书与任何并入参考文献之间起冲突的情况下，应以说明书(包括其任何修正，所述修正可基于并入的参考文献)为准。除非有另外指示，否则在本文中使用术语的标准本领域接受含义。在本文中使用各种术语的标准缩写。[0181]以下在实施例中阐述本文公开的本发明的某些方面的具体实例。[0182]本领域技术人员易于了解本发明充分适合于实现目标，并且获得提及的结果和优势以及本发明中固有的那些结果和优势。本文中的描述细节和实例代表某些实施方案，是示例性的，并且不意图作为对本发明的范围的限制。本领域技术人员会想到本发明中的修改和其他用途。这些修改涵盖在本发明的精神内。对本领域技术人员显而易知的是，可在不脱离本发明的范围和精神下对本文公开的本发明进行不同替代和修改。[0183]除非有明确相反指示，如本文在说明书中以及在权利要求中所用的冠词“一个(种)”应被理解为包括复数个(种)指示物。除非有相反指示或另外由上下文显而易知，否则如果一个、超过一个或所有群组成员存在于、用于给定产品或过程中，或以其他方式与给定产品或过程相关，那么在群组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书被视为是符合的。本发明包括其中群组的恰好一个成员存在于、用于给定产品或过程中或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。本发明还包括其中超过一个或所有群组成员存在于、用于给定产品或过程中或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。此外，应了解除非有另外指示或除非本领域普通技术人员会显而易知将出现矛盾或不一致，否则本发明提供其中来自所列权利要求中的一者或多者的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等被引入至从属于同一基础权利要求(或当相关时任何其他权利要求)的另一权利要求中的所有变化形式、组合和排列。可以预期的是，在适当时，本文所述的所有实施方案都可应用于本发明的所有不同方面。还可以预期的是，每当适当时，任何实施方案或方面都可与一个或多个其他此类实施方案或方面自由组合。当要素以清单形式，例如以马库什群组(markushgroup)或类似形式呈现时，应了解还公开了所述要素的每个子组，并且任何一个或多个要素都可从群组移除。应了解，一般来说，当本发明或本发明的方面被提及为包含特定要素、特征等时，某些本发明的实施方案或本发明的方面由此类要素、特征等组成，或基本上由此类要素、特征等组成。出于简明的目的，那些实施方案尚未在每种情况下都在本文中一字不差地明确阐述。还应了解本发明的任何实施方案或方面都可从权利要求明确排除，无论是否在说明书中叙述特定排除。举例来说，可排除任何一种或多种核酸、多肽、细胞、生物体的种类或类型、病症、对象、或它们的组合。[0184]当权利要求或说明书涉及物质组合物，例如核酸、多肽、细胞或非人转基因动物时，应了解，除非有另外指示或除非本领域普通技术人员会显而易知将出现矛盾或不一致，否则根据本文公开的任何方法制备或使用所述物质组合物的方法以及出于本文公开的任何目的使用所述物质组合物的方法是本发明的方面。当权利要求或说明书涉及例如一种方法时，应了解，除非有另外指示或除非本领域普通技术人员会显而易知将出现矛盾或不一致，否则制备可用于进行所述方法的组合物的方法以及根据所述方法产生的产品是本发明的方面。[0185]当在本文中给出范围时，本发明包括其中包括端点的实施方案、其中排除两个端点的实施方案、以及其中包括一个端点而排除另一端点的实施方案。除非有另外指示，否则应假定包括两个端点。此外，应了解除非有另外指示或另外由上下文和本领域普通技术人员的理解显而易知，否则在本发明的不同实施方案中，表示为范围的值可表现为所陈述范围内的任何特定值或子范围，达到范围的下限单位的十分之一，除非上下文有另外明确规定。还应了解，当在本文中陈述一系列数值时，本发明包括类似地涉及任何间插值或由所述系列中的任何两个值界定的范围的实施方案，并且最低的值可被取作最小值，并且最大的值可被取作最大值。如本文所用的数值包括表示为百分比的值。对于本发明的其中数值以“约”或“近似”作为开端的任何实施方案，本发明包括其中叙述精确值的实施方案。对于本发明的其中数值不以“约”或“近似”作为开端的任何实施方案，本发明包括其中所述值以“约”或“近似”作为开端的实施方案。“近似”或“约”通常包括数值在任一方向上(大于或小于某一数值)落在1％的范围内，或在一些实施方案中，落在所述数值的5％的范围内，或在一些实施方案中，落在所述数值的10％的范围内，除非另外陈述或另外由上下文显而易知(例外之处是当此数值将不允许地超过可能值的100％时)。应了解，除非有明确相反指示，否则在本文要求保护的包括超过一个动作的任何方法中，方法的动作的顺序未必限于叙述方法的动作所采用的顺序，而是本发明包括其中这样限制顺序的实施方案。还应了解，除非有另外指示或由上下文显而易知，否则本文所述的任何产品或组合物都可被视为是“经分离的”。