用于引发对免疫原的免疫响应的方法与流程

本申请是申请日为2013年11月11日，题为《用于引发对免疫原的免疫响应的方法》的中国专利申请201380070982.5的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求于2012年11月19日提交的新加坡专利申请第201208483-6号的优先权的权益，出于所有目的其内容在此通过引用以其整体并入。

本发明涉及用于引发对免疫原的免疫响应的方法，特别是，涉及使用聚合物囊泡(polymersome)作为免疫原的载体的这样的方法。

背景技术：

虽然免疫是一个成熟的过程，然而在不同的免疫原或抗原(本文可互换使用)之间引发的响应水平存在差异。有趣的是，膜蛋白形成一类产生低响应水平的抗原，这又意味着需要大量的膜蛋白以便产生或诱发达到所要求的水平的免疫响应。膜蛋白是众所周知地难以合成并且在不存在洗涤剂的情况下不溶于水。这使得它昂贵且难以获得足够用于免疫用途的量的膜蛋白。

此外，膜蛋白质需要适当的折叠以便正常地发挥功能。正确折叠的膜蛋白的免疫原性比未以生理相关的方式折叠的溶解的膜蛋白更好。因此，即使佐剂可用于增强这种溶解的膜蛋白的免疫原性，它仍是一种不提供过多的优点的低效的方法。

此外，产生针对膜蛋白的抗体的普通程序通常需要它们在膜内的天然结构的先验知识以便设计可用于免疫的合适的表位。这种免疫通常利用分离的肽独立地实施，该分离的肽可以采用与在其天然的膜产地中的完整的蛋白质中出现的构象非常不同的构象。因此，存在很高的风险，即由分离的肽产生的抗体可能终究无法识别体内的靶蛋白。

虽然转染的细胞和基于脂质的系统已被用于呈递膜蛋白抗原以增加分离可能在体内有效的抗体的机会，然而这些系统经常不稳定，冗长和昂贵。再者，这种膜蛋白抗原的本领域当前状态是使用无活性的病毒样颗粒来免疫。

因此，仍然需要提供克服或至少减轻上述问题的替代方法。

技术实现要素：

本文描述的发明提供了一种利用蛋白聚合物囊泡(proteopolymersome)呈递膜蛋白以诱发免疫响应而无需添加已知的佐剂的方法。本发明人惊奇地发现，通过提供聚合物囊泡的周膜(circumferentialmembrane)以允许膜蛋白抗原适当地折叠，可以诱发相比于游离膜蛋白抗原更强的免疫响应。结果，实现受试者如哺乳动物中抗体产生的效率增加。可以使用或不使用佐剂达到效率的增加。由于呈递全长和适当地折叠的膜蛋白抗原，通过利用本文描述的发明产生的抗体也会对体内膜蛋白靶具有更高的亲和力，并且如果产生针对病毒抗原的抗体，那么可能能够中和病毒。

因此，根据本发明的一个方面，它公开了一种用于在受试者中引发对免疫原的免疫响应的方法。该方法可以包括用包含具有两亲聚合物的周膜的聚合物囊泡载体的组合物注射所述受试者。所述组合物还包含整合到所述聚合物囊泡载体的所述两亲聚合物的周膜内的免疫原。所述免疫原可以为膜相关蛋白或脂质抗原。

在本发明的另一个方面，提供了一种用于免疫原的皮内，腹腔内，皮下，静脉内，或肌内注射，或非侵入性给药的组合物。所述组合物可以包含具有两亲聚合物的周膜的聚合物囊泡载体。所述组合物还可以包含整合到所述聚合物囊泡载体的所述两亲聚合物的周膜内的免疫原。所述免疫原可以是膜相关蛋白或脂质抗原。所述组合物可以用在抗体发现，疫苗发现，或靶向递送中。

附图说明

在附图中，不同视图中的类似的参考字符通常指相同的部件。附图不一定按比例绘制，相反，重点通常放在说明各种实施方案的原理。在下面的描述中，参照下列附图说明本发明的各种实施方案。

图1示出α-溶血素浓度的标准曲线。

图2a示出使用α-溶血素包被的板的抗体滴度o.d.测量的光密度测量。用α-溶血素呈递聚合物囊泡注射3只小鼠(标记为“ves-hemo”的实心方块)，而另外3只小鼠接受空聚合物囊泡(标记为“ves.单独”的空心三角形)。稀释血清(1：1000)并且抗小鼠hrp偶联抗体用作第二抗体。伴随着反复免疫随着时间观察到增加的抗α溶血素滴度。

