一种双价支气管炎核酸疫苗、制备方法及用途与流程

本发明属于动物疫苗抗原制备技术领域，涉及一种双价禽类传染性支气管炎核酸疫苗的制备方法及其免疫用途。

背景技术：

传染性支气管炎(infectiousbronchitis，ib)是由鸡传染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus，ibv)感染引起的一种鸡的急性、高度接触传染性呼吸道传染病。该病毒属于冠状病毒科，冠状病毒属的单股正链rna病毒，病毒粒子带有囊膜和纤突，含有纤突(s)，膜(m)糖蛋白及内部核衣壳(n)蛋白等三种蛋白，感染后以咳嗽、喷嚏和气管啰音为主要临床表现，可出现产蛋下降，肾病理性肿大，尿酸盐沉积等。其中，雏鸡病死率可达10％～30％，目前临床无有效治疗方式，主要以疫苗预防为主，国内已上市的多为h120和h52鸡胚适应株制备的弱毒苗，而国外多国已分离的毒株多与马萨诸塞株(m41株)相似，已上市了m41株灭活苗，但其受制于流行株多而复杂，各血清型交叉免疫性差等因素的影响，其临床保护效果均非常有限；目前制备疫苗的手段还包括亚单位疫苗或核酸疫苗，但亚单位疫苗需要表达纯化，再进行免疫，具有步骤繁杂，较难去除发酵表达过程中产生的内毒素的问题，现有的核酸疫苗也具有需提纯后再滴鼻免疫以及抗原表达量低，特异性差等缺点，本发明由此而来。

技术实现要素：

基于当前对寻找预防家禽传染性支气管炎药物的迫切需求，本发明为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种双价传染性支气管炎核酸疫苗，其氨基酸序列包含：

1)流感病毒血凝素信号肽；

2)m41株s1蛋白部分氨基酸序列；

3)连接12氨基酸lingker；

4)h120株s1蛋白部分氨基酸序列。

进一步的，所述核酸疫苗的核苷酸序列如seqidno：2所示。

进一步的，所述核酸疫苗的氨基酸序列如seqidno：1所示。

进一步的，所述核酸疫苗选用鼠伤寒沙门氏菌(cmcc(b)50115)作为质粒载体。

进一步的，所述核酸疫苗中含有有鸡β-actin启动子的pcaggs表达质粒。

进一步的，所述核酸疫苗表达序列插入到pcaggs载体的1718bp碱基ecori酶切位点及1810bp碱基bgiii酶切位点之间位置。

进一步的，所述核酸疫苗经过密码子适应性优化后，前端加入了kozak序列accaccatggcc，核苷酸序列如seqidno：3所示。

本发明提供了一种双价传染性支气管炎核酸疫苗的制备方法，其步骤包括：

选定伤寒沙门氏菌(cmcc(b)50115)做为核酸疫苗质粒载体菌种，接种于培养基中培养，收集菌体沉淀；菌体转入4℃的冷超纯水中，适应30min以上，冷水冲洗3遍，离心，最后用300μl冷超纯水重悬，制备感受态细胞。运用伯乐电转仪，选用板间距为0.2cm电转杯，电转参数设置电压1450v，电激时间2ms，进行电转，电转完成后，所有液体转移人5ml麦康凯液体培养基，37℃，过夜培养。取培养物100μl，涂布在含氨苄西林(100μg/ml)的麦康凯固体平板上37℃培养过夜，挑取阳性菌落，即获得核酸疫苗。

