嗜酸衣藻提取物、其制备方法及含有其的美容学组合物和皮肤病学组合物与流程

本发明涉及微藻嗜酸衣藻的肽提取物和包含该提取物的美容学、皮肤病学或药学组合物。本发明还涉及一种用于提取嗜酸衣藻的肽提取物的方法，以及通过所述方法获得的提取物。本发明还涉及一种组合物或该提取物，其用于预防或治疗皮肤、粘膜或皮肤附属器的疾病或病理，用于预防或治疗血管疾病，或用于预防或治疗脂肪组织的改变。最后，本发明涉及一种用于皮肤、粘膜或皮肤附属器的美容护理的方法，目的是改善它们的状况或它们的外观，其包括施用该组合物或该提取物。

背景技术：

微藻(microalgue)

微藻是单细胞真核生物，具有光合作用，因此与高等植物一样，除了磷、硝酸盐等其他营养物质外，它们还能够利用空气中的二氧化碳进行新陈代谢。它们是最早定殖地球的物种之一。大约有30000种被描述的物种，但据信还有更多。微藻以其自然状态存在于世界各地的淡水、微咸水和咸水中。

微藻可以根据本领域技术人员已知的方法进行培养，例如在光、ph和营养控制环境中的光反应器中，并且它们具有许多出路。它们与高等生物一样，能够合成蛋白质、碳水化合物和脂质。一些脂质是特殊的，例如复杂的脂肪酸或具有特殊生物学特性的色素(叶黄素)。它们因可能生产生物燃料而变得非常受欢迎，并且它们在生物反应器中的生产已经扩大。其它出路多种多样：鱼饲料(水族馆和养鱼场)、食品和人类健康(从雨生红球藻(haematococcuspluvialis)中提取的虾青素、螺旋藻蛋白质)以及美容行业的一些出路。

现有技术-嗜酸衣藻(chlamydomonasacidophila)

绿藻纲的嗜酸衣藻(科：衣藻科)是一种绿色淡水微藻，可在酸性很强的水(ph2.3至3.4)中增殖，并且可适应富含重金属的环境。特别地，它首先在阿根廷的火山湖中被鉴定和收集。据说它富含植物螯合肽(能够螯合金属的特殊结构)和类胡萝卜素(β-胡萝卜素、叶黄素)。除了有关其可能的培养和发育条件(对极端ph值和重金属的耐受性)的出版物外，几乎没有关于其组成和用途的信息。它的“表亲”莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)被用作不同科学领域如遗传学的模型生物。

技术实现要素：

申请人已经发现，微藻嗜酸衣藻的肽提取物表现出以前从未描述过的美容学、药理学和皮肤病学特性。特别地，这种嗜酸衣藻提取物因其特殊性质而被如此使用是第一次。

本发明涉及微藻嗜酸衣藻的肽提取物。

在本发明的意义上，“肽提取物”是指主要包含肽的提取物。

在本发明的意义上，“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。肽的特征特别在于分子量介于200和10000道尔顿(da)之间，包括端值。

有利地，根据本发明的嗜酸衣藻提取物包含按重量计至少20％的肽，百分比表示相对于所述提取物的总重量。特别地，根据本发明的提取物包含按重量计20％至90％，有利地20％至75％，更有利地30％至70％，典型地65％的肽，百分比表示相对于所述提取物的总重量。

有利地，根据本发明的嗜酸衣藻提取物基本上不含任何蛋白质，特别是任何残留的天然蛋白质。除了其他方面，这避免了过敏反应并提高了根据本发明的提取物的溶解度和生物利用度。

在本发明的意义上，“蛋白质”是指由一条或多条多肽链形成的生物大分子。这些链中的每一条都由通过肽键连接在一起的氨基酸残基序列组成。蛋白质的特征特别在于分子量大于10000道尔顿(da)。

有利地，根据本发明的嗜酸衣藻提取物基本上不含游离氨基酸。游离氨基酸的分子量小于200da。

在根据本发明的嗜酸衣藻的肽提取物中，肽有利地具有小于3500道尔顿(da)的分子量。有利地，这些肽涵盖了提取物中最初存在的所有基于氨基酸的化合物。

有利地，在根据本发明的提取物中，至少80％，更有利地至少90％的肽具有小于1000da的分子量。

有利地，在根据本发明的提取物中，至少30％的肽，更有利地至少35％，更有利地至少40％的肽具有小于500da的分子量。

肽的分子量分布表示为总肽浓度的百分比。

在本发明的上下文中，嗜酸衣藻的肽提取物有利地通过酶水解获得，更有利地在至少一种蛋白酶的存在下获得。根据本发明的提取物更有利地通过以下说明书中描述的方法获得。

本发明还涉及一种制备微藻嗜酸衣藻的肽提取物的方法，其包括至少一个酶水解步骤。该步骤有利地在本领域技术人员已知的最佳ph和温度条件下进行，特别是在与所用酶相关的最佳ph和温度条件下进行。

有利地，所述酶水解步骤在至少一种蛋白酶的存在下进行。所述蛋白酶可以有利地是碱性蛋白酶或酸性蛋白酶，有利地其是碱性蛋白酶。

有利地，根据本发明，制备嗜酸衣藻肽提取物的方法至少包括以下步骤：

a)微藻嗜酸衣藻的水相分散体；

b)步骤a)中获得的水分散体的酶水解；

c)步骤b)中获得的混合物的热处理；和

d)在步骤c)结束时肽提取物的回收。

在步骤a)中，水相有利地是水。此外，水相分散体中的微藻嗜酸衣藻的含量有利地为微藻的干提取物当量的0.1％至20％，更有利地为1％至10％。

酶处理(步骤b)有利地通过加入至少一种蛋白酶来进行，有利地在本领域技术人员已知的最佳ph和温度条件下，例如在3.0和9.0之间的ph并且典型地在20℃和90℃之间的温度进行。特别地，酶处理包括加入碱性或酸性蛋白酶，有利地是碱性蛋白酶。