图2b示出使用非包被的板的与图2a同样的实验程序。未检测到抗体结合。

图3示出免疫响应的光密度测量。直到第三次放血，α-溶血素呈递聚合物囊泡(标记为“ves+hemo”的实心方块)产生比游离的α-溶血素(标记为“hemo”的空心方块)更高的响应，之后两者都实现免疫响应的饱和。有趣的是，具有佐剂的α-溶血素(标记为“hemo+adj”的空心圆)产生比游离的α-溶血素低的免疫响应。空聚合物囊泡(标记为“ves”的空心三角形)仍然无免疫原性。

图4示出免疫响应的光密度测量。当实施皮内注射时，在第二次和第三次放血两者中α-溶血素呈递聚合物囊泡(标记为“ves-hemo”的实心方块)引发比游离的α-溶血素(标记为“游离hemo”的空心方块)更高的免疫响应。

图5示出血凝素(ha)浓度的标准曲线。

图6示出用于ha-插入的和空(对照)的聚合物囊泡的elisa。

图7示出抗体滴度的光密度测量。在100ngha的等效剂量下，加强(第二次放血)之后，ha聚合物囊泡(三角形)引发比游离ha(圆圈)更高的免疫响应(***p<0.001相对于pbs组)。未包被的孔没有检测到抗体结合。

描述

下面的详细描述以说明的方式引用显示具体细节和其中可以实践本发明的实施方案的附图。这些实施方案被足够详细地描述以使本领域的技术人员能够实践本发明。可以利用其他实施方案并且可以进行结构，逻辑及电方面的改变而不偏离本发明的范围。各种实施方案并不一定是相互排斥的，因为一些实施方案可以与一个或多个其它实施方案结合以形成新的实施方案。

在本文中，聚合物囊泡是具有聚合物膜的囊泡，其通常但不一定总是由两亲嵌段共聚物的稀溶液自组装形成，该两亲嵌段共聚物可以是不同的类型，如二嵌段和三嵌段(a-b-a或a-b-c)。聚合物囊泡也可以由四嵌段或五嵌段共聚物形成。对于三嵌段共聚物，中央嵌段通常通过其侧翼的嵌段从环境屏蔽，而二嵌段共聚物自组装成双层，尾对尾放置两个疏水性嵌段，很大程度上是为了达到同样的效果。在大多数情况下，囊泡膜具有不溶性中间层和可溶性外层。自组装诱发的聚合物囊泡形成的驱动力被认为是不溶性嵌段的微相分离，所述不溶性嵌段为了保护自身不与水接触而易于结合(associate)。由于组分共聚物的大分子量，聚合物囊泡具有显著的特性。嵌段共聚物的总分子量的增加有利于囊泡形成。其结果是，与通过脂质和表面活性剂形成的囊泡相比，(聚合的)两亲物在这些囊泡中的扩散非常低。由于聚集在囊泡结构中的聚合物链的这种较小的流动性，能够获得稳定的聚合物囊泡形态。除非另有明确说明，否则术语“聚合物囊泡”和“囊泡”，如下文所用，视为类似的并且可以互换使用。

在本文中，抗原是可以被免疫系统的成分特异性地结合的任何物质并且只有能够引发(或诱发或诱导)免疫响应的抗原被认为是免疫原性的并且被称为免疫原。膜蛋白形成一类产生低响应水平的抗原。特别有趣的是，膜相关蛋白(即，本文所述的抗原)被整合(或掺入或携带)到聚合物囊泡的壁内，从而允许所述膜相关蛋白以生理相关的方式被折叠(即，目前被称为聚合物囊泡载体或抗原呈递聚合物囊泡，本文可互换使用这两个术语)。这极大地提高膜蛋白的免疫原性，从而当与游离膜蛋白相比时，较少量的膜蛋白可用于产生相同水平的免疫响应。此外，聚合物囊泡的较大尺寸(与游离膜蛋白相比)允许它们更容易地被免疫系统检测到。

由于在允许其适当地折叠的合成环境中使用完整蛋白质(而不是其片段)进行免疫，分离能够检测体内的膜蛋白的抗体的可能性会更高。再者，可以进行免疫和抗体产生而不需要膜蛋白结构的任何先验知识，否则，当使用基于肽的免疫方法时，膜蛋白结构的先验知识是必要的。