[0186]***[0187]实施例[0188]实施例1[0189]研究目标：为发现用以医治糖尿病的新型激素[0190]先前开发了用以引导人胚胎或诱导多能干细胞分化成功能性的胰岛素表达性β‑细胞的方案1。这些干细胞源性β‑细胞(sc‑β)可用于研究β‑细胞的发育、β细胞功能和生理学，并且通过细胞移植，它们有可能治疗糖尿病。[0191]包括胰岛素的激素是在控制代谢、细胞分化和疾病方面具有强力作用的分泌蛋白。编码分泌蛋白或跨膜蛋白的mrna穿越粗糙内质网。为鉴定新型分泌蛋白和跨膜蛋白，已开发一种称为内质网测序(er‑seq)的技术，所述技术通过物理分离在内质网的表面处的活跃翻译核糖体来富集分泌/跨膜蛋白的rna。为发现调控葡萄糖代谢的新型激素，将er‑seq方法应用于sc‑β细胞，并且对相关mrna测序。[0192]接着，进行差异性基因表达和基因本体分析以发现sc‑β细胞中所有已知分泌活性物。在这样做时，通过除许多其他分泌蛋白之外还鉴定胰岛素基因来验证技术。分析了不具有赋予的功能或注释的八个基因。因为这些新型基因由sc‑β细胞产生，并且可编码分泌蛋白，所以推断如同胰岛素一样，这些新型基因中的一些可能具有代谢作用。[0193]通过流体动力学尾部静脉(htv)注射质粒dna，使这八个基因在小鼠的肝中以高水平从质粒dna瞬时表达2。为评估这八个基因中的任一者是否影响葡萄糖体内平衡，在注射之后三天，在从肝进行高表达时，进行葡萄糖耐量测试。[0194]注射的八个人基因中的一者，即c1orf127，相比于对照，更快地从血液循环清除葡萄糖(图1a)。葡萄糖水平降低是显著的和可重现的：迄今为止，在超过五十只小鼠中成功测试到c1orf127的葡萄糖降低活性。另外，发现c1orf127能够降低作为一种2型糖尿病模型的膳食诱导肥胖小鼠中的血糖水平。[0195]因为c1orf127在胰岛素产生性β‑细胞中表达，所以提出了它的葡萄糖降低活性是否取决于胰岛素作用的疑问。为测试这个观点，使用作为强力和特异性肽抑制剂以及胰岛素受体的拮抗剂的s9613。当s961被急性施用至小鼠时，它们快速变为高血糖—证明s961在抑制胰岛素受体，以及阻止葡萄糖被摄取至肌肉和脂肪中，由此导致葡萄糖在循环中的净积累方面具有功效。htv注射c1orf127和对照dna，并且在第三天进行葡萄糖耐量测试。对于这个实验，在两个时间点添加s961；第一时间点是在注射葡萄糖之前两小时；并且第二时间点是在测试开始时与葡萄糖团注同时。如图1b中所见，相比于对照，c1orf127可更快地从循环清除葡萄糖。这个数据强烈表明c1orf127不依赖于胰岛素作用来从循环移除葡萄糖。值得注意的是，在这些实验中，c1orf127降低血糖水平而不导致低血糖症，低血糖症是伴随起促进胰岛素分泌的作用的所有已知药物的问题(图1a中的0分钟时间，以及图1b中的d3空腹)。[0196]据预测，c1orf127基因编码具有684个氨基酸的蛋白质(mw73kda)。它是一种在脊椎动物之中高度保守的转录物，缺乏用于分泌或膜插入的典型信号。已通过免疫荧光显微术确认了它在sc‑β细胞和人尸体胰岛中的表达。使用内部表达数据库，发现c1orf127主要在β‑细胞中表达，并且在生长激素抑制素表达性(胰腺δ)细胞中以较低水平表达。在人中，c1orf127还在肌肉和小脑中表达。它的小鼠直系同源物gm572仅在β‑和δ‑(生长激素抑制素)表达性细胞中表达。通过western印迹，发现该蛋白质在sc‑β和人尸体胰岛中以预测分子量表达。此外，搜索2型糖尿病知识门户(精选疾病风险知识库)，并且鉴定了c1orf127中可能对于2型糖尿病的发展或进展至关重要的突变4。[0197]参考文献[0198]1.pagliucafw和millmanjr等人，体外生成功能性人胰岛β细胞(generationoffunctionalhumanpancreaticβcellsinvitro).cell.2014年10月9日，159(2):428‑39[0199]2.chenca等人，对调节葡萄糖控制的分泌蛋白的体内筛查鉴定出作为强力低血糖药剂的白细胞介素‑6家族成员(invivoscreeningforsecretedproteinsthatmodulateglucosehandlingidentifiesinterleukin‑6familymembersaspotenthypoglycemicagents).plosone.2012；7(9):e44600.[0200]3.l等人，一种对胰岛素受体的新型高亲和力肽拮抗剂(anovelhigh‑affinitypeptideantagonisttotheinsulinreceptor).biochembiophysrescommun.2008年11月14日；376(2):380‑3.[0201]4.2型糖尿病知识门户.2018‑09‑10www.type2diabetesgenetics.org/home/portalhome[0202]实施例2[0203]激素的生物发生由在易位子复合物处活跃翻译激素mrna的内质网(er)定位核糖体引导(mandon等人，2013；ogg等人，1995；rapoport等人，2007)。