根据本发明的方法的酶水解步骤非常重要，因为它转化或“切割”存在于嗜酸衣藻中的天然蛋白质以获得肽。

在本发明的上下文中，酶水解步骤随后有利地是热处理步骤以使酶变性。该热处理步骤有利地在高于40℃的温度进行，典型地在80℃和100℃之间进行。

在步骤d)中，肽提取物有利地通过提取步骤c)结束时获得的分散体来回收，有利地伴随搅拌，有利地在3.0和9.0之间的ph和在20℃和90之间的温度进行。

有利地，所述方法包括步骤c)和d)之间的额外过滤或离心步骤，任选地随后是超滤(ultrafiltration)、渗滤(diafiltration)或纳滤(nanofiltration)。

过滤或离心步骤，任选随后是膜超滤或渗滤，用于去除残留蛋白质。例如，纳滤步骤用于去除矿物盐或游离氨基酸。

根据本发明的方法有利地包括在步骤c)和d)之间进行的15kda，有利地在10和15kda之间的超滤步骤，其用于去除任何潜在的过敏性残留蛋白质。

有利地，根据本发明的方法还包括在超滤步骤之后的纳滤步骤，例如，截止阈值介于100道尔顿和300道尔顿之间，有利地介于130和300道尔顿之间，典型地介于200道尔顿和300道尔顿之间，以去除一些氨基酸或矿物盐。有利地，所述纳滤步骤在200da膜上进行。

然后可以通过加入适合稳定化的不同比例的溶剂，如甘油或二醇如1,3-丙二醇，在物理学和微生物学上稳定获得的水性水解物，即根据本发明的肽提取物。有利地，甘油将单独存在或与水或二醇组合存在，有利地以相对于肽提取物和溶剂的总重量，按重量计40％至95％，优选50％至90％的比例存在。类似地，二醇和优选1,3-丙二醇将有利地单独存在或与水或甘油组合存在，有利地以相对于肽提取物和溶剂的总重量，按重量计40％至95％，优选地50％至90％的比例存在。因此，本发明进一步涉及一种组合物，其包含根据本发明的嗜酸衣藻的肽提取物，用于物理学和微生物学上稳定作用的有效量的选自甘油、二醇及其混合物的溶剂，和任选的水。所述用于物理学和微生物学上稳定作用的有效量如上所述。

存在一种替代方案，其中可以通过本领域技术人员已知的方法，在载体例如麦芽糖糊精或阿拉伯树胶纤维(来自cni公司的fibregum(r))存在或不存在下，通过干燥来稳定肽提取物。载体含量典型地根据相对于以提取物的液体形式获得的干物质的百分比，比例范围为0％至80％的载体而变化。提取物可以通过雾化、冷冻干燥或本领域技术人员已知的任何方法进行干燥，并且优选通过冷冻干燥来干燥以获得最终粉末。最终粉末有利地包含按重量计30％至70％的提取物干物质，至100％的其余是冷冻干燥载体。更有利地，最终粉末包含50％来自提取物的干物质和50％冷冻干燥载体，所述冷冻干燥载体优选为麦芽糖糊精或阿拉伯树胶纤维类型。

优选地，例如，肽提取物可以根据以下方法获得：

a)微藻嗜酸衣藻在水中的溶液，其含量为约10％干提取物当量的微藻；

b)通过碱性蛋白酶(来自lyven公司的alcalase)的酶水解；

c)热处理使酶变性；

c')离心、在15kda膜上超滤和渗滤，以消除潜在的过敏性残留蛋白质；

c")200da膜纳滤以去除例如矿物盐或游离氨基酸；和

d)在步骤c")结束时获得的肽提取物的回收。

在根据本发明的方法的上下文中，用作原料的嗜酸衣藻微藻可以是来自开放环境中的培养物，例如在“水道”(用于孵化场饲养的椭圆轨道形槽)中，或来自封闭环境中，在光生物反应器中的培养物。有利地，用作原料的所述微藻来源于光生物反应器中的培养物，特别是搅拌槽光生物反应器中的培养物。更有利地，用作原料的所述微藻是来源于水平管波浪式通风搅拌槽光生物反应器中的培养物，例如由microphyt公司开发并特别描述在专利申请fr2943685和国际申请wo2011/058267中的那些。

本发明还涉及可通过如上所述的方法获得的嗜酸衣藻提取物。该提取物符合以上定义的规定。

本发明还涉及美容学、皮肤病学或药学组合物，其包含嗜酸衣藻的肽提取物作为活性成分，并且如果需要，包含合适的赋形剂。

有利地，根据本发明的组合物中，嗜酸衣藻的肽提取物如上所定义，或者可通过如上所述的方法获得。因此，所述提取物有利地为在以上涉及根据本发明的提取物本身的段落所定义，或者在以上涉及可通过本发明的方法获得的提取物的段落所定义。

所述组合物有利地配制成外部局部、阴道或口服施用。

有利地，根据本发明的组合物包含基于组合物的总重量，以干提取物表示的重量计0.001％至10％，有利地0.01％至5％的所述嗜酸衣藻的肽提取物。

根据本发明的组合物可以进一步包含一种或多种其它活性成分。

根据第一个替代方案，各种制剂适合局部施用，并且特别包括霜剂、乳液(émulsion)、乳剂(lait)、软膏剂、洗剂、油剂、水性或水醇或二醇溶液、粉末剂、贴剂、喷雾剂、洗发剂、清漆溶剂或任何其它用于外部应用的产品。并且根据以下替代方案，各种制剂特别包括私密卫生护理，口腔护理，例如牙膏、口服溶液、牙龈凝胶。