此外，与其他技术相比，本方法允许在稳定的膜环境中插入的膜蛋白的快速和具有成本效益的生产。

因此，根据本发明的一个方面，公开了一种用于在受试者中引发对免疫原的免疫响应的方法。该方法可以包括用包含具有两亲聚合物的周膜的聚合物囊泡载体的组合物注射所述受试者。所述组合物还包含整合到所述聚合物囊泡载体的所述两亲聚合物的周膜内的免疫原。所述免疫原是膜相关蛋白。可选地，所述免疫原也可以是脂质抗原。在这样的实施方案中，所述免疫原可以是合成的脂质或天然的脂质。

注射的频率可以由本领域的技术人员确定和调整，取决于所需的响应水平。例如，可以将聚合物囊泡载体的每周一次或每两周一次的注射给予受试者，所述受试者可以包括哺乳动物。免疫响应可以通过相对于由聚合物囊泡载体携带的免疫原的初始量定量哺乳动物中的抗体的血液浓度水平而测量。聚合物囊泡的结构可包括自组装成囊泡形式的两亲嵌段共聚物和跨越囊泡的壁的整合的膜蛋白，由此膜蛋白是将被呈递的抗原，并且通过重组或体外合成或自发插入的方法并入。膜蛋白可以在洗涤剂，表面活性剂，温度变化或ph变化的帮助下重构。由两亲嵌段共聚物提供的囊泡结构允许膜蛋白抗原以生理上正确和功能性的方式被折叠，从而允许靶哺乳动物的免疫系统检测所述抗原，从而产生强烈的免疫响应。

在各种实施方案中，组合物的注射可以包括腹腔内，皮下，或静脉内，肌肉内注射，或非侵入性给药。

在可选实施方案中，组合物的注射可以包括皮内注射。已经令人惊奇地由本发明人在涉及皮内注射的小鼠的实验中发现，α-溶血素呈递聚合物囊泡在引发免疫响应方面比游离α-溶血素有效得多，其中在第2次和第三次放血中α-溶血素呈递聚合物囊泡引发比游离α-溶血素更高的免疫响应(见下面的实施例部分)。

通过在包括携带免疫原的聚合物囊泡载体的组合物中包含佐剂可以进一步提高或增加免疫响应水平。在这样的实施方案中，携带免疫原的聚合物囊泡载体和佐剂同时施用给受试者。

在可选实施方案中，佐剂可以与包括携带免疫原的聚合物囊泡载体的组合物的施用分开施用。佐剂可以在施用包括携带免疫原的聚合物囊泡载体的组合物之前，同时或者之后施用。例如，可以在注射包括携带免疫原的聚合物囊泡载体的组合物之后对受试者注射佐剂。

本领域技术人员将容易地认识和理解的是待注射的佐剂的类型取决于待注射的免疫原的类型。免疫原可以是细菌，病毒，或真菌来源的抗原。例如，在其中抗原是α-溶血素的情况下，佐剂可以是完全的弗氏佐剂。其它抗原-佐剂对也适合用于本方法。在某些实施方案中，并不需要使用佐剂。在又一些实施方案中，在不使用佐剂的情况下，本方法效果更好，即诱发更强的免疫响应。

在其它实施方案中，所述膜相关蛋白可以是跨膜蛋白，g蛋白偶联受体，神经递质受体，激酶，孔蛋白，abc转运体，离子转运体，乙酰胆碱受体和细胞粘附受体。膜蛋白也可以与标签偶联，或者可以无标签。如果膜蛋白被添加标签，那么标签可以选自诸如vsv，his标签，链球菌标签，标志标签，内含肽标签或gst标签或诸如生物素或亲和素的高亲和力结合对的配偶体(partner)的表位或者选自诸如荧光标记，酶标记，核磁共振标记或同位素标记的标记。

膜蛋白可以在并入之前提供，或者与通过无细胞表达系统的该蛋白质的产生同时并入。该无细胞表达系统可以是体外转录和翻译系统。

无细胞表达系统也可以是真核生物的无细胞表达系统，如基于兔网织红细胞，麦胚提取物或昆虫提取物的系统，原核生物的无细胞表达系统或古细菌的(archaic)无细胞表达系统。

如上所述，聚合物囊泡可以由两亲二嵌段或三嵌段共聚物形成。在各种实施方案中，两亲聚合物可以包括羧酸，酰胺，胺，亚烷基，二烷基硅氧烷，醚或亚烷基硫化物中的至少一种单体单元。

