一种免疫抑制剂单克隆抗体的制剂的制作方法

1.本发明属于药物制剂领域，具体涉及到一种免疫抑制剂单克隆抗体的制剂。


背景技术：

2.cd20是一种免疫抑制性受体，也称为b-淋巴细胞限制型分化抗原或bp35，位于前b淋巴细胞和成熟b淋巴细胞上。cd20在正常b细胞和恶性b细胞都存在，特别的是，其在多于90％的b细胞非何杰金氏淋巴瘤(nhl)中表达，而未在造血干细胞、原b细胞、正常血浆细胞或其它正常组织中表达，因此抗cd20可作为b淋巴细胞瘤治疗的一个很好的治疗靶点。以cd20为靶点的单克隆抗体，简称抗cd20单克隆抗体。据报道抗cd20单克隆抗体主要经三种机制杀伤源于b细胞的肿瘤：抗体依赖的细胞毒作用(adcc)；补体依赖的细胞毒作用(cdc)；抗体与cd20分子结合引起的细胞生长抑制、细胞周期改变及凋亡等直接效应。自1997年第一个抗cd20单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab，商品名美罗华)批准上市至今，该类药物发展迅速；现以cd20为靶点的抗体药物可分为三代：第一代利妥昔、替伊莫单抗，鼠源或者嵌合单抗；第二代的奥法木是人源化单抗；第三代的阿妥珠单抗。
3.单克隆抗体等蛋白大分子相比小分子化学药物来说，分子量大且结构复杂，因此其制剂面临着一些问题如蛋白的水解、氧化等化学不稳定性和变性、聚集、沉淀及吸附等物理不稳定性。以液体制剂形式存在的蛋白药物易发生上述的理化反应，从而失去活性；此外，液体制剂在长途运输过程中，会因剧烈震荡导致蛋白变性、失活。而冻干制剂在使用前需要复溶，操作繁琐，且成本较高，所以在产品稳定的条件下，液体制剂成为首选，例如目前已上市的抗cd20单克隆抗体药物包括利妥昔、奥法木、obinutuzumab等均为液体制剂。液体制剂的成分主要有一定ph条件的缓冲液体系、一定浓度的单克隆抗体、稳定剂和增溶剂，鉴于液体制剂的优势及存在的问题，需要系统的筛选制剂组分及含量以最大程度的维持抗体的稳定性。
4.专利cn102686216a和cn104399075a中公开了抗cd20单克隆抗体液体制剂，所用辅料多、操作复杂，且含至少一种透明质酸酶，需低温保存。本发明相比于上述专利中的液体制剂，所用的辅料更少、操作更简单、成本更低，更适合于本发明中的抗cd20单克隆抗体的长期稳定保存。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种稳定的抗cd20单克隆抗体的液体制剂，其在生产、储存期间是稳定的，并且辅料更少、操作简单、给药方便。
6.本发明提供一种适用于静脉给药的液体制剂，显著改善抗cd20单克隆抗体的稳定性，使其在储存期间能保持稳定、具有较低的聚体及片段化。本发明中适用于静脉注射的抗cd20单克隆抗体的液体制剂能够有效的运用于肿瘤治疗中。
7.本发明具体技术方案为：
8.一种免疫抑制剂单克隆抗体的制剂，含有抗cd20单克隆抗体、聚维酮k30、桔酸丙
酯和药学上可接受的辅料。
9.其中抗cd20单克隆抗体、聚维酮k30和桔酸丙酯的比例为40-70∶1-10∶1-5。
10.其中，所述的药学上可接受的辅料包括赋型剂、增溶剂和缓冲剂。
11.其中，所述的赋型剂为海藻糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇。
12.其中，所述增溶剂为聚山梨酯20或聚山梨酯80。
13.其中，所述的缓冲剂为l-组氨酸-盐酸缓冲体系。
14.本发明通过缓冲体系调节液体制剂的ph为5.5-6.5。
15.进一步地，所述的抗cd20单克隆抗体的液体制剂包括以下组分：
16.(1)40-70mg/ml的抗cd20单克隆抗体，
17.(2)100-250mm赋型剂，
18.(3)1-10mg/ml聚维酮k30，
19.(4)1-5mg/ml桔酸丙酯，
20.(5)0.1-0.5mg/ml增溶剂，
21.(6)10-50mm缓冲剂，
22.其中所述制剂的ph为5.5-6.5。
23.更优选地，所述的抗cd20单克隆抗体的液体制剂包括以下组分：
24.(1)50mg/ml的抗cd20单克隆抗体，
25.(2)150-250mm赋型剂，
26.(3)1-8mg/ml聚维酮k30，
27.(4)1-3mg/ml桔酸丙酯，
28.(5)0.1-0.3mg/ml增溶剂，
29.(6)10-20mm缓冲剂，
30.其中所述制剂的ph为5.5-6.5。
31.在一个优选的实施方式中，所述抗cd20抗体药物液体制剂包含如下组分：
32.(1)50mg/ml抗cd20抗体，
33.(2)200mm赋形剂，
34.(3)5mg/ml聚维酮k30，
35.(4)2mg/ml桔酸丙酯，
36.(5)0.2mg/ml增溶剂，
37.(6)20mm缓冲剂，
38.其中所述制剂的ph为6.0。
39.所述抗cd20单克隆抗体液体制剂采用如下工艺制备：
40.称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph，将抗cd20单克隆抗体原液超滤换液至缓冲液中，再加入处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、赋形剂和增溶剂，溶解并混合均匀即得。
41.进一步地，所述抗cd20单克隆抗体液体制剂采用如下工艺制备：
42.称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph5.5-6.5，将抗cd20单克隆抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后加入处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、赋形剂和增溶剂，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为40～70mg/ml，用
0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