根据其性质(美容学、药学或皮肤病学)，根据本发明的组合物可以进一步包含至少一种美容学、药学或皮肤病学上可接受的赋形剂。特别地，根据本发明的组合物可以进一步包含至少一种本领域技术人员已知的美容学、药学或皮肤病学上可接受的佐剂，其选自表面活性剂、增稠剂、防腐剂、香料、染料、化学或矿物过滤剂、保湿剂、地热水等。本领域技术人员通过使用他或她的一般知识知道如何调整根据本发明的组合物的制剂。

根据本发明的组合物的最佳剂量和盖仑制剂形式可以根据在建立适合患者或动物的药理学、皮肤病学或美容学治疗时通常考虑的标准来确定，例如，患者或动物的年龄或体重、他或她一般状况的严重程度、对治疗的耐受性、观察到的副作用以及皮肤类型。

本发明还涉及根据本发明的提取物或通过根据本发明的方法获得的提取物或根据本发明的组合物，其用于预防和/或治疗：

-皮肤和/或粘膜(例如牙龈、牙周组织、生殖器粘膜)和/或皮肤附属器(例如头发和指甲)的疾病或病理；

-血管疾病；和

-脂肪组织的改变。

本发明还涉及根据本发明的提取物或通过根据本发明的方法获得的提取物或根据本发明的组合物在制备美容学、药学或皮肤病学组合物中的用途，所述美容学、药学或皮肤病学组合物用于预防和/或治疗：

-皮肤和/或粘膜(例如牙龈、牙周组织、生殖器粘膜)和/或皮肤附属器(例如头发和指甲)的疾病或病理；

-血管疾病；和

-脂肪组织的改变。

本发明进一步涉及一种方法，其用于预防和/或治疗：

-皮肤和/或粘膜(例如牙龈、牙周组织、生殖器粘膜)和/或皮肤附属器(例如头发和指甲)的疾病或病理；

-血管疾病；和

-脂肪组织的改变，

所述方法包括向需要其的受试者施用，特别是局部施用，有效量的根据本发明的提取物或通过根据本发明的方法获得的提取物或根据本发明的组合物。

特别地，根据本发明的提取物或通过根据本发明的方法获得的提取物或根据本发明的组合物旨在预防和/或治疗皮肤、未成熟的、正常的或成熟的/老化的皮肤附属器(头发和指甲)和/或粘膜(牙龈、牙周组织、生殖器粘膜)的屏障或内稳态的过敏性、炎症性、刺激性反应或病理或疾病。

有利地，根据本发明的组合物或提取物可用于预防和/或治疗：

-皮肤的反应、疾病或病理，例如痤疮、红斑痤疮(rosacée)或红斑病(érythrocouperose)、银屑病、血管疾病、尿布疹、特应性皮炎、湿疹、接触性皮炎、刺激性皮炎、过敏性皮炎、脂溢性皮炎(乳痂)、银屑病、敏感性皮肤、反应性皮肤、干性皮肤(干燥病)、脱水皮肤、发红皮肤、皮肤红斑(l'érythème)、老化或光老化皮肤、光敏性皮肤、色素性皮肤(黄褐斑、炎症后色素沉着等)、色素脱失性皮肤(白癜风)、有脂肪团的皮肤、松弛的皮肤、有妊娠纹的皮肤、结痂、皲裂皮肤、刺痕、龟裂(特别是乳房的龟裂)、晒伤、各种射线引起的炎症、化学、物理(例如孕妇应激)、细菌、真菌或病毒、寄生虫(虱子、疥癣虫、癣、螨虫、皮肤癣菌)或放射剂引起的刺激，或先天性(抗微生物肽)或获得性(细胞、体液、细胞因子)免疫缺陷，和/或

-粘膜的反应、疾病或病理，例如，可能出现牙龈炎(新生儿敏感的牙龈、卫生学问题、由于吸烟或其它原因)、牙周病的牙龈和牙周组织；或可能出现外部或内部男性或女性生殖器区域的刺激的生殖器粘膜，和/或

-皮肤附属器的反应、疾病或病理，例如，未成熟的、正常的或成熟的指甲(脆弱易碎的指甲等)和头发(脱发、头皮屑、多毛症、脂溢性皮炎、毛囊炎)，表现为特别是头皮的疾病，例如雄激素性、急性、局部性、疤痕性、先天性或婴儿枕部脱发(或脱毛)，斑秃、化疗/放疗相关的脱发或休止期脱发、生长期脱发、毛发营养不良、拔毛癖、癣或油腻或干燥的头皮屑。

本发明还涉及皮肤和/或皮肤附属器和/或粘膜的美容护理方法，目的是改善它们的状况和/或它们的外观，所述方法包括施用根据本发明的提取物或通过根据本发明的方法获得的提取物或根据本发明的组合物。

特别地，美容护理方法通过在皮肤和/或皮肤附属器和/或粘膜上的局部途径有利地使皮肤紧致并减少“橘皮”效应。

特别地，本发明涉及一种用于皮肤和/或皮肤附属器的美容护理方法，以作用于皮肤的弹性或紧致，特别是作为张力剂(agenttenseur)或抗皱剂，以作用于敏感皮肤或对抗污染，所述方法包括将根据本发明的组合物或提取物施用于皮肤和/或皮肤附属器。