鉴定新型分泌因子和激素的大多数研究已依赖于预测典型拓朴发生信号的算法(diehn等人，2000；emanuelsson等人，2007；等人，2004；meinken等人，2015，petersen等人，2011)。尽管提供了信息，但这些计算预测并不高效，考虑到很大一部分基因是这个功能性类别的一部分(jan等人，2014)。用以表征分泌因子的mrna的互补序列的新近尝试依赖于生物化学分离er定位核糖体(jan等人，2014；fazl等人，2019；reid等人，2014)。然而，这些尝试目前限于酵母和体外癌细胞(jan等人，2014；fazl等人，2019；reid等人，2014)。此处描述了一种用于生物化学分离人多能干细胞(hpsc)和分化子代中的核糖体/易位子复合物的称为er‑seq的方案。将这个方案应用于sc‑β细胞，并且鉴定了不依赖于胰岛素作用来促进葡萄糖清除的先前未表征基因c1orf127。[0204]用于分离核糖体‑易位子复合物的生物化学分级分离方法的开发[0205]因为分泌因子和激素的生物发生在er定位核糖体/易位子复合物中发生，所以推断分离易位子相关mrna将有效富集分泌因子的mrna，并且可充当它们在细胞中的表达的指标(jan等人，2014)。为分离易位子复合物，产生了组成性表达或在胰岛素表达性β细胞中表达易位子复合物的亚单位sec61β的hpsc细胞系，所述sec61β融合于gfp(图2a)。为实现在hpcs和分化子代中的遍在性和组成性表达，talen介导的基因组编辑技术用于将在遍在表达的经人工工程改造的caags启动子的控制下的gfp‑sec61β融合蛋白(caags::gfp‑sec61β；图2b)敲入至aavs1基因座中。类似地，为在胰岛素表达性β细胞中表达这个转基因，crispr用于将gfp‑sec61β融合转基因敲入至内源性胰岛素基因的末个外显子中(ins::gfp‑sec61β；图2c)。在hpsc和sc‑β细胞中，转基因的表达位于细胞核周围，如对于er定位蛋白质所预期(图2b至图2c)。[0206]开发了依赖于细胞膜的差异性溶解性来以逐步方式使质膜和er膜可渗透的方案(图4.2a)。首先，毛地黄皂苷用于使质膜可渗透，并且回收细胞质级分。向不溶性级分中添加含正十二基‑b‑d‑麦芽糖苷(ddm)的低张缓冲液以使被称为er级分的er膜和腔组分可渗透(nichitta等人2014)。在er可渗透化之后，对er级分用抗gfp磁珠进行免疫沉淀以纯化核糖体/易位子复合物和相关mrna(图3a)。将这个方案应用于自我更新hpcs，并且如通过western印迹所测定，相对于未分级分离细胞提取物，在免疫纯化(ip)级分中检测到sec61β和gfp蛋白表达的显著富集(图3b)。重要的是，核糖体蛋白亚单位l13a和核糖体rna亚单位28s和18s也被共同纯化(图3b至图3c)。对免疫纯化er级分进行质谱测定，并且检测到易位子亚单位sec61α、易位子相关蛋白二硫键异构酶(pdi)和多种核糖体蛋白亚单位的肽(图3d)。总之，生物化学方案允许鲁棒和有效富集核糖体/易位子复合物。[0207]er‑seq鲁棒地富集hpsc和sc‑β细胞中分泌因子的mrna。[0208]为确定这个方法是否有效富集编码分泌因子和膜蛋白的mrna，对从hpsc纯化的易位子相关mrna进行微阵列分析。相较于从总体未分级分离细胞提取物收集的mrna，检测到编码er因子sec61α和ddost以及分泌因子诸如bmp7、dll1、col2a1、col7a1以及其他分泌因子的mrna的富集(图4a)。在相对于总体mrna在ip级分中富集的3174个基因之中，检测到989个基因(31.1％)基于典型拓朴发生信号肽预测而被预测是分泌因子或膜蛋白(图4b)。基于对在ip级分中富集的基因的基因本体分析，ip级分中作为内膜系统、囊泡和细胞外组分的一部分的基因存在显著富集(图4c)。还检测到在ip级分中富集的650个基因是未注释的，并且不具有预测定位信号。因为在大多数细胞类型中表达的所有基因中有约10％被预测是分泌型的(uhlén等人，2015)，所以计算分析表明这个方法有效富集在hpsc中表达的分泌因子的mrna。[0209]接着测定er‑seq方案富集高度分泌性β细胞中编码分泌因子的mrna的功效。为此，使用利用ins::gfp‑sec61β细胞系从hpsc产生sc‑β细胞的体外定向分化方案(pagliuca等人，2014)(图5a至图5b)。这允许从处于各种细胞类型的异质混合物中的β细胞分离核糖体/易位子复合物，以及对易位子相关mrna进行rna测序。将方案应用于sc‑β细胞，并且通过对易位子相关mrna的rna测序，鉴定到以下物质的显著富集：激素诸如胰岛素和胰淀素(iapp)、血管生成因子vegfa和vgf、以及胰岛素分泌中涉及的其他基因诸如嗜铬粒蛋白a(chga)、分泌粒蛋白(scg2、scg3、scg5)和突触小泡蛋白(syp)(图5c)。鉴定了相对于总体未分级分离rna在ip级分中富集的2,732个基因(倍数变化>2)。这组基因中的874个基因(32％)基于计算拓朴发生信号预测而被预测是分泌因子或膜蛋白(kall等人，2005)(图5d)。