来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备抑菌剂中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备抑菌剂中的应用。

背景技术：

水产养殖是人类重要的食物来源，随着集约化，规模化养殖的发展，水产病害频发成了困扰水产养殖业发展的瓶颈之一。杀鲑气单胞菌是一种条件致病菌，主要感染冷水性养殖鱼类，导致鲑鳟以及龟鳖等经济鱼类发生疖疮病或溃疡病。无乳链球菌引发罗非鱼产生链球菌病制约了罗非鱼产业链的健康发展。迟缓爱德华氏菌能引起包括牙鲆，大菱鲆和等重要经济鱼类发生出血性败血症。柱状黄杆菌引发的细菌性烂鳃病是一种危害极广的全球性水产养殖病害，对草鱼，鳜鱼等重要经济鱼类的养殖造成了巨大的经济损失。传统养殖过程中，使用抗生素是最常见的治疗细菌病的方法，但是近年来由于抗生素的滥用，越来越多的病原微生物对传统抗生素产生了耐药性。所以，遵循“预防为主”的养殖病害防控理念，应用生物技术方法研制安全性更高，有利于预防细菌病原的抗菌蛋白药物具有较高的生产意义。

凝集素(lectin)通过“蛋白—碳水化合物”作用在病原识别中发挥重要的功能。本研究中，从鳜鱼上克隆得到了一种半乳糖凝集素(galectin),半乳糖凝集素是研究的较为广泛的s-凝集素，主要通过非常保守的半乳糖识别域(carbohydrate-recognitiondomains)来结合病原体和细胞表面的半乳糖苷，是生物体发挥免疫作用的重要分子之一。在当病原侵入机体后，凝集素首先识别病原体，接着激活免疫细胞的增殖和分化，最后病原体被清理出机体。截至目前，在人类中已经发现了15种半乳糖凝集素以及各种各样的功能，而鱼类中，半乳糖凝集素的报道较为有限。检索发现，来自半滑舌鳎的一种凝集素的抗菌应用专利申请(申请号为2015100784920)。半滑舌鳎属于蝶形目，进化地位比较原始，鳜鱼属于鲈形目，两者之间的亲缘关系较远，无参考价值。目前，关于鳜鱼半乳糖凝集素直接抑制细菌的功能尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8，所述的半乳糖凝集素-8的氨基酸序列为seqidno.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备水产养殖动物细菌抑菌剂中的应用，所述的半乳糖凝集素-8的氨基酸序列为seqidno.1所示。

本发明的最后一个目的在于提供了一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备由水产细菌感染导致的疾病的药物中的应用，所述的半乳糖凝集素-8的氨基酸序列为seqidno.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备细菌抑菌剂中的应用，所述的细菌包括但不限于：无乳链球菌(s.agalactiae)或柱状黄杆菌(f.columnare)，所述的半乳糖凝集素-8的氨基酸序列为seqidno.1所示。

一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备由细菌感染导致水产动物疾病的药物中的应用，所述的水产细菌包括但不限于无乳链球菌(s.agalactiae)或柱状黄杆菌(f.columnare)，所述的半乳糖凝集素-8的氨基酸序列为seqidno.1所示。

以编码seqidno.1所示序列的核苷酸，来制备半乳糖凝集素-8，从而进行上述应用，也属于本发明的保护范围。

本发明所述的半乳糖凝集素-8适用对象包括但不限于由水产细菌感染发病的鳜鱼，牙鲆，大菱鲆，鲑鳟鱼，龟鳖等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

在本发明中，申请人首次在鳜鱼上克隆得到了半乳糖凝集素-8，这个分子在罗非鱼(oreochromisniloticus)(unajaketal.,2015)和石斑鱼(sebastesschlegelii)(madusankaetal.,2019)中被报道具有一些免疫学功能，本发明首次发现半乳糖凝集素-8具备直接抑菌功能。

申请人发现鳜鱼半乳糖凝集素-8(scgal8)本身具有重要的抑菌活性，通过抑菌实验发现半乳糖凝集素-8对柱状黄杆菌(f.columnare)具有良好的抑制效果，因此鱼类的半乳糖凝集素-8在治疗水产动物由柱状黄杆菌引起的烂鳃病治疗中具有良好的应用前景。