特别地，本发明涉及一种用于皮肤和/或皮肤附属器的美容护理的方法，目的是防止屏障受损及其脱水，所述方法包括将根据本发明的组合物或提取物施用于皮肤和/或皮肤附属器。

本发明涉及目的是防止老化的美容护肤方法，所述方法包括将根据本发明的组合物或提取物施用于皮肤。

根据本发明的组合物或提取物还可有利地用于预防和/或治疗血管疾病，特别是发红(rougeur)和红斑痤疮(couperose)。

根据本发明的组合物或提取物还可有利地用于预防和/或治疗脂肪组织的改变。脂肪组织的改变特别是脂肪团或“橘皮”效应。根据本发明的组合物紧致皮肤。

可以通过以下实施例以非限制性方式说明本发明。

附图说明

图1表示红斑强度测量结果：活性剂/安慰剂/未处理区域比较。ns：非显著性差异。*：p<0.05(实施例3b)。

图2表示血流量随时间的变化(实施例3b)。

图3表示在d0和d28获得的pie结果的图解(实施例3c)。

图4表示在d0和d28获得的水合结果的图解(实施例3c)。

图5表示在d0和d28定量的nmf量的图解(实施例3c)。

图6表示在d0和d28定量的神经酰胺的量的图解(实施例3c)。

图7表示在d0和d28定量的il1ra的量的图解(实施例3c)。

图8表示在d0和d28的尼罗红/外皮蛋白比例的图解(实施例3c)。

具体实施方式

实施例

实施例1：根据本发明的提取物

根据以下方法获得肽提取物：

a)10％干物质的微藻嗜酸衣藻在水中的溶液；

b)通过碱性蛋白酶(来自lyven公司的alcalase)的水解；

c)在80℃和100℃之间的温度热处理以使酶变性；

c')离心、在15kda膜上超滤和渗滤，以消除潜在的过敏性残留蛋白质；

c″)200da膜纳滤以去除矿物盐或游离氨基酸或单糖；

d)肽提取物的回收；

e)在甘油/1,3-丙二醇混合物中的稳定。

由此得到的液体肽提取物具有以下特征：

1–理化分析(％/总干物质)

干提取物(2小时，105℃，通风炉)：1.2％

ph：5.1

α–氨基氮(opa，亮氨酸当量)：29％

肽(凯氏定氮法，nx6.25)：70％

总灰分：4％

2–肽分子量分布情况

小于500da：40％

500–1000da之间：55％

1000–3500da之间：4％

大于3500da：1％

实施例2：根据本发明的提取物的生物活性测试(体外)

如下所述，在体外证明了实施例1中获得的嗜酸衣藻(cap)提取物的生物活性。

这些体外研究显示了cap提取物在以下方面的潜能：

-加强皮肤屏障(特别是脂质屏障)；

-通过透明质酸合成、nmf产生和渗透剂转运通路的皮肤水合作用；

-针对非特定应激或与大气污染相关的应激的抗氧化和抗炎防御；

-抗衰老作用，特别是通过保持真皮基质的内稳态；

-过敏机制。

i.对真皮成纤维细胞和黑化重建表皮的活性的初步筛选

通过对真皮成纤维细胞和黑化重建表皮的基因表达调节试验考察嗜酸衣藻提取物的潜在生物活性。因此，通过pcr阵列在成纤维细胞和黑化重建表皮上研究了96个主要在皮肤和美容生理学中感兴趣的基因的表达。

a.材料和方法：

将0.05％干物质的嗜酸衣藻(cap)提取物加入到正常人真皮成纤维细胞(nhdf)或黑化重建人表皮的培养基中。

孵育6或24小时后，通过定量rt-pcr(taqman微流控卡)评估所选标记物的表达。与对照相比，所研究标记物的表达变化表示为相对量(qr，qr>1：增加，qr<1：减少)。

b.结果：

显示cap提取物对重建表皮中基因表达的作用的最显著结果列于下表1中。

表1：黑化重建人表皮中感兴趣基因表达的变化

与对照相比的相对数量(qr)＝1/根据学生t检验确定的p值

这些结果倾向于表明嗜酸衣藻提取物通过改变某些标记物的基因表达，可能在以下活动中特别感兴趣：

表皮屏障功能中的脂质合成和重构：

-用cap处理6小时后，编码葡萄糖神经酰胺酶或β-葡萄糖脑苷脂酶的gba/gbap1基因过表达。

-rab11a编码参与角质形成细胞板层体的生物发生的gtp酶(ras相关蛋白质rab-11a)。这突出了rab11a在表皮屏障内稳态中的重要性。

透明质酸生物合成和表皮水合作用：

-透明质酸合成酶-2和-3(has2和has3)是负责合成透明质酸(ha)的酶。

-slc6a6在表皮的棘层和颗粒层中的逐渐表达保持了表皮在干燥环境中必要的水合作用。

-padi1、blmh和casp14基因编码参与生产天然保湿因子(nmf)的酶。

下表2显示了cap提取物对成纤维细胞中基因表达的最显著结果。

表2：正常人真皮成纤维细胞(nhdf)中感兴趣基因表达的变化

与对照相比的相对数量(qr)等于1/根据学生t检验确定的p值

这些结果显示cap提取物在以下领域的潜在活性：

皮肤抗衰老：

-真皮中的成纤维细胞产生的三种透明质酸合成酶，has1、has2(5.760.008)和has3负责透明质酸(ha)的生物合成。

-此外，已表明皮肤老化与成纤维细胞增殖减少有关。观察到增殖因子ki-67的表达随着年龄的增加而降低[ma等人br.j.dermatol,164(3),pp.479–482]。cap活性剂在处理24小时后增加mki67的表达，证明细胞增殖可能增加，从而加强其抗衰老作用。

-已经表明皮肤中核纤层蛋白b1(lmnb1)的表达会随着年龄的增长而下降。

抗氧化防御：

-nad(p)h脱氢酶，醌1(nqo1)是一种受转录因子nrf-2控制的胞质黄素蛋白。nqo1通过还原促进从醌形成对苯二酚，防止产生自由基。

-hsp70蛋白(由hspa1a基因编码)是一种伴侣分子(热休克蛋白70)，其抑制变性蛋白的聚集，促进其复性(重折叠)并控制凋亡机制的基本介质。

-硫氧还蛋白系统是主要的抗氧化防御系统之一。在硫氧还蛋白还原酶的3种异构体中，研究最多的是由cap提取物调控的txnrd1基因编码的异构体1。

-除硫氧还蛋白系统外，还存在过氧化物酶/硫氧还蛋白系统。在过氧化物酶中，过氧化物酶-6(prdx6)在通过cap提取物处理24小时后过度表达。这表明活性剂对过氧化物的存在具有解毒作用。