43.保持抗体的活性主要是保持抗体蛋白空间结构的稳定。本发明中加入聚维酮k30和赋型剂，包围在抗体周围，使大分子物质的运动受阻，维持抗体分子的空间结构，阻止抗体分子的沉淀，从而增加抗体稳定性。海藻糖自身性质非常稳定，且在高温、高渗透压及干燥失水等条件下，对多种生物活性物质具有保护作用，有效地保护蛋白分子不变性失活，从成本和稳定性效果考虑，赋型剂优选海藻糖。本发明中加入增溶剂，增溶是指难溶性药物在表面活性剂的作用下，在溶剂中增加溶解度并形成溶液的过程。聚山梨酯20或80为非离子表面活性剂，表面活性剂之所以能增加难溶性药物的溶解度，一般认为是由于它能在水中形成胶团的结果。聚山梨酯20或80在一定剂量范围内能减少制剂中抗体的聚集、颗粒在制剂中的形成及吸附，优选0.01％-0.03％(w/v)的聚山梨酯20。
44.本发明不限制抗cd20单克隆抗体的来源，可参照现有技术的或本领域公知的方法制备，验证明采用本发明的技术方案均可使得抗cd20单克隆抗体液体制剂的稳定性提高。
45.本发明所述的单克隆抗体适用于静脉注射，适应症包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、wegener氏肉芽肿和显微镜多血管炎。本发明所述的抗cd20单克隆抗体的液体制剂可单独使用，也可与其他抗肿瘤药物环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松等联合用药。
46.本发明的液体制剂，所用的辅料更少，操作更简单，成本更低，更适合于本发明中的抗cd20单克隆抗体的长期稳定保存。
具体实施方式
47.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不能因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中稳定性试验，相关生物学检验按照中国药典的规范进行。实施例中所述的试剂均为药用级，市面均有出售。所述1w/v即10mg/ml。下列案例只是制剂筛选试验的部分，仅用于说明筛选出最合适的条件，并用于全部说明。
48.实施例1
49.(1)处方
[0050][0051]
(2)制备方法
[0052]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，
溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0053]
实施例2
[0054]
(1)处方
[0055][0056][0057]
(2)制备方法
[0058]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph5.5，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为40mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0059]
实施例3
[0060]
(1)处方
[0061][0062]
(2)制备方法
[0063]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.5，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为60mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0064]
实施例4
[0065]
(1)处方
[0066][0067][0068]
(2)制备方法
[0069]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后准确称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、蔗糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0070]
实施例5
[0071]
(1)处方
[0072][0073]
(2)制备方法
[0074]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、山梨醇和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0075]
实施例6
[0076]
(1)处方
[0077]
[0078][0079]
(2)制备方法
[0080]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、甘露醇和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为40mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0081]
实施例7
[0082]
(1)处方
[0083][0084]
(2)制备方法
[0085]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温80，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为70mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0086]
实施例8
[0087]
(1)处方
[0088]
[0089][0090]
(2)制备方法
[0091]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温80，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为60mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0092]
实施例9
[0093]
(1)处方
[0094][0095]
(2)制备方法
[0096]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、葡萄糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0097]
实施例10
[0098]
(1)处方
[0099]
[0100][0101]
(2)制备方法
[0102]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0103]
实施例11
[0104]
(1)处方
[0105][0106]
(2)制备方法