半乳糖凝集素-8在所有检测的组织中均可以表达，且碳水化合物结合域具有很高的保守性，功能多样性优势明显，鳜鱼半乳糖凝集素-8可以较广泛的凝集细菌活性，因此来自同一种鱼类的半乳糖凝集素抑菌产品可能对不同鱼类细菌病原体具有抑制作用。

半乳糖凝集素-8没有信号肽，但是我们的研究发现其属于分泌型的蛋白，其在原核表达体系中可大量分布在上清中，这对大规模制备生产抗菌药物意义重大。

半乳糖凝集素-8的热稳定性较好，凝集素的免疫学功能和抗菌功能实验均在室温条件下进行，常温条件下凝集素不易失活，针对鱼类用药的特殊性，开发饲用药物具有较好的实用前景。

半乳糖凝集素-8参与多种机体免疫过程，可以开发水产养殖饲用细菌病预防药物品种，还可以直接抑制细菌的生长，在生产中起到了“预防为主，防治结合”的作用。

附图说明

图1为鳜鱼半乳糖凝集素-8对包括杀鲑气单胞菌atcc27013、无乳链球菌xq-1、迟缓爱德华氏菌ppd130/91和柱状黄杆菌g4在平板上生长影响示意图。

图2为杀鲑气单胞菌atcc27013、无乳链球菌xq-1、迟缓爱德华氏菌ppd130/91和柱状黄杆菌g4四种细菌按照表2的实验设计在不同处理组中的平板菌落统计图：

其中，a为不同的处理组中杀鲑气单胞菌atcc27013的菌落数量统计

b为不同的处理组中无乳链球菌xq-1的菌落数量统计；

c为不同的处理组中迟缓爱德华氏菌ppd130-91的菌落数量统计；

d为不同的处理组中柱状黄杆菌g4的菌落数量统计。

图3为不同浓度的鳜鱼半乳糖凝集素-8的抑菌作用示意图。

具体实施方式

下面我们将通过下面实验来证明鳜鱼凝集素-8(scgal8)的抗菌功能应用。为了更大范围内验证和使用推广，本发明中使用的方法如无特别说明，均为微生物研究中的常规方法。

本发明以原核表达的方式制备了鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白，以本领域的常规方案，例如合成，其他原核表达或真核表达获得的蛋白，也可完成本发明。

实施例1：

鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)的制备纯化：

通过传统的trizol(ambion)提取法从鳜鱼的头肾组织中获得了rna样品，使用常用的反转录试剂盒(thermoscientific)反转获得cdna，以上述获得的cdna样品为模板，正向引物为:sc-galectin8-f>ctgctccaaaatgtcgatttcaaac，反向引物为sc-galectin8-r1>atgttaaaggatcttgacgtccag。使用诺唯赞公司生产的高保真dna聚合酶进行pcr反应获得了鳜鱼半乳糖凝集素-8的orf全长序列(seqidno.2所示)。经过上海生工生物测序无误后，设计含限制性酶切位点的引物，在scgal8的orf两端克隆限制性酶切位点。其中，5'端克隆一个bamhi酶切位点，在3'端克隆一个hindiii酶切位点，具体的正向引物是bamhi-scgal8f>cgcggatccatgtcgatttcaaac；反向引物是hindiii-scgal8r>cccaagcttaaggatcttgacg。最后通过双酶切的方式将半乳糖凝集素-8的全长序列连接到pet28a(+)表达载体上，然后将其转化进top10感受态中，挑取平板上长出的菌落，送上海生工生物工程公司测序，最后从表达了正确序列的菌中提取质粒。将质粒转进bl21表达株中，加入0.5mmiptg诱导剂在16℃恒温摇床中过夜诱导。

在bl21表达株中诱导鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)表达，并通过镍柱亲和纯化的方式获得其重组蛋白(seqidno.1所示)，sds-page检测蛋白纯度，使用sigma公司生产的鼠源his-antibody做western-blot检测，使用碧云天公司生产的bca蛋白检测试剂盒检测其浓度，并稀释成终浓度为100μg/ml的蛋白溶液，-80℃保存。

sds-page和western-blot实验结果表明：我们获得了高纯度的鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)，为了保证实验的严谨性，我们在同样条件下转化pet28a(+)空载质粒在bl21细菌中，使用和半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)纯化洗脱时相同摩尔浓度的洗脱液，收取同样体积的蛋白溶液，相同条件下避免一些其他因子对实验结果的干扰。由于pet28a(+)蛋白分子大小约1kd，sds-page和wb实验并不能检测到，半乳糖凝集素-8重组蛋白分子大小约为37kd。