ip富集基因中的17％不具有预测亚细胞定位样式，并且未被注释为核性、细胞质性、分泌性或膜定位性。在被预测是细胞的分泌蛋白质组的一部分的因子之中，检测到相对于总体rna，它们的mrna在ip级分中得以鲁棒富集(图5e)。在ip级分中，注释为核性和/或细胞质性的基因被消减(图5e)。因此，对ip富集基因的基因本体分析表明细胞的内膜系统、er和细胞外部分的一部分的因子得以富集(图5f)。总之，计算分析表明通过er‑seq达成了对分泌因子的mrna的有效富集和定量。[0210]易位子相关mrna的阶段特异性表达样式[0211]对sc‑β细胞中易位子相关mrna的分析揭示可代表在sc‑β细胞中表达的新型分泌因子的大量基因得以富集。为鉴定在β细胞中优先表达的易位子相关基因，将er‑seq方案在β细胞的体外分化的多个阶段应用于细胞。为此，在分化早期阶段期间，依赖于gfp‑sec61β在caags::gfp‑sec61β细胞系中的组成性表达来分离hpsc和它们的分化子代中的易位子相关mrna(图6a)。在分化末期阶段期间，ins::gfp‑sec61β细胞系用于分离胰岛素表达性sc‑β细胞中的易位子相关mrna(图6a)。对在所有分化阶段的易位子相关mrna进行测序，并且鉴定了阶段特异性基因表达特征(图6b)。鉴定了在所有分化阶段都差异性表达的601个基因。发现了为sc‑β细胞所特有的包含139个基因的基因表达特征，其中44个基因被预测是分泌因子。对sc‑β细胞富集基因的基因本体分析显示涉及以下类别的因子得以显著富集：胰岛素分泌、葡萄糖体内平衡、细胞外间隙、分泌颗粒以及与分泌和膜靶向过程相关联的其他类别(图6c至图6d)。相较于较早分化阶段，在sc‑β细胞中，涉及胰岛素分泌以及在内分泌细胞中优先表达的基因得以显著上调(图6e)。引起关注的是，鉴定了也显示为sc‑β细胞所特有的表达样式的11个未注释基因(图6f)。总之，这个分析译解了与体外sc‑β细胞分化相关联的基因表达特征，并且鉴定了在这个细胞类型中优先表达的一组基因。[0212]实施例3[0213]绿色er报告体小鼠[0214]本文开发了一种具有以上所述的acgfp‑sec61b融合蛋白的小鼠cre依赖性报告转基因(rosa‑floxed‑终止信号‑floxed‑acgfp‑sec61b)，并且称为绿色er报告体。这个小鼠已与胰岛素‑cre小鼠杂交以产生内质网发绿色荧光的β‑细胞，从而使得能够应用以上所述的er‑seq技术。这个β‑细胞特异性绿色er品系可被杂交至nod1型糖尿病模型中，从而赋予研究者在疾病的过程期间发现分泌生物标志物的能力。[0215]另外，因为1型和2型糖尿病所共有的一些应激源可能是类似的，所以这个品系可被杂交至2型糖尿病模型诸如ob/ob和db/db模型中。[0216]对于小鼠er‑seq，遗传组成部分是将融合于er易位子的组成组分sec61b的绿色荧光蛋白(gfp)靶向至rosa基因座。在此处，gfp‑sec61b融合蛋白位于经loxp侧接的转录终止信号之后。因此，只有在cre重组酶存在下，转录终止盒才被移除，并且gfp‑sec61b得以表达，从而对cre表达性细胞的er标记以绿色荧光。生物化学组成部分涉及开发用以进行亚细胞分级分离以制备保持mrna‑核糖体‑易位子相互作用的er微粒体的方法。接着进行使用对gfp具有特异性的抗体来使这个复合物沉淀的免疫沉淀。分子生物学组成部分依赖于从复合物提取易位子相关mrna，以及通过rna测序来对这些mrna进行转录分析。[0217]图25a显示靶向载体，以及用以显示转基因可以高保真度标记er的用cre病毒感染的阳性靶向小鼠胚胎干细胞(mesc)集落。这个集落用于制备我们的名为rosa‑floxed‑终止信号‑floxed::绿色er的首建报告体小鼠品系(“绿色er”报告体)。[0218]图25b显示报告体策略的体内验证。绿色er报告体小鼠品系与遍在性cre表达性小鼠(cmv‑cre)杂交。从cmv‑cre/绿色er子代(遍在性绿色er小鼠)产生尾部顶端纤维母细胞，并且显示了所有细胞中的gfp信号都为er所特有(这个图像中的假色黄色)。[0219]图25c显示来自绿色er报告体小鼠品系与β‑细胞cre表达性小鼠(ins2‑cre)之间的杂交子代的胰腺切片。这个品系被命名为β‑细胞绿色er小鼠。重组限于胰岛β‑细胞，并且报告体表达为er所特有。[0220]实施例4‑方法[0221]转基因细胞系的产生[0222]所有实验都使用从哈佛干细胞研究所的人胚胎干细胞研究室和ips核心研究室获得的人胚胎干细胞系hues8进行。将针对胰岛素基因组区域的grna序列连接至ecas9(addgene71814)或lbcpf1(addgene84742)crispr质粒中。通过用侧接于这个区域的引物进行pcr来产生侧接于胰岛素基因的末个外显子中的终止密码子的上游和下游约750bp的同源臂。将5’和3’同源臂连接于2a‑sec61β‑gfp转基因和嘌呤霉素抗生素选择标记。对于产生caags::sec61β‑gfp细胞系，设计talen构建体以靶向安全港aavs1基因座。