本发明提供了双价传染性支气管炎核酸疫苗在用于制备对病毒m41毒株及h120毒株有免疫保护作用的制剂中的用途。

进一步的，所述制剂为用于预防禽类传染性支气管炎的制剂。

本发明的积极效果在于：本发明提供了一种传染性支气管炎病毒双价核酸疫苗的制备方法，其核酸载体选用鼠伤寒沙门氏菌，其为家禽机体常在菌，对宿主本身没有感染隐患，但其可支持核酸疫苗长期表达，以便达到更好的免疫效果。其制备方式仅为发酵后收集培养物，培养物直接作为疫苗，减少了蛋白纯化，除内毒素等步骤，节约了成本有利于大规模生产。其免疫方式为经口免疫，可以添加到饲料内，使用方便优于滴鼻或注射免疫。该疫苗为提高免疫效果对质粒及核酸做了优化重组，其核心表达区仅为1491bp，利于更高效表达，表达序列前引入了外源分泌信号肽，使抗原更好的释放到细胞外，刺激机体免疫反应，表达序列引入kozak序列，选用质粒含有禽启动子序列，更高效的表达抗原序列，抗原区去除了不易成为抗原的疏水区，采用m41和h120特征蛋白拼接的形式，中间连有lingker序列，使两种毒株的抗原决定簇都能充分暴露，可刺激产生针对两种毒株的中和抗体，弥补了传染性支气管炎病毒免疫交叉性差的弱点。这些优点都极大的促进了该疫苗的大规模生产及应用。

说明书附图

图1选取的传染性支气管炎m41毒株s1蛋白257氨基酸片段构象(尾部为防止蛋白缠绕加入的蛋白lingker)；

图2选取的传染性支气管炎h120毒株s1蛋白212氨基酸片段构象；

图3m120两毒株s1蛋白信号肽分布；

图4疫苗合成抗原多肽链结构；

图5免疫荧光检测结果。

具体实施方式

实施例1

本发明提供了的核酸疫苗，选用鼠伤寒沙门氏菌(cmcc(b)50115)作为核酸疫苗质粒载体，其优点在于鼠伤寒沙门氏菌经口服免疫后可长期定殖于鸡肝脏等组织，不被清除，这为疫苗提供了长期在体留存途径，其携带的核酸质粒可长期在体内留存并表达抗原，为机体提供长期的抗原刺激，而且该载体疫苗可通过发酵培养获得，与常规的核酸疫苗相比，其省去了质粒提取及除内毒素过程，其免疫也不需要专门的滴鼻操作，而是通过食物添加剂的形式经口免疫，其有利于大规模生产及广泛应用。本方法取鼠伤寒沙门氏菌(cmcc(b)50115)，涂布营养琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单菌落，接入麦康凯液体培养基37℃，摇菌过夜，收集菌体沉淀，随即菌体转入4℃的冷超纯水中，适应30min以上，冷水冲洗3遍，离心，最后用300μl冷超纯水重悬，制备感受态细胞，选用伯乐电转仪，选用板间距为0.2cm电转杯，电转参数设置电压1450v，电激时间2ms，电转完成后，所有液体转移人5ml麦康凯液体培养基，37℃，过夜培养。取培养物100μl，涂在含氨苄西林(100μg/ml)的麦康凯固体平板上37℃培养过夜，挑取阳性菌落，即获得以鼠伤寒沙门氏菌(cmcc(b)50115)为载体的核酸疫苗。

本发明提供了一种核酸疫苗的氨基酸序列组成方式。为提高宿主表达效率与适应性本核酸疫苗选用的质粒为带有鸡β-actin启动子的pcagss表达质粒。

表达达质粒序列结构来自于addgene载体数据库，本核酸疫苗选择核酸片段插入质粒位置为1718bp碱基ecori酶切位点及1810bp碱基bgiii酶切位点之间。质粒序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并测序。

为适应国内传染性支气管炎流行现状，国内主要流行为m41及h120株，本序列选用纤突s蛋白中的s1部分作为抗原基因，因s1蛋白包括大部分的亲水区及小部分的疏水区，本核酸疫苗为利于抗原表达只选用两株毒株的s1蛋白亲水区作为抗原序列，并对序列的密码子进行了适应性优化，为使核酸疫苗具有双价保护效力，本核酸疫苗采用m41及h120两段优化后s1蛋白序列串联后中间加入linker的方式使两个蛋白不相互干扰遮盖抗原决定簇，加入lingkergsggsggsggsg(共12个氨基酸；g：甘氨酸，s：丝氨酸)后，重组蛋白的空间结构及lingker位置如附图1、附图2。

