用包含铜化合物的组合物和材料预防和减少皮肤淤滞的方法与流程

本申请涉及皮肤治疗领域。特别地，本申请涉及用包含铜化合物的组合物和材料减少和预防皮肤淤滞的方法。

背景技术：

douglasmacg.jackson在"thediagnosisofthedepthofburning",thebritishjournalofsurgery40(1953),pp.588-596(“烧伤深度诊断”，《英国外科杂志》，第40卷，1953年，第588-596页)中提到，皮肤烧伤的局部反应通常可表征为导致不同程度的三种不同损伤模式，这取决于烧伤的严重程度和原因。最大不可逆损伤点被称为凝结区，因为皮肤蛋白质的凝结会导致组织损失。凝结区周围的区域称为淤滞区，其特征在于组织灌注减少，并且取决于烧伤的严重程度，低血压、感染和/或水肿可能导致该区域变成组织完全损失区域。shehanhettiaratchy和peterdziewulski在"pathophysiologyandtypesofburns",bmj328(7453)(2004),pp.1427-1429(“烧伤的病理生理学和类型”，《英国医学杂志》，第328卷，第7453期，2004年，第1427-1429页)中显示，在脓毒区周围，充血区的特征是灌注增加，除非存在严重脓毒或延长的灌注不足，否则灌注将不断恢复。中间的淤滞区虽然最初是活性的，但随着灌注的减少而死亡，并且伤口的初始大小加深并变宽。

在超过30％的全身表面积的严重皮肤损伤后，损伤部位处细胞因子和其他炎性介质的释放可能导致可能有害的若干全身性反应。这些包括：a)毛细血管通透性显著增加，从而导致血管内蛋白质和流体损失进入间质室，外周和内脏血管收缩以及心肌收缩性降低。这些心血管变化与烧伤伤口的流体损失相关联，导致全身性低血压和末梢器官灌注不足；b)支气管收缩和潜在的呼吸窘迫综合征；c)基础代谢率增加其原始代谢率的至多三倍；以及d)非特异性细胞介导的免疫应答和体液免疫应答下调。

araa.salibian等人在"currentconceptsonburnwoundconversion.areviewofrecentadvancesinunderstandingthesecondaryprogressionsofbums.",burns42(5)(2016),pp.1025-1035(“烧伤伤口转化的最新概念：近年来对烧伤继发性进展认识的回顾”，《烧伤》，第42卷，第5期，2016年，第1025-1035页)中表明，淤滞区是可挽救的烧伤表面的治疗关键部分。防止伤口损伤进展和扩大到更大和更深的区域可能具有重要的局部和全身性后果，这可能显著降低并发症和发病率。因此，开发能够阻止伤口烧伤损伤后淤滞区进一步恶化的疗法可能是患者稳定后和皮肤重建前烧伤伤口治疗的重要方式。

铜是在几乎所有身体组织中参与许多细胞、代谢和生理过程的必需微量元素。neenaphilips等人在"stimulationofcellproliferationandexpressionofmatrixmetalloproteinase-1andinterluekin-8genesindermalfibroblastsbycopper",connectivetissueresearch51(3)(2010),pp.224-229(“铜刺激真皮成纤维细胞中的细胞增殖以及基质金属蛋白酶-1和白细胞介素-8基因的表达”，《结缔组织研究》，第51卷，第3期，2010年，第224-229页)中表明，铜能够刺激皮肤中的真皮成纤维细胞增殖。此外，neenaphilips等人在"beneficialregulationoffibrillarcollagens,heatshockprotein-47,elastinfibercomponents,transforminggrowthfactor-beta1,vascularendothelialgrowthfactorandoxidativestresseffectsbycopperindermalfibroblasts",connectivetissueresearch53(5)(2012),pp.373-378(“铜在真皮成纤维细胞中对纤维状胶原、热休克蛋白-47、弹性蛋白纤维组分、转化生长因子-β1、血管内皮生长因子和氧化应激作用的有益调节”，《结缔组织研究》，第53卷，第5期，2012年，第373-378页)中显示，皮肤中的铜增强成纤维细胞产生和分泌不同类型的胶原蛋白和弹性蛋白。