在某些实施方案中，两亲聚合物可以是从低聚(氧化乙烯)嵌段，聚(氧化乙烯)嵌段，低聚(氧化丙烯)嵌段，聚(氧化丙烯)嵌段，低聚(氧化丁烯)嵌段和聚(氧化丁烯)嵌段组成的组中选择的聚醚嵌段。可包含在聚合物中的嵌段的另外的实例包括，但不限于，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸酯)，聚苯乙烯，聚(丁二烯)，聚(2-甲基恶唑啉)，聚(二甲基硅氧烷)，聚(e-己内酯)，聚(丙烯硫化物)，聚(n-异丙基丙烯酰胺)，聚(2-乙烯基吡啶)，聚(2-(二乙氨基)乙基甲基丙烯酸酯)，聚(2-(异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)，聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱)和聚(乳酸)。合适的两亲聚合物的实例包括，但不限于，聚(乙基乙烯)-b-聚(环氧乙烷)(pee-b-peo)，聚(丁二烯)-b-聚(环氧乙烷)(pbd-b-peo)，聚(苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)(ps-paa)，聚(2-甲基恶唑啉)-b-聚(二甲基硅氧烷)-b-聚(2-甲基恶唑啉)(pmoxa-b-pdms-b-pmoxa)，聚(2-甲基恶唑啉)-b-聚(二甲基硅氧烷)-b-聚(环氧乙烷)(pmoxa-b-pdms-b-peo)，聚(环氧乙烷)-b-聚(硫化丙烯)-b-聚(环氧乙烷)(peo-b-pps-b-peo)和聚(环氧乙烷)-聚(环氧丁烷)嵌段共聚物。嵌段共聚物可以由包括在共聚物中的各嵌段的平均嵌段长度进一步详细说明。因此pbmpeon表示具有长度m的聚丁二烯嵌段(pb)和具有长度n的聚氧化乙烯(peo)嵌段的存在。m和n是独立选择的整数，其可以例如在约6至约60的范围内选择。因此，pb35peo18表示具有平均长度35的聚丁二烯嵌段和具有平均长度18的聚氧化乙烯嵌段的存在。在某些实施方案中，pb-peo二嵌段共聚物包括5-50个嵌段pb和5-50个嵌段peo。同样，pb10peo24表示具有平均长度10的聚丁二烯嵌段和具有平均长度24的聚氧化乙烯嵌段的存在。作为进一步的实施例，eobp表示具有长度o的乙烯嵌段(e)和具有长度p的丁烯嵌段(b)的存在。o和p是独立地选择的整数，例如，在约10至约120的范围内选择。因此，e16b22表示具有平均长度16的乙烯嵌段和具有平均长度22的丁烯嵌段的存在。

在某些实施方案中，聚合物囊泡载体可以包含一个或多个隔室(或以其他方式被称为“多隔室”)。聚合物囊泡的囊泡结构的区室化允许活细胞中的复杂的反应途径的共存在并且有助于提供细胞内的许多活动的空间和时间的分离。因此，多于一种类型的免疫原可引入聚合物囊泡载体。不同的免疫原可具有相同或不同的同种型。每个隔室也可以由相同或者不同的两亲聚合物形成。在各种实施方案中，两种或更多种不同的免疫原被整合到两亲聚合物的周膜内。每个隔室可封装肽，蛋白质和核酸中的至少一种。所述肽，蛋白质，或核酸可以是免疫原性的。