将5’和3’同源臂连接于2a‑puro(嘌呤霉素抗性基因)、接头和驱动sec61β‑gfp转基因的表达的caags启动子。使用trypleexpress将hues8细胞分散成单细胞，并且使用nucleofector试剂盒(invitrogen)用靶向载体转染。用嘌呤霉素在1μg/ml的浓度下处理电穿孔后72小时的细胞7天以获得单集落。在电穿孔后约18‑21天在显微镜下将集落挑选至96孔板中，并且加以扩增。使用zymoresearchquick‑dna96plus试剂盒来提取来自96孔板的基因组dna(gdna)，并且用pcr确认5’和3’同源臂的插入。经由celllinegenetics利用核型分析来确认为核型正常的克隆用于朝向β细胞的定向分化。[0223]sc‑β细胞的分化[0224]在37℃孵育器、5％co2和100％湿度中，在设置成70rpm的搅拌板(chemglass)上，于500ml旋转烧瓶中，在mtesr1(stemcelltechnologies)中维持人多能干细胞(hpsc)。如下遵循先前描述方案(pagliuca等人，2014)进行向sc‑β细胞的分化：以6x105个细胞/毫升将hues8细胞接种于mtesr1培养基和10μmy27632(sigma‑aldrich)中。48小时后更换培养基，并且在接种细胞之后72小时开始分化。培养基改变如下：[0225]阶段1定形内胚层：在第1天，s1+100ng/ml活化素a(r&dsystems)+3μmchir99021(stemgent)，以及在第2天，s1+100ng/ml活化素a。[0226]阶段2肠管内胚层：第4、6天：s2+50ng/mlkgf(peprotech)。[0227]阶段3胰腺祖细胞1：第7、8天：s3+50ng/mlkgf+0.25μmsant1(sigma)+2μmra(sigma)+200nmldn193189(仅第7天)(sigma)+500nmpdbu(emdmillipore)。[0228]阶段4胰腺祖细胞2：第9、11、13天：s3+50ng/mlkgf+0.25μmsant1+100nmra+10μmy27632+5ng/ml活化素a。[0229]阶段5内分泌祖细胞：第14、16天：s5+0.25μmsant1+100nmra+1μmxxi(emdmillipore)+10μmalk5iii(axxora)+1μmt3(emdmillipore)+20ng/mlβ细胞素(thermofisherscientific)。第18、20天：s5+25nmra+1μmxxi+10μmalk5iii+1μmt3+20ng/mlβ细胞素。[0230]阶段6β细胞：每隔一天进行s3培养基更换。在最后阶段中，在阶段6分化开始之后的第7天与第21天之间对细胞进行分析。[0231]生物化学分级分离方案[0232]从分化旋转烧瓶收集约100x106个细胞。为使核糖体停滞，添加100μg/ml放线菌酮(chx)，并且孵育10分钟。分级分离的所有以下步骤都用含有100μg/ml放线菌酮(sigma‑aldrich)的溶液进行。于pbs/chx中洗涤细胞簇。将4mlaccutase/chx添加至细胞簇的悬浮液中，并且在室温下孵育7分钟。接着通过使用吸移器进行机械离散来将丛簇离散，再悬浮于pbs/chx中，并且以在室温下在230rcf下离心5分钟来集结细胞。将集结块再悬浮于3ml含有以下物质的细胞质缓冲液中：110mm乙酸钾(sigma‑aldrich)、25mmk‑hepes(sigma‑aldrich)、15mm氯化镁(sigma‑aldrich)、4mm氯化钙(sigma‑aldrich)、0.015％毛地黄皂苷、1.0mm二硫苏糖醇(sigma‑aldrich)、100μg/mlchx、1xcomplete蛋白酶抑制剂混合物(millipore)和500u/mlrnasin核糖核酸酶抑制剂(promega)，并且在4℃下孵育20分钟。在4℃、845rcf下将细胞悬浮液离心5分钟，并且在‑80℃下储存上清液(细胞质级分)以进行后续分析。将集结块再悬浮于1ml含有以下物质的er可渗透化低张缓冲液中：20mmhepes、1.5mmmgcl2、0.42mnacl、0.2mmedta、25％甘油、2％正十二基β‑d‑麦芽糖苷(ddm)、1.0mmdtt、100μg/mlchx和1xcomplete蛋白酶抑制剂混合物(millipore)和500u/mlrnasin核糖核酸酶抑制剂(promega)和50μl磁性琼脂糖结合对照珠粒(chromotek)，并且在4℃下头尾旋转孵育1小时。将gfp‑ma‑trap珠粒(chromotek)在冰上在1％bsa‑pbs溶液中封闭至少30分钟。通过上下缓慢移动杵棒15次来使用wheaton玻璃均质器使细胞提取物均质化。在4℃下在850rcf下将提取物离心5分钟。将具有经封闭gfp‑ma‑trap珠粒的管插入dynamag‑2磁性台架(thermofisherscientific)中，并且将溶液丢弃。接着将上清液添加至gfp‑ma‑trap珠粒浆液中，并且在4℃下在头尾旋转下孵育30分钟。