-最后，cap提取物刺激glo1基因，该基因是glo系统的一部分，可检测和中和某些羰基，从而防止它们攻击细胞及其成分。

真皮基质内稳态：

-cap提取物刺激psmb1的表达，psmb1是编码蛋白酶体β1亚基的基因。通过去除可能改变细胞功能的受损或畸形蛋白质，蛋白酶体在维持蛋白质内稳态方面发挥着重要作用。

-loxl2的基因表达也增加，该基因是赖氨酰氧化酶家族的一部分，是参与弹性蛋白和胶原纤维组装的酶。

ii.抗炎作用

a.针对pma化学应激的抗炎活性

a.介绍：

炎症反应是身体对任何环境攻击的正常、即时和短暂的应答。

然而，在某些病理或生理条件下，这种炎症反应可能会加剧，如果控制不当，可能会导致组织损伤。

在皮肤中，角质形成细胞是最早参与响应环境攻击而引发炎症反应的细胞之一。

“受到攻击”的角质形成细胞随后会释放：

-初级细胞因子(il1α、il1β或tnfα)或次级细胞因子(il8)，它们将诱导涉及免疫系统的级联反应。

-前列腺素(pge)，其是前列腺素类家族的成员。导致pge2和其它pge合成的前列腺素合成通路是由炎症刺激诱导的。

在通过pma(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)处理在角质形成细胞上诱导的炎症模型上评估根据本发明的嗜酸衣藻提取物的抗炎活性。分析了细胞因子tnfα和前列腺素e2(pge2)的释放。

b.材料和方法：

将正常人表皮角质形成细胞用根据实施例1的嗜酸衣藻(cap)提取物以0.0001％至0.05％干物质的浓度预处理24小时，或用0.1μm的抗炎参照分子地塞米松或0.1μm的吲哚美辛预处理24小时(后面两个参照物分别作为细胞因子和前列腺素的抗炎参照物)。

然后通过加入10μg/ml的pma过夜诱导炎症。

然后在细胞培养上清液中进行tnfα和pge2测定。

结果的显著性通过单因素方差分析和随后的tuckey检验(graphpadprism软件版本5.02，graphpadsoftware，美国吉利福尼亚圣迭戈)进行检查。

c.结果：

10μg/ml的pma显著增加了角质形成细胞上清液中tnfα的释放，因此确实诱发了炎症。0.1μm地塞米松和0.1μm吲哚美辛，作为24小时预处理，确实减少了tnfα的释放，证明了它们的抗炎作用并验证了该测试。

不同浓度的嗜酸衣藻提取物，作为24小时预处理，显著降低了tnfα的释放，因此对pma显示出抗炎作用。

表3：用pma刺激的正常人角质形成细胞中的tnf-a测定

$$$p<0.001vs对照/***p<0.001vspma–单因素方差分析和随后的tuckey检验

10μg/ml的pma显著增加角质形成细胞上清液中pge2的释放，因此pma确实诱发了炎症。0.1μm的吲哚美辛和地塞米松，作为24小时的预处理，显著降低了pge2的释放。因此，这两个参照物的抗炎作用得到了很好的验证。

两种浓度的嗜酸衣藻提取物，作为24小时预处理，显著降低pge2的释放，因此对pma显示出抗炎作用。

表4：用pma刺激的正常人角质形成细胞中的pge2测定

$$$p<0.001vs对照/**p<0.01；***p<0.001vspma–单因素方差分析和随后的tuckey检验

d.讨论：

通过嗜酸衣藻提取物在炎症条件下对tnfα和前列腺素e2释放的作用证明了嗜酸衣藻提取物的抗炎作用。

b.对抗镍应激的抗炎活性

a.介绍

镍是人群中过敏性接触性皮炎的主要原因，全球患病率约为8.6％。如下所述研究的目的是评估cap提取物对镍刺激的角质形成细胞释放il8的作用。

b.材料和方法

将正常人表皮角质形成细胞用0.01％和0.05％干物质的cap提取物或1μm的抗炎参照分子地塞米松预处理24小时。然后用10μm的镍：niso4处理角质形成细胞24小时。在孵育结束时，通过elisa在上清液中评估细胞产生的il8的量。

将测定的il8浓度归一化为通过bc测定评估的总细胞内蛋白质的量。

结果的显著性通过学生t检验进行统计分析。

c.结果

cap提取物显著减少由镍应激引起的角质形成细胞中il8的释放。

表5：niso4–刺激的正常人角质形成细胞中的il8测试

d.结论

在镍诱导的炎症应激情况下，嗜酸衣藻(cap)提取物抑制主要细胞因子il8的释放。因此，该提取物在与镍相关的接触性过敏或皮肤过敏的情况下很受关注。

c.对抗镉应激的抗炎活性

a.介绍

本研究的目的是在正常人角质形成细胞上评估嗜酸衣藻(cap)提取物对抗以镉为代表的重金属应激的抗炎活性。

b.材料和方法

将正常人表皮角质形成细胞用0.001％和0.01％干物质的cap提取物或0.1μm的抗炎参照分子吲哚美辛预处理24小时。然后用100μm的镉：cdcl2处理角质形成细胞48小时。在孵育结束时，通过elisa在上清液中评估细胞产生的peg2的量。

将测定的peg2浓度归一化为通过bc测定评估的总细胞内蛋白质的量。

c.结果

cap提取物诱导角质形成细胞中镉应激诱导的pge2释放减少。

表6：镉刺激的正常人角质形成细胞中的pge2测定

d.结论

嗜酸衣藻(cap)提取物可抑制镉应激诱导的前列腺素e2(pge2)的产生。因此，例如在环境污染的情况下，该提取物可以保护皮肤对抗重金属应激。

d.对抗sds应激的抗炎活性

a.介绍

通过在重建表皮上的十二烷基硫酸钠(sds)处理诱导的炎症模型上评估嗜酸衣藻(cap)提取物的抗炎活性。

b.材料和方法

在0.01％和0.05％干物质的cap存在下，将重建人表皮(rhe)预孵育24小时。然后将0.025％的sds应用到表皮的表面，再次在cap提取物的存在下将其孵育24小时。