本发明提供的用于传染性支气管炎m41与h120双价核酸疫苗制备的序列及其排列方案如下，首先检测m41与m120两毒株s1蛋白前十八位氨基酸同为信号肽序列(如附图3)，该序列首先采用流感病毒血凝素信号肽(mktiialsyifclvlg)作为先导，m41株s1蛋白序列紧随其后，之后连接12氨基酸lingker，后接去除前十八位氨基酸信号肽的h120毒株氨基酸序列。其氨基酸序列如seqidno.1所示，是由497个氨基酸残基组成的肽链，具体排布方式如附图4。

将双价传染性支气管炎核酸疫苗进行优化，优化后的核酸序列为seqidno.2。

本发明提供了一组经优化后的核酸序列用于双价传染性支气管炎疫苗构建，本序列来源于传染性支气管炎m41与h120毒株s1蛋白的核酸序列，经过密码子适应性优化后，前端加入了kozak序列accaccatggcc，质粒序列排布及注释特征如seqidno.3。

核酸疫苗表达质粒结构及序列全长如上所述，全长委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并成环扩增，测序正确。

实施例2

本发明所述的双价传染性支气管炎核酸疫苗的制备方法，包括以下步骤：

按上述序列，合成质粒转化入大肠杆菌top10感受态细胞扩增，经质粒提取富集扩增后，电转入鼠伤寒沙门氏菌(cmcc(b)50115)，电转后涂含氨苄霉素的营养琼脂平板，经筛选后，挑取单菌落，用麦康凯肉汤培养基发酵扩增培养，培养物离心后收集的培养物及为该核酸疫苗。

具体的制备方法如下：

1.质粒获取扩增

1.1核酸疫苗质粒pcagss-m41-h120(序列如上所述)，交由生工生物工程(上海)股份有限公司全合成并测序确认，合成质粒取2.5μg质粒，加入100μl超纯水，溶解，3000rpm/min离心1min，收集溶解液。

1.2将连接产物转化入大肠杆菌top10中，top10感受态在-80℃冰箱取出之后，每100μl感受态细胞加入10μlpcagss-m41-h120重组质粒，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴刺激2-3min，加1mllb液体培养基37℃摇半个小时，均匀涂在含氨苄西林(100μg/ml)的lb平板上37℃培养过夜。

1.3挑取阳性菌落，加入到lb液体培养基里，并在培养基内加入氨苄西林(100μg/ml)，37℃，摇菌过夜，转速160rmp/min。摇菌终浓度大于1od，8000rmp/min，离心2min，收集菌液，使用天根质粒小提试剂盒提取质粒(操作详见天根质粒小提试剂盒使用说明书)，重新溶剂后质粒取10μl送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4测序结果与提供合成的质粒序列对比，blast对比同源率99.87％，检测启动子序列，酶结合位点，及插入疫苗的核心序列均未移码或发生突变，随即进行下一步操作。

2.电转入沙门氏菌

2.1取鼠伤寒沙门氏菌(cmcc(b)50115)，涂布营养琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单菌落，接入麦康凯液体培养基37℃，摇菌过夜，摇菌终浓度大于1od时，8000rmp/min，离心2min，收集菌体沉淀，随即菌体转入4℃的冷超纯水中，适应30min后，冷水冲洗3遍，离心，最后用300μl冷超纯水重悬，制备感受态细胞，感受态细胞含量约1*10⁸cfu/ml。

2.2试验选用伯乐电转仪，电转杯选用一次性板间距为0.2cm电转杯，电转参数设置电压1450v，电激时间2ms，电转体积液面高度大于电转杯的2/3。电转完成后，所有液体转移人5ml麦康凯液体培养基，37℃，过夜培养。取培养物100μl，涂在含氨苄西林(100μg/ml)的麦康凯固体平板上37℃培养过夜，挑取阳性菌落，加入麦康凯液体培养基中，37℃，摇菌过夜，转速160rmp/min。次日，8000rmp/min，离心2min，收集菌液，并提取质粒(操作同上)。

3.表达检测

3.1质粒pcr鉴定选用20μl，反应体系组成如下：ddh2o10μl；2×taqpcrmastermix8μl；模板dna1μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl；