将样品插入磁性台架中以收集未结合级分，并且随后将珠粒用500μler可渗透化缓冲液洗涤两次。在洗涤之后，将500μltrizol添加至珠粒中，并且在‑80℃下储存。[0233]rna提取、文库制备和测序[0234]将储存在trizol试剂中的亚细胞级分与每1ml所用trizol试剂0.2ml氯仿结合，并且孵育2‑3分钟，随后在4℃下在12,000rcf下离心15分钟。将含有rna的水相与每1ml所用trizol试剂0.5ml异丙醇结合。在冰上孵育10分钟之后，在4℃下在12,000×g下使rna沉淀10分钟。将集结块在1ml75％乙醇中洗涤，并且风干5‑10分钟。在‑80℃下在rna储存溶液(invitrogen)中储存rna以进行后续分析。[0235]遵循公开方案(hashimshony等人，2012)，对所沉淀rna进行伴随逆转录的体外rna扩增。设计具有锚定多胸苷酸、illumina小型rna试剂盒的5’illumina衔接头和t7启动子的逆转录引物。messageampiirna试剂盒(ambion)与经修饰逆转录引物一起使用(hashimshony等人，2012)。遵循messageampiirna试剂盒的方案，用50ngrna和25ng/μl扩增引物进行反应。通过磁珠分离来用ampurexp珠粒(beckmancoulter)进行cdna净化，用80％etoh进行净化，随后遵循messageampiirna试剂盒的方案进行体外转录持续13小时。在200mmtris‑乙酸盐[ph8.1]、500mmkoac、150mmmgoac中使rna断裂，并且通过放置在冰上以及添加十分之一体积的0.5medta来终止反应，随后进行rna净化。使用生物分析仪(agilent)测定rna品质和产量。使用illumina的定向rna测序方案，并且仅连接3’illumina衔接头。进行延伸时间是30秒的总计12个pcr循环。根据标准方案，使用nextseq500平台(illumina)对文库进行测序。进行双端测序，对于读取1，读取至少15个碱基，并且对于读取2，读取至少50个碱基，并且读取illumina条形码。[0236]转录组学分析[0237]用cutadaptv1.8.1除去通用ilumina衔接物和多腺苷酸序列的读段，并且使用fastqcv0.11.5评估质量控制。采用tophatv2.1.1，使用缺省参数将读段与人参考基因组(hg38)进行比对。用cufflinksv2.2.1进行下游转录物定量和差异性基因表达分析(trapnell等人，2013)。将差异性表达的基因规定为在使用cuffdiff算法的情况下经调整p值低于0.05的那些基因。[0238]基因本体分析[0239]差异性表达的基因(经调整p值<0.05)用于使用webgestaltgsat(wang等人，2017)和独创性路径分析(ipa，qiageninc.，www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity‑pathway‑analysis))进行的基因本体分析。p值<0.05的基因本体术语和富集路径被视为富含差异性表达的基因。[0240]对分泌因子的预测[0241]将从候选转录物翻译的蛋白质序列提交至phobius算法以使用隐马尔可夫模型预测信号肽(kall等人，2005)。将具有预测信号肽但无预测跨膜拓扑结构的转录物分类为细胞的分泌蛋白质组的一部分。独创性路径分析(ipa，qiageninc.，www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity‑pathway‑analysis)还用于将候选转录物分类为细胞质性或核性。[0242]western印迹分析[0243]在移除如上所述的用于rna提取的水相之后，将苯酚‑乙醇再悬浮于每1ml所用trizol试剂1.5ml异丙醇中，并且孵育10分钟。在4℃下在12,000g下离心10分钟之后，将集结块在每1ml所用trizol试剂2ml0.3m盐酸胍95％乙醇溶液中洗涤，在室温下孵育20分钟，随后在4℃下在7500g下离心5分钟。将这个步骤重复两次。最终，添加每1ml所用trizol2ml100％乙醇，并且孵育20分钟。在4℃下在7500g下离心5分钟之后，将集结块风干5‑10分钟，并且再悬浮于200μl1％sds缓冲液中。使用bca蛋白质测定试剂盒(thermoscientific)测量蛋白质浓度。将5‑10μg蛋白质提取物通过anykd小型蛋白质预制凝胶(bio‑rad)来分离，并且转移至硝化纤维素膜(bio‑rad)。在室温下将膜在3％bsa+0.1％吐温20tbs中封闭30分钟，接着在4℃下与以下初级抗体一起孵育过夜：小鼠抗sec61β抗体(santacruz，sc‑393633)、鸡抗gfp抗体(aves，gfp1020)、兔抗核糖体蛋白l13a抗体(cellsignaling，2765)。在洗涤之后，在室温下使膜与hrp缀合的二级抗体一起孵育1小时，接着在化学发光ecl检测试剂(vwr)中孵育以进行信号检测和显色。[0244]4.5.9动物研究[0245]所有动物处理、饲养、程序都根据机构动物护理标准进行。