实施例2：

半乳糖凝集素-8重组蛋白凝集细菌活性的检测

细菌：嗜水气单胞菌ah-1，无乳链球菌xq-1，大肠杆菌top10、金黄色葡萄球菌cicc10384。

具体实验步骤如下：

1.采用“z”型划线的方式在琼脂固体平板培养基上活化以上的四种细菌，将平板放在28℃培养箱中培养24小时，然后挑取平板上的细菌单克隆菌落在液体培养基中，在28℃恒温摇床中培养至对数生长期(od值为0.5)。

2.在常温条件下，离心机转速5000r/min离心10min收集细菌，加入同样体积的无菌pbs缓冲液重悬，再次离心收集细菌，移走上清以后，再次加入同样体积的无菌pbs缓冲液重悬。

3.提前30min从-80℃冰箱拿出半乳糖凝集素-8(rscgal8)重组蛋白以及对照蛋白(rpet28a)溶液放冰上，因为半乳糖凝集素具有ca²⁺依赖特性，因此配好100mm的cacl2溶液，过0.22μm的滤膜除菌后待用。半乳糖凝集素-8(rscgal8)重组蛋白在实验中的终浓度为10μg/ml，cacl2溶液的终浓度为10mm。

4.具体每个单独的实验单元所含成分如下表1所示添加至1.5ml的离心管中，并在低速涡旋震荡器上进行混匀后，将其全部移至显微镜专用的玻璃底培养皿中，在室温下静置1h。

5.在显微镜下拍照记录每个单独实验单元，每个实验单元最少随机保存3张图片。

表1凝集细菌实验设计表

结果显示，鳜鱼半乳糖凝集素-8(rscgal8)重组蛋白具有非常确定的凝集活性，结果表明其对嗜水气单胞菌，无乳链球菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的凝集作用，表明制备的半乳糖凝集素-8(rscgal8)重组蛋白是具有活性的。

实施例3：

鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)的抑菌活性检测：

细菌：杀鲑气单胞菌atcc27013、无乳链球菌xq-1、迟缓爱德华氏菌ppd130/91和柱状黄杆菌g4

具体步骤如下：

1.从-80℃冰箱取出上述细菌的保种菌株，采用“z”型划线的方式在琼脂糖固体平板培养基上分别活化以上的四种细菌，将平板放在28℃培养箱中培养超过24小时，然后挑取平板上的单克隆菌落在各自适应的液体培养基中，在28℃恒温摇床中培养至对数生长期(od值为0.5)。

2.提前30min从-80℃冰箱拿出鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)溶液放冰上，因为鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)具有ca²⁺依赖性，所以配好1m的cacl2溶液、1m的蔗糖溶液和1m的乳糖溶液，过0.22μm的滤膜除菌后待用。

3.通过梯度稀释的方式，用各自对应的液体培养基分别将每种细菌稀释至10^-1-10^-5系列梯度，最后取10^-5系列浓度用于实验，添加1μl摩尔浓度为1m的cacl2溶液至1ml的10^-5系列浓度菌液中至cacl2的终浓度为1mm,在低速涡旋震荡器充分混匀。

4.添加鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)的实验组，其蛋白最终浓度为20μg/ml，因为半乳糖凝集素可以识别并结合乳糖和半乳糖，所以添加α-乳糖和蔗糖作为对照组，具体的实验设计请参照表2。

5.各自独立的实验单元按照表2的设计，按顺序依次添到在1.5ml的离心管中，轻轻的在低俗涡旋震荡器上面进行混匀后，在25℃恒温培养箱中静置孵育2小时。

6.2小时后取出所有的样品，再次使用移液器连接中号移液枪头吹打混匀，每个样品吸取80μl到直径10cm的琼脂糖凝胶平板上涂板子。

7.将已经涂好的板子放在28℃恒温培养箱中静置培养24h后，使用chemidoctmmp(bio-rad,usa)拍摄设备记录.