在其中聚合物囊泡载体包含多个隔室的情况下，隔室可包括外嵌段共聚物囊泡和至少一个内嵌段共聚物囊泡，其中所述至少一个内嵌段共聚物囊泡封装在所述外嵌段共聚物囊泡内。在一些实施方案中，外囊泡和内囊泡的各个嵌段共聚物包括聚醚嵌段，如聚(氧化乙烯)嵌段，聚(氧化丙烯)嵌段和聚(氧化丁烯)嵌段。可包含在共聚物中的嵌段的其它实例包括，但不限于，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸酯)，聚苯乙烯，聚(丁二烯)，聚(2-甲基恶唑啉)，聚(二甲基硅氧烷)，聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)酰胺)，聚(e-己内酯)，聚(丙烯硫化物)，聚(n-异丙基丙烯酰胺)，聚(2-乙烯基吡啶)，聚(2-(二乙氨基)乙基甲基丙烯酸酯)，聚(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)，聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱)和聚(乳酸)。合适的外囊泡和内囊泡的实例包括，但不限于，聚(乙基乙烯)-b-聚(环氧乙烷)(pee-b-peo)，聚(丁二烯)-b-聚(环氧乙烷)(pbd-b-peo)，聚(苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)(ps-b-paa)，聚(环氧乙烷)-聚(己内酯)(peo-b-pcl)，聚(环氧乙烷)聚(乳酸)(peo-b-pla)，聚(异戊二烯)-聚(环氧乙烷)(pi-b-peo)，聚(2-乙烯基吡啶)-聚(环氧乙烷)(p2vp-b-peo)，聚(环氧乙烷)-聚(n-异丙基丙烯酰胺)(peo-b-pnipam)，聚(乙二醇)-聚(硫化丙烯)(peg-b-pps)，聚(甲基苯基硅烷)-聚(环氧乙烷)(pmps-b-peo-b-pmps-b-peo-b-pmps)，聚(2-甲基恶唑啉)-b-聚(二甲基硅氧烷)-b-聚(2-甲基恶唑啉)(pmoxa-b-pdms-b-pmoxa)，聚(2-甲基恶唑啉)-b-聚(二甲基硅氧烷)-b-聚(环氧乙烷)(pmoxa-b-pdms-b-peo)，聚[苯乙烯-b-聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)-酰胺)](ps-b-piat)，聚(环氧乙烷)-b-聚(硫化丙烯)-b-聚(环氧乙烷)(peo-b-pps-b-peo)和聚(环氧乙烷)-聚(环氧丁烷)(peo-b-pbo)嵌段共聚物。嵌段共聚物可以由包括在共聚物中的各嵌段的平均数目进一步详细说明。因此，psm-piatn表示具有m重复单元的聚苯乙烯嵌段(ps)和具有n重复单元的聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)酰胺)(piat)嵌段的存在。m和n为独立选择的整数，其可以例如在约5至约95的范围内选择。因此，ps40-piat50表示具有平均40个重复单元的ps嵌段和具有平均50个重复单元的piat嵌段的存在。

所谓“封装”是指内囊泡被完全包含在外囊泡内并且由外囊泡的囊泡膜包围。由外囊泡的囊泡膜包围的密闭空间形成一个隔室。由内囊泡的囊泡膜包围的密闭空间形成另一隔室。

合适的多隔室化的聚合物囊泡的进一步的细节可以在pct公开第wo2012/018306号中找到，出于所有的目的其内容在此通过引用以其全部内容并入。

所述聚合物囊泡也可以是独立的或固定在表面上，如在pct公开第wo2010/123462号中描述的那些，出于所有的目的其内容在此通过引用以其全部内容并入。

在另外的实施方案中，与膜蛋白抗原复合的二级蛋白质可以被封装或并入在聚合物囊泡载体的内腔内。有利的是，该二级蛋白质以特定的构象稳定膜蛋白抗原。

在本发明的另一个方面，提供了一种用于免疫原的皮内，腹腔内，皮下，静脉，或肌内注射，或非侵入性给药的组合物。所述组合物可以包含具有两亲聚合物的周膜的聚合物囊泡载体。所述组合物还可以包含整合到所述聚合物囊泡载体的所述两亲聚合物的周膜内的免疫原。所述免疫原可以是膜相关蛋白或脂质抗原。所述组合物可以用在抗体发现，疫苗发现，或靶向递送中。

总之，本发明第一次证明并入到聚合物囊泡内的膜蛋白用于产生免疫响应。虽然聚合物囊泡和膜蛋白抗原的组合以前已被用于引发免疫响应，但是聚合物囊泡与已知的佐剂分子一起使用，并且膜蛋白未以生理相关的方式呈现。另一方面，本聚合物囊泡载体不被用作佐剂；反而所述聚合物囊泡载体用作囊泡以容纳膜蛋白抗原，从而允许其中的膜蛋白抗原适当地折叠，其最终使得相比于常规的洗涤剂增溶的膜蛋白抗原能够诱发更好的免疫响应。

相比于现有技术，本发明具有下列优点：

-免疫响应可能会因使用佐剂进一步提高。

-聚合物是固有稳健的，并且可被定制或官能化以提高其在体内的循环时间。

-聚合物廉价和可以快速地合成。

-引发免疫响应所需的膜蛋白的量较小。

-使用膜蛋白抗原的全长，使得产生的抗体更有可能能够在体内检测膜蛋白。

-膜蛋白可通过体外翻译或转录并入聚合物囊泡载体，这有利于产生针对困难的膜蛋白抗原的抗体。

通过这些优点，本文描述的发明提供了一种比本领域的现有状态更快、更便宜、更准确、更简单的用于由膜蛋白抗原引发免疫响应的方法。本发明的可能的应用包括接种疫苗中的抗体的生产以及产生治疗性抗体。