在孵育结束时，通过elisa测定上清液中的细胞因子肿瘤坏死因子α(tnfα)。

通过qrt-pcr评估炎症和屏障标志物的基因表达。

结果的显著性通过单因素方差分析和随后的tuckey检验进行统计学分析。

c.结果

重建表皮的sds处理在基因水平(qrt-pcr，表8)和蛋白质水平(elisa，表7)诱导tnfα表达增加。这种促炎作用还伴随着角蛋白1(krt1)表达的降低(表8)，证明表皮屏障功能受损。

在这些条件下，cap提取物显著抑制tnfα的过度产生并增加了角蛋白-1的表达。

表7：sds刺激的重建人表皮产生的tnfα的测定

表8：sds刺激的重建人表皮中的基因表达

*p<0.05；***p<0.001–单因素方差分析和随后的tuckey检验

d.结论

这些结果证实了嗜酸衣藻提取物的抗炎潜力，并显示其保护屏障免受外部应激的能力。

iii.抗氧化

a.介绍

对根据实施例1嗜酸衣藻提取物进行的基因表达筛选显示出刺激抗氧化防御的潜力；通过测量受到h2o2诱导的氧化应激的角质形成细胞中活性氧(ero或ros)的产生来评估保护细胞免受氧化应激的能力。

通过将dcfh-da(2',7'-二氯荧光素二乙酸酯)掺入到培养的角质形成细胞中来评估活性剂的抗氧化作用。该分子是非氧化状态下的非荧光标志物。在氧化条件下(此处为h2o2应激)，dcfh-da将降解为dcf，一种会发出荧光的分子。测量的荧光将与细胞在h2o2和/或提取物存在下产生的活性氧的量成正比。

b.材料和方法

在0.0001％干物质的cap提取物、10μm槲皮素或500μm维生素c(后面两种分子作为抗氧化剂参照物)存在下，将正常人表皮角质形成细胞预孵育24小时。

然后在0.5mmdcfh-da存在下将细胞处理1小时。

通过加入100μmh2o2诱导氧化20分钟。使用待测产品的第二次处理与h2o2应激同时进行(与预处理的浓度相同)。

最后，使用酶标仪测量与ero量相对应的荧光强度(dfu)。

结果的显著性通过单因素方差分析和随后的tuckey检验(graphpadprism软件版本5.02，graphpadsoftware，美国吉利福尼亚圣迭戈)检查。

c.结果

在h2o2处理后观察到ero产生的增加，验证了该模型。槲皮素和维生素c在h2o2处理后显著降低ero的产生。这两个参照物的抗氧化作用在该模型上得到很好的验证。

嗜酸衣藻提取物显著降低h2o2应激诱导的ero的产生。

表9：过氧化氢(h2o2)处理的角质形成细胞中活性氧(ero)的产生

***p<0.001–单因素方差分析和随后的tuckey检验

d.结论：

嗜酸衣藻提取物已证明对h2o2诱导的应激具有抗氧化作用。

iv.对于屏障和水合作用的活性

a.介绍

对嗜酸衣藻提取物进行的如上所示的基因表达筛选显示出对参与屏障和水合作用的基因标志物的表达的刺激的潜在作用。我们试图证实这种对角质形成细胞的作用。

b.材料和方法

在0.001％干物质的cap提取物存在下，将正常人表皮角质形成细胞孵育48小时。

通过qrt-pcr评估屏障功能和水合标志物的基因表达。

结果通过单因素方差分析和随后的dunnett检验进行统计学分析。

c.结果

嗜酸衣藻提取物刺激分别参与表皮脂质和透明质酸合成的标志物gba(β-葡糖脑苷脂酶)和has3(透明质酸合成酶-3)的基因表达。这些结果有利于增强表皮渗透屏障和水合作用，证实在基因表达筛选情况下观察到的趋势。

此外，嗜酸衣藻提取物还刺激分别编码taut(牛磺酸膜转运子通道)和smit(肌醇转运子通道)的标志物slc6a6和slc5a3的表达。

这两个基因编码渗透剂转运子，因此参与维持皮肤水合作用和保护细胞免受外部应激。

最后，提取物诱导丝聚蛋白(flg)和padi1(肽基精氨酸脱亚胺酶)、参与天然保湿因子(nmf)元素合成的蛋白质和酶的基因表达的增加。

表10：角质形成细胞中屏障和水合作用标志物的基因表达

*p<0.05–单因素方差分析和dunnett检验

d.结论

这些结果显示嗜酸衣藻提取物具有增强皮肤屏障和维持皮肤水合作用的潜力。

v.过敏机制中嗜酸衣藻提取物作用的评价

a.介绍

在以下方面考察了嗜酸衣藻提取物的潜在抗过敏作用：

-由模拟晚期“特应性皮炎”类型表型(慢性炎症)的th2细胞因子(il-4+il-13+il-22+tnf-α)混合物刺激的正常人表皮角质形成细胞(nhek)中促炎趋化因子的基因表达。

-fmlp诱导的人嗜碱性粒细胞的活化。使用特定试剂盒和流式细胞术分析，通过定量由ccr3标志物的表达鉴定的嗜碱性粒细胞总数中的活化嗜碱性粒细胞(cd63)的特定标志物来测量这种活化。平行地，进行抗-fcεri抗体的活化作为阳性对照。

b.th2应激后对趋化因子的抑制

a.材料和方法

在0.01％干物质(ms)的cap提取物或10μm参照jak抑制剂i存在下，将正常人表皮角质形成细胞预孵育24小时。预孵育后，将细胞用cap提取物或参照物重新处理，然后用th2细胞因子混合物(10ng/ml的il4+il13+il22+tnfα)刺激细胞24小时。