8使用imgej软件进行克隆计数，使用graphpadprism6数据统计分析，使用coreldraw2018制图。

表2鳜鱼半乳糖凝集素-8(scgal8)的抗菌实验

注：乳糖(lactose)和蔗糖(sucrose)的摩尔浓度为1m；蛋白溶液的浓度为100μg/ml。

因为半乳糖凝集素可以结合乳糖，因此乳糖相当于是半乳糖凝集素的抑制剂，添加乳糖可以部分或全部抑制鳜鱼半乳糖凝集素-8的抑菌活性。一般情况下，蔗糖不会和鳜鱼半乳糖凝集素-8结合，所以添加蔗糖的实验组是添加乳糖的实验组的对照，可以更有力证明鳜鱼半乳糖凝集素-8的抑菌功能。

如图1所示，肉眼观察发现添加鳜鱼半乳糖凝集素重组蛋白的实验组(第二列)相比于pbs空白对照组，可以发现鳜鱼半乳糖凝集素-8对柱状黄杆菌具有较明显的抑菌活性(第四行)，对无乳链球菌具有微弱的抑制作用(第二行)，但是对迟缓杀鲑气单胞菌(第一行)和迟缓爱德华氏菌(第三行)均没有抑菌作用。图2结果得出，当鳜鱼半乳糖凝集素-8浓度为20μg/ml时，对柱状黄杆菌和无乳链球菌的的抑菌率分别为38.7％、22.5％。另外，可以看出鳜鱼半乳糖凝集素-8中添加α-乳糖(lactose)(第二列)和添加蔗糖(sucrose)(第三列)均会对无乳链球菌和柱状黄杆菌生长产生抑制作用。

实施例4：

鳜鱼半乳糖凝集素-8重组蛋白(rscgal8)的浓度增加对抑菌效果的影响：

细菌：杀鲑气单胞菌atcc27013、无乳链球菌xq-1、迟缓爱德华氏菌ppd130/91和柱状黄杆菌g4；

1.挑取平板上的单克隆菌落在液体培养基中，在28℃恒温摇床中培养至对数生长期(od值为0.5)，分别将每种细菌稀释至10^-1-10^-5系列梯度，最后取10^-5系列浓度用于实验。

2.提前30min从-80℃冰箱拿出我们制备的重组蛋白溶液放冰上，包括鳜鱼半乳糖凝集素-8的蛋白(rscgal8)和对照溶液(rpet28a)。配好1m的cacl2溶液，过0.22μm的滤膜除菌后待用。

3.添加1μl摩尔浓度为1m的cacl2溶液至1ml的10^-5系列浓度菌液中至终浓度为1mm,在低俗涡旋震荡器充分混匀。

4.按照表3实验设计所示进行实验单元所含物质的混合后，在低速涡旋震荡器充分混匀。

5.静置于25℃恒温培养箱中2小时后取出，在超净工作台中使用移液器连接中号移液枪头再次吹打混匀，每个离心管中吸取80μl到直径10cm的琼脂糖凝胶平板上涂板子。

6.将已经涂好的板子放在28℃恒温培养箱中静置培养24h后，使用chemidoctmmp(bio-rad,usa)拍摄设备记录.

7.使用imgej软件进行克隆计数，使用graphpadprism6数据统计分析。

表3鳜鱼半乳糖凝集素-8(scgal8)不同浓度梯度的抗菌实验：

结果如图3所示：图3中a、b、c、d分别为杀鲑气单胞菌atcc27013、无乳链球菌xq-1、迟缓爱德华氏菌ppd130/91和柱状黄杆菌g4随着鳜鱼半乳糖凝集素-8的蛋白浓度变化，菌落数量变化示意图。如图所示，我们发现随着鳜鱼半乳糖凝集素-8的浓度升高，对无乳链球菌和柱状黄杆菌的抑菌作用均逐渐增强，但是对杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌没有抑菌作用。具体抑菌率如表4所示：

表4随着蛋白浓度增强各细菌抑菌率的变化

。

序列表

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备抑菌剂中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>313

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metserileserasnproargglnthrpheargasnprometilepro

151015

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290295300

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305310

<210>2

<211>942

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgtcgatttcaaacccgagacagacgtttcgaaacccgatgatccccttcgccgggacg60

atcctgggcggcttgctgccgggggagatggttcttattcagggctcagtgccgtccaaa120

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aaggtcaaagttgaagctgtcgccatcctcgagagctctagttcagtctctcctgcagcc480

agtctgaccagcacggactcagagatgaatccattaatgtcctcttcaggcgacttgagt540

gttcccttcagaggtgagctggttaaaggactgagtgtcggacgcagcatcactgtgaaa600

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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