为了使本发明可以被容易地理解并付诸实际效果，具体的实施方案现在将通过下列非限制性实施例说明。

实施例

实施例1

现在在下面的段落中描述一种用于使用α-溶血素呈递聚合物囊泡在小鼠中引发对α-溶血素的免疫响应的方法。

材料&方法

聚(丁二烯-b-环氧乙烷)(pbd21-peo14)bd21两亲嵌段共聚物从聚合物源公司(polymersource,加拿大)购得。α-溶血素来自金黄色葡萄球菌，3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris)，氯化镁和氯化钠均购自sigmaaldrich公司(新加坡)。四氢呋喃(thf)购自tedia公司(俄亥俄，美国)。

聚合物囊泡的制备

聚合物囊泡通过薄膜再水化方法制备。bd21聚合物溶解于thf中，并在氮气流下在圆锥形底面玻璃管的壁上干燥为薄膜。聚合物膜在真空下进一步干燥。随后，将超纯水加入到该管中，并搅拌以再水化所述膜并允许聚合物囊泡的自发形成，从而产生均匀的混浊溶液。然后用0.45μm的pvdf过滤器(millipore)挤出所得的囊泡分散体，并且进行对超纯水的透析以除去任何残留的溶剂。α-溶血素溶解于mops-nacl缓冲液(0.01mmops，0.1mnacl，ph7)中。

通过将α-溶血素溶液的等分试样加入到聚合物囊泡分散体中形成聚合物囊泡。然后将混合物孵育以允许α-溶血素重构入聚合物囊泡。接着，利用离心过滤器使游离的α-溶血素与α-溶血素呈递聚合物囊泡分离。然后将所述α-溶血素呈递聚合物囊泡在50ul的tmn缓冲液(100mmtris，50mmmgcl2和100mmnacl，ph调至7.5)中重悬。

α-溶血素浓度的定量

利用从已知浓度的游离溶血素获得的标准曲线(图1)确定插入α-溶血素呈递聚合物囊泡内的α-溶血素的量的定量。包被缓冲液(0.1mco3/hco3ph9-9.8)中的100ng/孔的多克隆抗α溶血素抗体被涂布在96孔板中，在4℃下过夜。第二天，在室温(rt)下将孔在封闭缓冲液(1xpbs中的1％bsa)中封闭1小时。然后在室温下，将封闭缓冲液中的从500ng/100ul开始的不同浓度的游离的α-溶血素孵育1小时。此外，在相同缓冲液(1:10稀释)中制备并同样地孵育α-溶血素呈递聚合物囊泡样品。随后，施加封闭的缓冲液中的抗α溶血素小鼠血清(1：1000)，然后是抗小鼠hrp偶联抗体(1：4000)。用tmb底物通过一式三份的测量定量过氧化物酶活性。也对非α-溶血素包被的孔实施一式三份的测量以确定非特异性结合(nsb)。使用所获得的标准曲线的外推使我们能够估计蛋白聚合物囊泡中的插入的α-溶血素的量为1.32μg/ml+/-0.6(n＝4)。

聚合物囊泡的注射

在c57b/6小鼠(每组3只小鼠)中腹腔内或皮内注射每鼠100-150ngα-溶血素呈递蛋白聚合物囊泡，如下：第1天第一次加强(boost)，第14天第二次加强，然后是每七天加强一次持续4个星期。利用毛细管从小鼠的脸颊采样在每次免疫前收集血样。

免疫响应的定量

在96孔板中涂布100ng/孔的包被缓冲液中的游离α-溶血素，过夜。次日利用封闭缓冲液封闭孔。每个血液样品在封闭缓冲液中稀释(1：100，或1：1000)并且在室温下在α-溶血素包被或非包被的孔上孵育1h。洗涤3次后(pbs1x)，在室温下孵育抗小鼠hrp偶联抗体(1：4000)1h，随后是3次洗涤和tmb底物反应。

结果&讨论

为了证实使用膜蛋白抗原呈递聚合物囊泡来引发免疫响应的本发明方法，将α-溶血素(抗原)并入bd22聚合物囊泡内以形成α-溶血素呈递聚合物囊泡。

为了证明该α-溶血素呈递聚合物囊泡的免疫原性，将它们腹腔内注射到3只小鼠中，而另外3只小鼠接受无蛋白质的聚合物囊泡。对α-溶血素包被的板滴定血清(图2a)。在第三次注射α-溶血素呈递聚合物囊泡后获得强大的抗体滴度而空白的聚合物囊泡在整个实验中仍然没有效果。当在无α-溶血素包被的板上测试血清时，未检测到滴度，表明抗体滴度对α-溶血素是特异的(图2b)。这表明α-溶血素呈递聚合物囊泡能够引发免疫响应，产生针对α-溶血素的抗体用于免疫或者抗体产生，即使所使用的α-溶血素的量(100-150ng)比通常的微克剂量低得多。