设置pcr反应程序

引物序列如下表所示：

表1引物序列

琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物大小为1500bp左右，生工测序鉴定与设计的序列同源性为99.8％，未发生移码及偏移。

3.2将9-10日龄发育良好的spf鸡胚用5％的碘棉消毒蛋壳及气室部位，再用酒精棉脱碘，取出鸡胚放入平皿，用pbs冲洗，去头，四肢和内脏，再用pbs冲洗两次，剪刀剪成小块，加入4ml0.25％胰酶溶液，37℃消化30min，消化结束，弃掉胰酶消化液，用pbs冲洗两次，将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中加入适量培养液(培养基：mem培养基；双抗：1％；胎牛血清：6％；谷氨酰胺：1％)，过滤，计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个，37℃，5％co2培养。

细胞培养24小时贴壁良好后，取细胞爬片培养入6孔板，取10μl质粒，加入15μllipofectamine2000转染试剂，孵育15min后加入1ml无血清培养基，加入细胞孔内再孵育15min，随后加入4ml无血清培养基，培养4h后换带有胎牛血清培养基继续培养24h(转染步骤参考invitrogenlipofectamine2000说明书)，培养后细胞冷丙酮固定15min，用fitc标记的传染性支气管炎病毒兔igg二抗，免疫组化检测细胞抗原表达情况，如附图5所示。

免疫荧光检测，转染效率约为30％-40％，试剂盒检测的传染性支气管炎病毒s1蛋白在鸡胚成纤维细胞内可成功表达。

4.制备收集

取上述鉴定为阳性的菌株作为种菌，加入20％灭菌甘油后-80℃冻存，每次复苏取一只，冷水融化，取培养物100μl，涂在含氨苄西林(100μg/ml)的麦康凯固体平板上37℃培养过夜，挑取阳性菌落，加入麦康凯液体培养基中，37℃，摇菌(160rmp/min)过夜，5ml扩入5l麦康凯液体培养基中，分为10个2000ml的三角瓶摇菌，每瓶加500ml，37℃，摇菌过夜；大规模离心收集菌体，即为制备的核酸疫苗。

以下实验表明本发明的免疫效果。

实施例3

本发明公布了该双价传染性支气管炎核酸疫苗免疫保护鸡传染性支气管炎病的医学用途。选取15-20日龄雏鸡，培养物经拌料给药免疫，每只1*10⁶cfu，连续免疫三天，免疫后15天滴鼻感染传染性支气管炎病毒，免疫组发病率显著低于对照组。

具体实验方式如下：

取120只15日龄雏鸡(母)，分别饲养于隔离器中，各隔离器均带有独立的过滤通风系统，防止交叉感染，雏鸡30只为一组，不同的组不饲养在同一个隔离器中，其中第一组60只喂养正常育雏料，剩余60只喂养三天加入核酸疫苗的育雏料(1*10⁷cfu/kg)，再正常饲养15d后，30只正常饲养的雏鸡及30只免疫雏鸡滴鼻攻毒m41传染性支气管炎病毒，剩余60只也攻毒h120传染性支气管炎病毒(攻毒使用收获的染毒鸡胚尿囊液，每只20μl)。攻毒后第7天，21天观察统计雏鸡状态如下表所示：

表2雏鸡状态观察

观察结束后剖检存活的雏鸡检查肾脏尿酸盐沉积情况(花斑肾)，其中免疫攻毒m41组有11只，无肾脏病变，免疫攻毒h120组6只无肾脏病变。综合以上数据，制备的该核酸疫苗在综上所述的条件下，可以显著降低m41株及h120株传染性支气管炎病毒的感染及发病率，按典型症状及病死率比较，该疫苗对两株毒株均有一定的保护效果，其中m41优于h120，剖检观察肾脏病变情况以肾脏未发生病变为保护力有效统计，该核酸疫苗对m41的保护率为36.67％，对h120的保护率为20％。因此，该疫苗对预防传染性支气管炎病毒感染有显著免疫保护效果。

序列表

<110>徐晓芳

<120>一种双价支气管炎核酸疫苗、制备方法及用途

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>497

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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