在孵育结束时，通过qrt-pcr评估感兴趣的标志物的基因表达。

b.结果

在受到th2应激的角质形成细胞中，嗜酸衣藻提取物抑制ccl5(c-c基序趋化因子配体5或rantes)和ccl27(c-c基序趋化因子配体27)(编码参与皮肤炎症和过敏反应放大的趋化因子)的基因表达。

表11：经受th2应激的表皮角质形成细胞中的基因表达

c.结论

嗜酸衣藻提取物通过抑制趋化因子ccl5和ccl27的基因表达来调节角质形成细胞中th2应激诱导的炎症。

c.抑制嗜碱性粒细胞活化

a.材料和方法

嗜碱性粒细胞活化试验(bat)使用flow试剂盒(产品编号fkccr)进行。

在0.033％和0.1％干物质(ms)的cap提取物或参照物(30μm的sb202190；或10mm的色甘酸)存在下，将全血预孵育15分钟。

然后加入1μmfmlp刺激物，在含有单克隆抗体(抗cd63-fitc和抗ccr3-pe)混合物的标记缓冲液存在下，将血液再孵育15分钟。

然后进行流式细胞术分析以对嗜碱性粒细胞(ccr3+)和活化的嗜碱性粒细胞(ccr3+/cd63+)的总数进行计数。

b.结果

用fmlp肽的刺激导致嗜碱性粒细胞非常明显的活化(40.1％活化的细胞，或4527％刺激)。

在本研究中，在fmlp存在下测试了2种潜在的参照化合物：

-sb202190，一种p38map激酶抑制剂；这种激酶的活化对于导致脱颗粒的嗜碱性粒细胞的活化机制至关重要；

-色甘酸，一种已知的抗过敏剂，其作用机制涉及稳定质膜，在该处抑制ca⁺⁺的细胞内渗透，该离子对于肥大细胞脱颗粒至关重要。

sb202190(以30μm测试)和色甘酸(以10mm测试)均显示对fmlp诱导的嗜碱性粒细胞活化的显著抑制作用(分别为26％和46％抑制)。

在本研究的实验条件下，以0.033％和0.1％测试的cap提取物对fmlp诱导的嗜碱性粒细胞活化显示出明显的浓度依赖性抑制作用(分别为22％和39％抑制)。

表12：在fmlp刺激条件下化合物对人嗜碱性粒细胞活化的作用

用抗ccr3和抗cd63双重标记后的流式细胞术分析

学生t检验

c.结论

嗜酸衣藻提取物抑制嗜碱性粒细胞活化。

d.结论

一方面通过抑制经受th2应激的角质形成细胞中趋化细胞因子的基因表达，另一方面通过抑制嗜碱性粒细胞的活化，嗜酸衣藻提取物可以有助于调节参与过敏反应启动的过程。

实施例3：根据本发明的提取物的临床试验

实施例1中获得的嗜酸衣藻(cap)提取物的生物学活性通过如下所述的临床研究证实。

所有这些结果都证明了“cap”活性剂的显著效果，例如：

-保护作用；

-屏障效应；

-保湿效果；和

-抗炎/抗发红作用。

这些临床研究强调了cap提取物在预防或治疗以下疾病方面的潜力：

-敏感型皮肤；

-发红；

-炎症；和

-过敏。

a.临床结果总结

化学红斑研究

cap活性剂(3％活性物质)已证明在以下参数上具有显著功效：

-应用0.1％烟酸甲酯溶液后20分钟的最大红斑强度

与未处理区域相比，在用活性剂处理的区域中，由tivi测量的血流强度显著降低。

与未处理区域相比，在用活性剂处理的区域，用分光色度法测量的发红显著降低。

-最大强度红斑后30分钟红斑的变化

与未处理区域相比，在用活性剂处理的区域中，由tivi测量的血流强度降低显著更高。

与未处理区域相比，在用活性剂处理的区域中，通过分光色度法测量的发红减少显著更多。

敏感型皮肤研究

cap活性剂(3％活性物质)已证明在以下参数上具有显著功效：

-仪器测量

活性剂：

-应用28天后显著减少经皮水分流失。

-应用28天后显著减少发红。

-应用28天后显著增加水合作用。

生物化学评价

活性剂：

-应用28天后显著增加nmf的量。

-应用28天后显著补偿在安慰剂区域观察到的神经酰胺的减少。

-应用28天后显著减少il1ra的量。

-应用28天后显著降低il1α的量。

-应用28天后显著降低il1ra/il1α比例。

-应用28天后显著减少il8的量。

b.通过tivi评估血流和通过分光色度计评估颜色来评估活性剂与安慰剂的保护/抗发红/抗炎功效

研究涉及：

-双盲研究。

-随机、活性剂与安慰剂对比研究

群体：

本研究分析了十九(19)名受试者。19名受试者在2个确定的区域应用活性剂和安慰剂。还定义了未处理区域。

本研究招募的个体是：

-18至60岁的健康女性，平均年龄38±3岁，最小：18岁，最大：60岁

-白种人，光型i至iii皮肤

使用的方法和研究的实施：

受试者自己在家中，每天两次(早上和晚上)，从d-14到d0t0，持续14天，在前臂的每个确定的区域上应用产品。14天后，受试者返回临床病房。然后进行基础d0t0测量。进行产品的最终应用。然后用0.1％的烟酸甲酯溶液在每个区域诱导化学红斑。然后在红斑诱导后表示为d0t20的20分钟(最大强度)和表示为d0t50的50分钟(最大红斑后30分钟)后对每个区域进行测量。

为每个评估的参数分析两个参数：

-d0t20和d0t0之间的变化，其反映了每种产品对红斑外观的预防效果。

-d0t50和d0t20之间的变化，其反映了每种产品对红斑变化的预防效果。

通过tivi评价血流

tivi700使用的方法基于这样一个事实，即绿光被血管细胞强烈吸收，而红光被适度吸收。通过使用偏振光源，该方法不考虑镜面反射而只考虑皮肤组织反射的光。设备产生一个强度图，每个像素代表皮肤中血细胞的浓度。