而且，已经表明铜在皮肤细胞外基质一旦形成时就能够使其稳定，充当超氧化物歧化酶即一种存在于皮肤中、对于防护自由基非常重要的抗氧化酶的辅助因子，充当赖氨酰氧化酶即一种催化皮肤细胞外基质中赖氨酸衍生交联的酶的辅助因子，并且抑制细胞氧化作用，诸如膜损伤和脂质过氧化。然而，铜离子对减少皮肤烧伤的淤滞的惊人效果还不为人所知。现在本发明人已发现了这种效果并且这构成了本发明的基础。

摘要

本申请描述了一种用于减少和预防受损皮肤淤滞的方法的实施方案，该方法包括将包含水溶性或水不溶性铜化合物的组合物或材料施用于所述受损皮肤。在一些实施方案中，组合物为水溶性铜化合物的水溶液或水不溶性铜化合物在水中、在溶剂中或在它们的混合物中的悬浮液。该组合物呈液体、喷雾、凝胶、软膏或粉末的形式。

在其他实施方案中，所述材料为织造或非织造织物、泡沫、针织织物或用于制造伤口敷料、膏药、纱布等的任何类型的织物。该材料浸渍有约0.1-10％w/w的水不溶性铜颗粒或涂覆有约0.1-10％w/w的水不溶性铜颗粒。

在另外的实施方案中，所述水不溶性铜颗粒具体地为碘化亚铜(cui)或氧化亚铜(cu2o)颗粒。实施方案的示例性材料为浸渍或涂覆有约1-3％w/w的碘化亚铜(cui)颗粒的织造织物，或者浸渍或涂覆有约1-3％w/w的cu2o颗粒的无菌伤口敷料。

在又一个实施方案中，所述组合物呈包含水溶性铜化合物的液体喷雾或软膏的形式。实施方案的示例性水溶性铜化合物为硫酸铜(cuso4)或氯化铜(cucl2)。

在另一个实施方案中，所述材料呈聚合物膜、纤维、长丝或外皮的形式。实施方案的示例性聚合物膜包括选自聚酯、聚丙烯、聚乙烯、尼龙66、尼龙6、聚酰胺和聚氨酯的聚合物。本实施方案的聚合物材料包含直接嵌入所述膜、纤维、长丝或护套内部的粉末形式的铜化合物的水不溶性颗粒，其中所述颗粒的一部分从膜、纤维、长丝或护套的表面暴露并突出，或者所述聚合物材料涂覆有水溶性铜化合物或铜化合物的水不溶性颗粒。本实施方案的铜化合物的示例性水不溶性颗粒选自粉末形式的碘化亚铜、氧化亚铜和氧化铜或它们的组合。

各种实施方案可允许各种益处，并且可结合各种应用来使用。在附图和以下描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。通过说明书和附图以及从权利要求书，所描述的技术的其他特征、目的和优点将是显而易见的附图简要说明

通过以下结合附图的详细描述，将更充分地理解和领会所公开的实施方案。本文所包括和描述的附图是示意性的，并且不限制本公开的范围。还应注意，在附图中，一些要素的大小可能被放大，因此出于说明目的而未按比例绘制。尺寸和相对尺寸未必对应于实践本公开的实际缩减。

图1a和图1b分别示意性示出了本发明的离体外植体模型的侧视图和俯视图。

图2a示出了在受伤后不同天数处外植体的烧伤面积的实验生成图。

图2b示意性地示出了具有带淤滞区的烧伤区域的外植体。

图2c示出了仅用盐水(对照)和用铜离子(0.2μm碘化亚铜和0.2μm氧化亚铜)处理的外植体的照片。

图3a、图3c和图3e分别示出了未处理皮肤外植体(无处理对照)和受伤后受伤皮肤外植体(烧伤对照)中人离体皮肤中烧伤诱导的炎症中的细胞因子表达以及il-6、il-8和tgf-β分泌之间的比较。