[0107]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph5.4，将抗cd20抗体原液超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0108]
实施例12
[0109]
(1)处方
[0110]
[0111][0112]
(2)制备方法
[0113]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0114]
实施例13
[0115]
(1)处方
[0116][0117]
(2)制备方法
[0118]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0119]
实施例14
[0120]
(1)处方
[0121]
[0122][0123]
(2)制备方法
[0124]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为25mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0125]
对比实施例1
[0126]
(1)配方
[0127][0128]
(2)制备方法
[0129]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为25mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0130]
对比实施例2
[0131]
(1)处方
[0132][0133]
[0134]
(2)制备方法
[0135]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0136]
对比实施例3
[0137]
(1)处方
[0138][0139]
(2)制备方法
[0140]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0141]
对比实施例4
[0142]
(1)处方
[0143][0144][0145]
(2)制备方法
[0146]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮c30、桔酸丙酯、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0147]
对比实施例5
[0148]
(1)处方
[0149][0150]
(2)制备方法
[0151]
称取处方量的缓冲剂，加入注射用水溶解，调节ph6.0，将抗cd20抗体原液超滤换液至l-组氨酸-盐酸缓冲液中，然后称取处方量的聚维酮k30、甲硫氨酸、海藻糖和吐温20，溶解并混合均匀，再用缓冲体系调节抗cd20单克隆抗体浓度为50mg/ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，罐装入西林瓶即得。
[0152]
验证实施例
[0153]
1.差示量热扫描(dsc)
[0154]
将对比实施例1-4和实施例1-14的抗cd20单克隆抗体的半成品溶液通过逐渐升温测定抗cd20单克隆抗体溶液的熔化温度t
m
值。结果见表1。
[0155]
方法:采用micro cal tm vp-capillary dsc仪器，在仪器程序控制温度下，测定溶液中蛋白质的tm值。样品用对应的缓冲溶液稀释至1mg/ml。取350μl样品加入到96孔板的样品孔，相应的缓冲液取350μl加入到buffer孔，扫描温度设置为20～90℃，扫描速率为60℃/hr。数据分析采用micro cal vp-capillary dsc自动分析软件。
[0156]
表1 dsc检测结构
[0157]
样品t
m onset
/℃t
m1
/℃t
m2
/℃实施例149.9268.3679.56实施例248.5364.5578.82实施例348.0265.4778.34实施例449.3667.2179.16实施例547.7363.2877.69实施例647.2162.3377.28实施例748.4564.3578.91实施例847.7265.6877.26实施例946.3156.4370.38实施例1046.8957.7970.87实施例1145.4653.6969.06实施例1245.0252.2769.76
实施例1344.1250.8970.15实施例1445.7954.6970.59对比实施例139.3747.9669.43对比实施例240.4648.7370.85对比实施例340.8549.2671.04对比实施例441.4549.8771.56对比实施例542.2950.1270.21
[0158]
t
m
值表示蛋白热转变的中点温度，对于多结构域蛋白可以有多个t
m
值，它是蛋白质热稳定性的重要指标，上移代表了稳定性的增强，可以用来评估聚体的形成趋势。t
m onset
是去折叠初始的温度。由表1结果可知，实施例1-8的t
m
值较高，t
m
值较高表明使用该制剂配方所得的抗cd20单克隆抗体液体制剂比较稳定。
[0159]
2.稳定性试验
[0160]
分别按照实施例1-14及对比实施例1-5制备样品三批，采用加速稳定性试验和长期试验考察贮存稳定性。
[0161]
加速试验在25℃
±
2℃的条件下进行，时间为12个月。所用设备能控制温度
±
2℃，并对实际温度进行监测。在试验期间第0个月、3个月、6个月、12个月末取样一次，按稳定性重点考察项目检测。长期试验在2～8℃的条件下进行，分别于0个月、3个月、6个月、12个月、24个月末按稳定性重点考察项目进行检测；结果见表2、表3。
[0162]
表2 2～8℃长期稳定性实验结果
[0163]
[0164]
[0165][0166]
2-8℃长期稳定性实验结果表明，在2-8℃条件下12个月后，所选配方制剂实施例1-8的sec主峰纯度、总的重链及轻链的纯度和活性变化较小，均在所规定的限值内，证实所
选配方制剂在2-8℃至少能保持12个月以上稳定，其稳定性显著优于配方外的制剂。
[0167]
表3. 25℃加速稳定性实验结果
[0168]
[0169]
[0170][0171]
25℃加速实验结果表明，在25℃条件下六个月后，所选配方制剂的sec主峰纯度、总的重链及轻链的纯度和活性变化较小，均在所规定的限值内，证实所选配方制剂在25℃至少能保持六个月以上稳定，其稳定性显著优于配方外的制剂。