→皮肤中血细胞浓度强度的降低反映了抗炎作用。

结果：对红斑出现的预防作用

图1a、1b和1c中的图形表示针对烟酸甲酯应用后20分钟由tivi测量的红斑强度的活性剂、安慰剂和未处理区域之间的成对比较。纵坐标参数表示血流强度(红细胞浓度)。确切的数值在下表13a和13b中(表13a和b：表现出阳性作用的受试者％的测量的平均值和标准偏差。差异％和p值(显著性的精确值)。

图2中的图形显示了血流量值随时间的变化。

→结果表明，与未处理区域相比，活性剂显著降低了产生的红斑的强度。安慰剂区域的红斑强度与处理区域没有差异。与安慰剂相比，活性剂区域的红斑强度显著降低。

表13a

表13b

c.通过tewamètre评估经表皮水分流失，通过角化仪(cornéométrie)评估水合作用，通过擦拭评估生化特性，评估活性剂与安慰剂的功效

研究设计：

-双盲研究

-活性剂vs安慰剂，随机、半脸比较研究

群体：

关于水合作用、经皮水分流失、颜色的测量和问卷，36名受试者被纳入分析。

关于生化分析，10名受试者被纳入分析。

本研究招募的个体是：

-健康女性，18岁以上，平均年龄51±3岁，最小：21岁，最大：68岁

-白种人皮肤，光型i至iv

-面部皮肤敏感(受试者的皮肤必须对以下3种应激中的至少2种做出反应：环境、化学或机械)

使用的方法和研究的实施：

在d0：

·纳入和非纳入标准的验证

·适应30分钟

·每半张脸上的测量区域的定义

·仪器测量和生物样品

在d0和d28之间：

·每天两次(早上和晚上)半张脸应用活性剂和安慰剂

在d28：

·适应30分钟

·仪器测量和生物样品

经皮水分流失的评估

皮肤屏障通过蒸发调节水分流失。当这个屏障被破坏时，经皮水分流失增加。相反，增强的屏障对应于较低的经皮水分流失。

通过tewamètretm300测量经皮水分流失。其原理是通过位于2个不同高度的2个传感器测量管(其中一个开口应用于皮肤)中的温度和相对湿度。然后使用菲克定律来确定经皮水分流失。

在d0和d28获得的pie测量结果在表14中给出。图3中给出了变化的说明。

表14：在d0和d28的经皮水分流失值。变化百分比和统计。

获得的结果表明，使用活性剂和安慰剂，pie在d0和d28之间显著降低。使用活性剂观察到的在d0和d28之间的变化与使用安慰剂观察到的变化的比较在统计学上显著地有利于活性剂。

水合作用评估

通过cm825角化仪进行皮肤水合作用的测量。该仪器基于电容测量原理，可以测量皮肤表层(10至20μm深)的水合作用。

在d0和d28获得的水合作用结果在表15中给出。图4中给出了变化的说明。

获得的结果表明，使用活性剂，d0和d28之间的水合作用显着增加，而使用安慰剂，其没有变化。使用活性剂观察到的d0和d28之间的变化与使用安慰剂观察到的变化的比较在统计学上显著地有利于活性剂。

表15:在d0和d28的水合作用的值。变化百分比和统计。

生化评估

进行了以下生化评估：

从擦拭样本：

·通过液相色谱法偶联uv检测(lc/uv)确定天然保湿因子(nmf)。nmf的量包括尿刊酸(uca)、吡咯烷酮羧酸(pca)和丝氨酸。nmf含量提供有关皮肤水合作用状态的信息。

·通过液相色谱法偶联质谱检测(lc/ms)确定神经酰胺。神经酰胺的量包括具有[s]、[ds]和[p]碱基的神经酰胺。神经酰胺含量提供有关皮肤屏障状态的信息。

·通过量化细胞因子(通过elisa)确定炎症状态：

οil1ra

οil1α

οil8

来自d–squames样本：

·尼罗红/外皮蛋白染色

nmf

在d0和d28获得的nmf的结果在表16中给出。图5中给出了变化的说明。

获得的结果表明，使用活性剂，nmf的量在d0和d28之间显著增加，而安慰剂显著降低这个量。使用活性剂观察到的在d0和d28之间的变化与使用安慰剂观察到的变化的比较在统计学上显著地有利于活性剂。

表16：在d0和d28的nmf的量的值。变化百分比和统计。

神经酰胺

在d0和d28获得的神经酰胺的结果在表17中给出。图6给出了变化的说明。

获得的结果表明，使用安慰剂，神经酰胺的量减少，活性剂补偿了这种减少(在d0和d28之间的变化对于安慰剂和活性剂并不显著)。使用活性剂观察到的在d0和d28之间的变化与使用安慰剂观察到的变化的比较在统计学上显著地有利于活性剂。

表17：在d0和d28的神经酰胺的量的值。变化百分比和统计。

il1ra

在d0和d28获得的il1ra的结果在表18中给出。图7给出了变化的说明。

获得的结果表明，使用活性剂和安慰剂，il1ra的量在d0和d28之间显著降低。使用活性剂观察到的在d0和d28之间的变化与使用安慰剂观察到的变化的比较在统计学上显著地有利于活性剂。

表18：在d0和d28的il1ra量的值。变化百分比和统计。

尼罗红/外皮蛋白比例

在d0和d28获得的尼罗红/外皮蛋白比例的结果在表19给出。图8给出了变化的说明。

获得的结果表明，使用活性剂和安慰剂，尼罗红/外皮蛋白比例在d0和d28之间没有显著变化。使用活性剂观察到的在d0和d28之间的变化与使用安慰剂观察到的变化的比较在统计学上显著地有利于活性剂。

表19：在d0和d28的尼罗红/外皮蛋白比例的值。变化百分比和统计。