图3b、图3d和图3f分别示出了与无处理对照以及受伤后第4天(图3b和图3d)和第6天(图3f)的烧伤对照相比添加铜离子(0.02μm或1μm)对il-6、il-8和tgf-β分泌的影响。

图4a-图4c分别示出了受伤后第0、6和27天皮肤组织的组织学染色样品。

具体实施方式

在以下描述中，将描述本申请的各个方面。出于解释的目的，阐述了具体的配置和细节以便提供对本申请的透彻理解。然而，对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，可在没有本文所呈现的具体细节的情况下实践本申请。此外，可省略或简化众所周知的特征，以免模糊本申请。

权利要求书中使用的术语“包括”是“开放式的”，并且意指所列举的要素或它们在结构或功能上的等同物，加上未列举的任何其他要素。不应将其解释为限于此后列出的方法；它不排除其他要素或步骤。需要将其解释为指定所提及的所述特征、整体、步骤或组件的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整体、步骤或组件或其群组的存在或添加。因此，表述“包含x和z的材料”的范围不应限于仅由化合物x和z组成的材料。同样，表述“包括步骤x和z的方法”的范围不应限于仅由这些步骤组成的方法。

除非特别说明，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的两个标准偏差内。在一个实施方案中，术语“约”意指在所使用数字的所报告数值的10％内，优选地在所报告数值的5％内。例如，术语“约”可立即理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。在其他实施方案中，术语“约”可意指更高的变化容限，这取决于例如所使用的实验技术。所述特定值的变化是本领域技术人员所理解的，并且在本发明的范围内。作为说明，“约1至约5”的数值范围应被解释为不仅包括明确列举的约1至约5的值，而且包括在所示范围内的单个值和子范围。因此，在该数值范围内包括的是单个值，例如2、3和4，以及子范围，例如单独地1-3、2-4和3-5，以及1、2、3、4、5或6。同样的原理适用于仅将一个数值叙述为最小值或最大值的范围。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。其他类似的术语，诸如“基本上”、“通常”、“至多”等应被解释为修饰术语或值，使得其不是绝对的。此类术语将由环境和它们所修饰的术语来定义，如那些术语被本领域技术人员所理解的。这至少包括对于给定实验、技术或用于测量值的仪器的预期实验误差、技术误差和仪器误差的程度。

如本文所用，术语“和/或”包括相关联的所列项目中的一者或多者的任何和所有组合。除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。还应当理解，诸如在常用词典中定义的那些术语应当被解释为具有与它们在说明书和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过于正式的意义来解释，除非在此明确地如此定义。为了简洁和/或清楚起见，可能不会详细描述众所周知的功能或构造。

本申请提供了一种用于预防和减少受损皮肤淤滞的方法，该方法包括将包含铜化合物的组合物或材料施用于所述受损皮肤。所述组合物可为水溶性铜化合物的水溶液或水不溶性铜化合物在水中、在溶剂中或在它们的混合物中的悬浮液。所述组合物可以例如呈液体、喷雾、凝胶、软膏或粉末的形式。所述材料可为织造或非织造织物、泡沫、针织织物或用于制造伤口敷料、膏药、纱布等的任何类型的织物。

在一些实施方案中，该材料浸渍有约0.1％-10％的水不溶性铜颗粒。在其他实施方案中，该材料涂覆有约0.1％-10％的水不溶性铜颗粒。本实施方案的材料中使用的水不溶性铜颗粒的示例为碘化亚铜(cui)和氧化亚铜(cu2o)颗粒。在一个具体实施方案中，该材料为浸渍有约1％-3％重量/重量的水不溶性cu2o颗粒的无菌伤口敷料。在一个具体实施方案中，该组合物呈包含水溶性铜化合物例如硫酸铜(cuso4)或氯化铜(cucl2)的液体喷雾或软膏的形式。