所有方案都由哈佛大学的机构动物护理和使用委员会核准。使用从jacksonlaboratory获得的icr小鼠进行通过尾部静脉注射来对er‑seq候选物的初始筛选。使用来自charlesriverlaboratory的c57bl/6小鼠进行用于表征c1orf127的额外尾部静脉注射，包括s961实验。链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠是从jacksonlaboratory获得的c57bl/6小鼠，stz注射由jacksonlaboratory进行。[0246]候选物克隆[0247]用于所筛选er‑seq候选物的表达质粒首先通过从干细胞源性β‑细胞的cdna文库进行pcr扩增来获得；引物被设计来添加通路克隆位点。由于难以扩增c1orf127，所以从dharmacon购买orf的克隆，并且加以扩增以添加通路位点。将pcr扩增子添加至pdonor通路载体中。接着将orf转移至cag高表达载体(用于尾部静脉注射)中以及慢病毒产生载体(细胞系产生)中。除er‑seq候选物之外，还从integrateddnatechnologies购买作为具有通路位点的定制基因的对照，包括细胞质gfp、核td‑tomato、弗林蛋白酶可裂解胰岛素和纳米萤光素酶。接着将对照克隆至相同载体中。[0248]尾部静脉注射[0249]首先通过腹膜内注射每g体重23μl1.25％阿佛丁(avertin)溶液来使小鼠麻醉。将经麻醉小鼠的尾部在热灯下加温以扩张尾部静脉。经麻醉小鼠历经约7秒接受在尾部静脉中注射每g体重80μl具有35μg表达载体dna的盐水。对于涉及经尾部静脉来注射的小鼠的实验，在注射之后48‑72小时对小鼠进行测试。[0250]标准葡萄糖耐量测试[0251]将小鼠禁食过夜(5pm至9am)。在禁食之前，以及在葡萄糖注射之前立刻，进行血糖测量。小鼠接受以2g/kg体重进行的腹膜内注射葡萄糖。接着在注射后15、30、45、60和90分钟进行血糖测量。偶尔地，如果血糖尚未下降至正常水平以下(<250mg/dl)，那么采集120分钟时间点。[0252]s961葡萄糖耐量测试[0253]将小鼠禁食过夜(5pm至9am)。在禁食之前，在初始s961注射之前立刻，以及在葡萄糖注射之前，进行血糖测量。小鼠接受腹膜内注射每g体重10μl45μms961。在这个初始注射之后2小时，小鼠接受腹膜内注射每g体重10μl30μms961、15％d‑葡萄糖(1.5g/kg葡萄糖)。接着在注射后15、30、45、60、90、120分钟进行血糖测量，然后每小时进行测量直至数值下降至正常以下(<250mg/dl)。[0254]stz葡萄糖耐量测试[0255]在尾部静脉注射之前，在禁食之前，以及在葡萄糖注射之前立刻，进行血糖测量。仅使用患有初始重度高血糖症(>400mg/dl)的小鼠。将小鼠禁食过夜(5pm至9am)。小鼠接受腹膜内注射1.5g/kg葡萄糖。接着在注射后15、30、45、60、90、120分钟进行血糖测量，然后每小时进行测量直至数值下降至正常以下(<250mg/dl)。[0256]统计分析[0257]使用graphpadprism软件进行统计分析。对于两个单独时间点，使用t检验进行葡萄糖耐量比较。anova和杜凯氏多重比较检验用于比较曲线下面积。[0258]参考文献[0259]americandiabetesassociation.(2018)8.血糖治疗的药理学方法：糖尿病的医疗标准(pharmacologicapproachestoglycemictreatment:standardsofmedicalcareindiabetes).2018.diabetescare41,s73–s85.basicandclinicalphysiologyandpharmacology27,445‑456.[0260]benni,j.&patil,p.(2016).胰岛素的非糖尿病临床应用(non‑diabeticclinicalapplicationsofinsulin).journalofbergeonneau,c.,b.,erpeldinger,s.,wright,j.m.,gueyffier,f.,cornu,c.(2011)2型糖尿病中强化降糖治疗对所有病因死亡率、心血管死亡和微血管事件的影响：随机对照实验的整合分析(effectofintensiveglucoseloweringtreatmentonallcausemortality,cardiovasculardeath,andmicrovasculareventsintype2diabetes:meta‑analysisofrandomisedcontrolledtrials).bmj343,d4169.[0261]boussageon,r.,bejan‑angoulvant,t.,saadatian‑elahi,m.,lafont,s.,chen,c.a.,carolan,p.j.,&annes,j.p.