为了进一步分析α-溶血素呈递聚合物囊泡的免疫原性，将聚合物囊泡分别注入3只小鼠中，而另外9只小鼠注射各种对照(3只小鼠用tmn缓冲剂，3只小鼠用游离α-溶血素，和3只小鼠用α-溶血素和完全弗氏佐剂)。图3示出通过5次注射的小鼠的免疫原性响应。如前面的实验，α-溶血素呈递聚合物囊泡能够引发免疫响应。令人惊奇的是，相当量(100ng)的游离α-溶血素也能够在不使用佐剂的情况下引发免疫响应，虽然对于前3次注射来说，该响应稍低。与佐剂一起注射的游离的α-溶血素导致较低效率的响应而空白聚合物囊泡依然无免疫原性。因此，利用α-溶血素呈递聚合物囊泡获得的所观察到的免疫响应的部分可能是由于α-溶血素本身的免疫原性。在α-溶血素的截短版本用于免疫小鼠的研究中也观察到无佐剂的此类免疫原性，虽然使用高得多的剂量(5μg)。

为了更进一步地分析α-溶血素呈递聚合物囊泡的免疫原性，进行皮内注射。最近大部分的注意力都集中在皮肤的不同层中实施的免疫，其中皮下和皮内注射相对于腹腔内和肌内途径重获流行，因为皮肤富含抗原呈递细胞，如树突状细胞和巨噬细胞。此外，大量的努力已投入开发易于使用的无针设备，这将允许疫苗通过皮肤递送。因为这种兴趣，在该进一步的实验中实施皮内注射。将α-溶血素呈递聚合物囊泡注射到3只小鼠内，而将游离的α-溶血素注射到2只小鼠内。图4示出了通过3次注射的小鼠的免疫原性响应。有趣的是，该α-溶血素呈递聚合物囊泡现在在引发免疫响应方面比游离的α-溶血素有效得多，其中在第二次和第三次放血中所述α-溶血素呈递聚合物囊泡引发了比游离的α-溶血素更高的免疫响应。看来，游离的α-溶血素的免疫原性由皮内注射削减而α-溶血素呈递聚合物囊泡仍然能够产生免疫响应。这可能是因为相对较大的聚合物囊泡能够招募存在于真皮中的树突细胞。

总之，本发明人通过利用α-溶血素呈递聚合物囊泡作为实例已经证实一种利用膜蛋白抗原呈递聚合物囊泡引发免疫响应的方法。该α-溶血素呈递聚合物囊泡能够引发比游离α-溶血素和与佐剂一起注射的α-溶血素两者更有效的免疫响应。膜蛋白抗原呈递聚合物囊泡可以用于免疫和抗体产生两者。

实施例2

现在在下面的段落中描述一种使用血凝素呈递聚合物囊泡在小鼠中引发免疫响应的方法。

血凝素聚合物囊泡的制备

通过薄膜再水化方法制备聚合物囊泡。bd21聚合物溶解在氯仿中，并干燥成薄膜。随后，加入超纯水以再水化所述膜并允许聚合物囊泡的自发形成。然后用0.45μm和0.22μm的膜挤出所得的囊泡分散体，并且对超纯水透析以除去任何残留的溶剂。

重组血凝素(ha)蛋白(甲型流感病毒h3n2威斯康星67/05，mybiosource公司)被提供为10mm磷酸钠，ph7.4，150mmnacl和0.005％吐温-20中的无菌过滤的溶液。

通过将ha溶液的等分试样加入到聚合物囊泡分散体中形成ha聚合物囊泡。然后将混合物孵育以允许重组ha进入聚合物囊泡。随后，使用离心过滤器分离游离ha和ha呈递聚合物囊泡。然后在pbs缓冲液中重悬ha呈递聚合物囊泡。

ha浓度的定量

利用从已知浓度的游离ha获得的标准曲线(图5)确定插入ha呈递聚合物囊泡内的ha的量的定量。将包被缓冲液(0.1mco3/hco3ph9-9.8)中的开始于5μg/ml的游离ha和开始于1:10稀释的ha聚合物囊泡(图6)的系列稀释物涂布在384孔板中，在4℃下过夜。第二天，将孔用pbs清洗并在室温(rt)下在封闭缓冲液(1xpbs中的1％bsa，50μl/孔)中封闭1小时。随后，施加封闭缓冲液中的抗ha抗体，在室温(rt)下孵育1h并且用pbs清洗，类似地接着是抗兔hrp偶联抗体(1：2000)。用opd底物通过一式三份的测量定量过氧化物酶活性。也对未包被的孔实施一式三份的测量以确定背景信号。未被ha插入的聚合物囊泡也作为对照纳入以确保获得的信号是ha特异的。在产生低于饱和的信号的ha聚合物囊泡的稀释物上实施使用所获得的标准曲线的外推，其使我们能够估计蛋白聚合物囊泡中的插入的ha的量为10.908μg/ml+/-1.43(n＝3)。