在一个具体实施方案中，包含铜化合物的材料为聚合物膜、纤维、长丝或护套。用于聚合物膜的聚合物选自聚酯、聚丙烯、聚乙烯、尼龙66、尼龙6、聚酰胺和聚氨酯。在一个具体实施方案中，该聚合物材料包含直接嵌入所述膜、纤维、长丝或护套内部的细微水不溶性铜化合物颗粒，诸如粉末形式的氧化亚铜(cu2o)和/或氧化铜(cuo)，其中所述颗粒的一部分从膜、纤维、长丝或护套的表面暴露并突出。在另一个具体实施方案中，所述聚合物材料涂覆有铜化合物的水不溶性颗粒。嵌入或涂覆有铜化合物的材料在与受损皮肤接触时能够释放cu(i)离子、cu(ii)离子或它们的组合。

实施例

离体模型

人体皮肤是在接受知情同意后从接受腹部皮脂切除术的健康捐献者那里获得的。使用皮肤刀(aesculapag&co.kg,tuttlingen,germany(德国图特林根的埃斯库拉普工厂股份公司))收获0.5mm厚的皮肤移植物，并将其切成1cm的块。通过暴露于烙铁(95℃，2s)，在0.7cm皮肤片上造成直径为25mm的圆形烧伤伤口。将一式三份的块保持完整作为无处理对照。将损伤的和完整的皮肤样品真皮向下置于不锈钢网格上，并在37℃和5％co2处在气-液界面上在杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)、10％胎牛血清(biologicalindustries,beitha'emek,israel(以色列拜特·海默克的生物工业公司))和青霉素/链霉素(100iu/ml青霉素，100mg/ml链霉素；invitrogen)中培养。培养基每周更新两次。在受伤后将外植体培养至多27天。用从相同个体获得的皮肤外植体进行每个单个实验，并且实验重复至少三次。

现在参考图1a和图1b，其分别示意性地示出了这种离体外植体模型的侧视图和俯视图。将皮肤外植体真皮向下置于不锈钢网格上。将培养基添加到孔的底部，但没有到达暴露于空气的表皮层。将3μl仅盐水或含不同浓度铜溶液的盐水小心地添加到烧伤区域的顶部及其周围，并确保其不会到达孔底部的培养基。

铜源及其在皮肤外植体上的应用

作为铜离子源，使用了两种物品：浸渍有约1％碘化铜颗粒的织造织物和浸渍有约1％重量/重量氧化亚铜颗粒的无菌伤口敷料。在使用前，使用uv光对碘化铜浸渍的织物进行消毒。将0.84克碘化铜浸渍的织物和3.6克氧化亚铜浸渍的伤口敷料在25ml0.9％的盐水中在37℃处浸渍过夜。通过使用aquachektm铜离子测试条测定培养基中所得的铜离子浓度，并且这些溶液用作铜离子储备溶液，在下文中分别被标识为碘化铜溶液和氧化亚铜溶液，以清楚地识别铜离子源。由储备溶液在盐水中制备0.02μm或1μm铜离子的溶液。然后在烧伤区域顶部上的皮肤外植体和烧伤区域周围的表皮上，在第0天添加3μl的仅盐水、0.02μm或1μm铜溶液，然后每两天添加一次，确保它们不到达室中的培养基，而是停留在皮肤顶部的空气界面上。每个对照和处理均在至少三个重复的外植体中进行。

活力的测量

为了评估整个培养期间的细胞活力，在受伤后的不同天数如下进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(mtt)测定：

生物测定

在收获时间点期间，收集来自所有测试组的用过的培养基，并以1500×g离心5分钟以去除颗粒。培养基保持在-80℃处直至使用。根据制造商的说明书(biolegend,sandiego,ca(加利福尼亚圣地亚哥的biolegen公司))，通过商购酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒测量il-6、il-8和tgf-β的分泌水平。简而言之，在测定前，将板用特异性抗人捕获抗体包被24小时。在测定的当天，将包被板与样品一起温育，然后洗涤未结合的分子。然后添加另外的检测抗体，并用抗生物素蛋白-hrp溶液检测。最后，将孔与底物溶液一起温育，同时在570nm处测量吸光度。