(2012)对调节葡萄糖控制的分泌蛋白的体内筛查鉴定出作为强力低血糖药剂的白细胞介素‑6家族成员(invivoscreeningforsecretedproteinsthatmodulateglucosehandlingidentifiesinterleukin‑6familymembersaspotenthypoglycemicagents).plosone7,e44600.[0262]diehn,m.,eisen,m.,botstein,d.,&brown,p.(2000).使用dna微阵列大规模鉴定分泌和膜相关基因产物(large‑scaleidentificationofsecretedandmembrane‑associatedgeneproductsusingdnamicroarrays).nat.genetics25,58–62.[0263]emanuelsson,o.,brunak,s.,vonheijne,g.等人.(2007)使用targetp、signalp和相关工具在细胞中定位蛋白质(locatingproteinsinthecellusingtargetp,signalpandrelatedtools).nat.protoc.,2,953–971.[0264]fazal,f.m.,han,s.,parker,k.r.,kaewsapsak,p.,xu,j.,boettiger,a.n.,chang,h.w.,&ting,a.y.(2019)apex测序揭示了亚细胞rna定位图谱(atlasofsubcellularrnalocalizationrevealedbyapex‑seq).cell178,1–18.[0265]gepts,w.(1965)青少年糖尿病患者胰腺的病理学解剖(pathologicanatomyofthepancreasinjuvenilediabetesmellitus).diabetes14,619–633.[0266]hashimshony,t.,wagner,f.,sher,n.&yanaii.(2012)cel测序：通过多路线性扩增进行单细胞rna测序(cel‑seq:single‑cellrna‑seqbymultiplexedlinearamplification).cellreports2,666‑673.[0267]jan,c.h.,williams,c.c.,&weissman,j.s.(2014)通过近处特异性的核糖体谱揭示了er共翻译易位的原理(principlesofercotranslationaltranslocationrevealedbyproximity‑specificribosomeprofiling).science346,1257521.[0268]kall,l.,krogh,a.,&sonnhammer,e.(2005)用于包括同源信息的序列特征预测的hmm后验解码器(anhmmposteriordecoderforsequencefeaturepredictionthatincludeshomologyinformation).bioinformatics21,i251‑i257.[0269]l.,krogh,a.,sonnhammer,e.l.(2004)一种结合跨膜拓扑结构和信号肽预测的方法(acombinedtransmembranetopologyandsignalpeptidepredictionmethod).j.mol.biol.338,1027–1036.[0270]mandon,e.c.,trueman,s.f.,gilmore,r.(2013)穿越粗糙内质网的蛋白易位(proteintranslocationacrosstheroughendoplasmicreticulum).coldspringharb.perspect.biol.5,a013342.[0271]meinken,j.,walker,g.,cooper,c.,&min,x.(2015).metazseckb：人类和动物的分泌蛋白质组和亚细胞蛋白质组知识库(metazseckb:thehumanandanimalsecretomeandsubcellularproteomeknowledgebase).database,bav077.[0272]ogg,s.c.,walter,p.(1995)srp通过在翻译延伸过程中以不连续步骤与核糖体相互作用对新生链中的信号序列的存在进行采样(srpsamplesnascentchainsforthepresenceofsignalsequencesbyinteractingwithribosomesatadiscretestepduringtranslationelongation).cell81,1075–1084.[0273]pagliuca,f.,millman,j.r.,gürtler,m.,segel,m.,vandervort,a.,ryu,j.h.,peterson,q.p.,greiner,d.,andmeltond.a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