利用ha聚合物囊泡的小鼠的免疫

在balb/c小鼠(每组3只小鼠)中皮下注射每鼠100ng的可溶或者在聚合物囊泡中的ha，如下：第1天的第1剂量(初次)和第21天的第二剂量(加强)。作为阳性对照，用500ng的ha和佐剂(完全弗氏佐剂用于初次和不完全弗氏佐剂用于加强，根据制造商的指令以1:1体积比制备)免疫一组小鼠，同时用pbs免疫小鼠作为阴性对照。在免疫前，加强前即刻和加强后一周使用毛细管从小鼠的脸颊采样来收集血清样品。

免疫响应的定量

在384孔板中涂布15ng/孔的包被缓冲液中的游离ha，在4℃下过夜。第二天，将孔用pbs洗涤并且在室温下(rt)在封闭缓冲液(1xpbs中的1％bsa)中封闭1h。每个时间点的单个小鼠的血清样品在封闭缓冲液中稀释(1:100，1:1000或者1:10000)并且在室温下在ha包被的或者未包被的孔上孵育1h(图7)。洗涤3次后(pbs1x)，在室温下孵育hrp偶联的抗小鼠igg(1：4000)1小时，随后洗涤3次。然后用opd底物定量过氧化物酶活性。在加强之后(第2次放血)以100ngha的等效剂量，ha聚合物囊泡引发比游离ha更高的抗体响应。

总结

在此实施例中，通过使用ha作为模型抗原已证明使用膜蛋白呈递聚合物囊泡引发免疫响应的方法。相比于等效免疫剂量的游离ha，ha聚合物囊泡能够更有效地引发抗体响应。膜蛋白抗原呈递聚合物囊泡可以潜在地用于疫苗接种来诱导保护性免疫响应，以及用于产生以其他方式难以诱导的针对膜蛋白质的抗体。

此外，本发明人已使用cxcr4聚合物囊泡引发针对cxcr4的抗体从而证明可以为通过体外合成插入周膜内的膜蛋白抗原产生抗体。

利用流感病毒(同株)的血凝抑制和微量中和测定法测试本工作中产生的抗体的功能性正在开展以证明它们能够中和病毒。

目前也正在研究的是在该研究中产生的针对cxcr4聚合物囊泡的抗体是否对细胞中产生的cxcr4抗原具有更特异的亲和力以证明这可以用作产生针对膜蛋白抗原的抗体的工具。

“包含”是指包括但不限于跟随词语“包含”的任何事物。因此，使用术语“包含”表示所列要素是需要的或强制性的，但其它要素是任选的，并且可以或可以不存在。

“由......组成”是指包括并且限于跟随短语“由......组成”的任何事物。因此，短语“由......组成”表示所列要素是需要的或强制性的，并且没有其它要素可以存在。

本文示例性描述的发明可以在不存在本文没有特别公开的任何一种或多种要素，一种或多种限制的情况下合适地实施。因此，例如，术语“包含(comprising)”，“包括(including)”，“含有(containing)”等术语应被宽泛和非限制性地理解。另外，本文所使用的术语和表达已经被用作描述的术语而不是限制，并且无意在这些术语和表达的使用中排除显示和表达的特征及其部分的任何等价物，但是已经认识到各种改变在请求保护的本发明的范围内。因此，应当理解，虽然本发明已通过优选的实施方式和任选的特征特别地公开，本文公开的其中体现的本发明的修改和改变可以被本领域的技术人员采取，而且这些修改和改变被认为是在本发明的范围内。

与给定数字值相关的“约”，例如用于温度和时间周期，意思是包括规定值的10％内的数值。

本文已经广泛地和一般性地描述本发明。落入一般性公开范围内的每个更窄的种类和子类分组也形成本发明的一部分。这包括从种类去除任何主题的带有附带条件或负面限制的本发明的一般描述，不管去除的物质是否在本文中具体记载。

其他的实施方案都在下面的权利要求和非限制性实施例内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组的方式描述的情况下，本领域的技术人员将认识到本发明也由此就马库什组的任何个体成员或成员的亚组来描述。