统计分析

实验值表示为三次重复的平均值，并提供了平均值的标准误差(sem)。使用未配对的t-检验分析值之间的显著差异，而p<0.05显示出显著结果。

实验结果

现在参考图2a，其示出了在受伤后不同天数处外植体的烧伤面积的实验生成图。示出了处理组和未处理烧伤对照组之间的p值。图2b示意性地示出了具有带淤滞区的烧伤区域的外植体。图2c示出了仅用盐水(对照)或用0.02μm铜离子处理的外植体的实际图片。处理之间伤口大小的差异，尤其是在瘀滞区中，在图2c中清晰可见。在离体外植体培养期间，在仅暴露于盐水或暴露于从两种测试溶液获得的0.02μm或1μm铜离子生长的烧伤皮肤外植体之间，没有测量到代谢活性的显著差异，如通过mtt测定所确定的(数据未示出)。

从图2a中可以看出，用仅盐水处理的烧伤伤口显著增加，在受伤后三天变大近40％，然后在受伤后14天开始逐渐减小，达到初始伤口大小。相反，用从碘化铜或氧化亚铜颗粒获得的0.02μm铜离子处理的伤口大小几乎没有变化。统计上，在受伤后三天，用含有0.02μm铜离子的盐水处理的伤口的大小要比仅用盐水处理的伤口小，并且在受伤后第5天和第10天，在用铜处理的外植体中测量到类似地较小伤口。如图2c中清楚地看到的，在铜处理的外植体中烧伤后大小没有增加的皮肤区为淤滞区。

为了进一步了解铜离子的添加如何影响皮肤外植体，测定了在各种处理的外植体的培养基中发现的白细胞介素6(il-6)、白细胞介素8(il-8)和转化生长因子β(tgf-β)的量。图3a、图3c和图3e示出了未处理皮肤外植体(无处理对照)和受伤后受伤皮肤外植体(烧伤对照)的人离体皮肤中烧伤诱导的炎症中的细胞因子表达以及il-6、il-8和tgf-β分泌之间的比较。在这些图中，示出了受伤后每特定天数细胞因子表达之间的t检验的p值。

还参考图3b、图3d和图3f，其分别示出了与无处理对照以及受伤后第4天(仅用盐水处理)(图3b和图3d)和第6天(图3f)的烧伤对照相比添加铜离子(0.02μm或1μm)对il-6、il-8和tgf-β分泌的影响。在图中，星号指示与无处理对照相比的统计学显著差异，而净号“#”指示与未处理(仅用盐水处理)的烧伤对照相比的统计学显著差异。

如图3a中所见，与无处理对照相比，烧伤对照在受伤后一天和四天后il-6分泌明显增加。向烧伤外植体添加来自cui储备溶液的0.02μm或1μm铜离子和来自cu2o储备溶液的1μm铜离子消除了外植体il-6分泌的增加，并且实际上导致与无处理对照的il-6分泌相比甚至减少的il-6分泌(参见图3b)。类似地，受伤后第4天烧伤对照中il-8和tgf-β与无处理对照相比的统计学显著增加(分别参见图3c和图3e)当烧伤伤口暴露于来自两种铜源的0.02μm或1μm铜离子时显著减弱或消除(参见图3d和图3f)。

现在参考图4a-图4c，其分别示出了在第0、6和27天皮肤组织的组织学染色样品。在第0天(参见图4a)，对皮肤外植体造成烧伤。图4a中的上部图像代表正常的健康皮肤。下部图像代表造成烧伤后立即受损的皮肤组织。表皮与真皮分离(如实线箭头所示)。

在第6天(图4b)和第27天(图4c)，用实线箭头指示在用或没用铜离子处理的情况下造成烧伤后旧的、分离的表皮。仅在铜离子处理后，在第27天注意到上皮再形成(参见图4c)，如条纹箭头所示。在指定的时间点上将样品固定，并用masson三色染料进行组织学染色。组织学分析表明，仅在经铜离子处理的样品中发生明显的上皮再形成(参见图4c，条纹箭头)。

尽管本文已经说明和描述了本申请的某些特征，但是许多修改、替换、改变和等效形式对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落入本申请的真实实质内的所有此类修改和改变。