治疗I型糖尿病汤剂及其制备方法和应用

本发明属于治疗i型糖尿病药物技术领域，具体来说涉及一种治疗i型糖尿病汤剂及其制备方法和应用。

背景技术：

i型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病，截止目前，i型糖尿病患者已经高达1.14亿，患病率高达11.1％。根据我国现状研究发现，i型糖尿病发病群体由青少年向成年转移，且发病人数持续上涨。研发治疗糖尿病药物刻不容缓。糖尿病又会导致多种慢性合并症，例如肾病，眼病，肝病等。其中糖尿病并发性肝病是糖尿病患者死亡的第四大原因。它主要是由于持续的高糖引起炎症、氧化应激等,导致肝脏受损，而肝脏损伤又可导致糖耐量异常和糖尿病，两者可形成恶性循环，甚至导致肝硬化。

目前临床上多采用胰岛素治疗i型糖尿病可得到满意的效果，胰岛素治疗仅是向患者提供机体缺乏的胰岛素，并无修复胰岛β细胞的作用，并不能从根本上解决胰岛素缺乏的问题。同时胰岛素须通过皮下注射造成用药不便，且需终身用药易造成胰岛素抵抗，给治疗带来极大困难。目前治疗糖尿病的药物多经过肝脏代谢，长期用药表现出肝脏损伤。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法。

本发明的另一目的是提供上述制备方法获得的治疗i型糖尿病汤剂，该治疗i型糖尿病汤剂不仅可以有效的降低血糖含量、升高血清及组织胰岛素水平，同时其强大的保肝作用，既对糖尿病具有较好的治疗效果，又能够避免糖尿病并发性肝病以及糖尿病长期服药导致的肝脏损伤。

本发明的另一目的是提供一种治疗i型糖尿病的中药汤剂。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

一种治疗i型糖尿病的中药汤剂，包括百合和乌药(由百合和乌药组成)或对百合和乌药浸提而成。

在上述技术方案中，按质量份数计，所述百合和乌药的比为(9～11)：(1～5)。

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将百合和乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡40～60分钟，于70～80℃熬制40～60分钟，过滤，得到第一滤液和滤渣；

第2次水提：将所述滤渣加入水，再于70～80℃熬制40～60分钟，过滤，得到第二滤液；

在所述步骤1中，按质量份数计，所述百合和乌药的比为(9～11)：(1～5)。

在上述技术方案中，所述水均为双蒸水。

在所述步骤1中，所述百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:(6～8)，所述质量份数为g，所述体积份数为ml。

在所述步骤1中，所述过滤采用纱布。

在所述步骤1中，所述百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:(3～8)，所述质量份数为g，所述体积份数为ml。

步骤2，将所述第一滤液和第二滤液混合，得到原液，浓缩所述原液至浓度为0.08～2.0g/ml，得到治疗i型糖尿病汤剂。

在所述步骤2中，浓缩至所述治疗i型糖尿病汤剂的浓度为0.1～1.7g/ml。

上述制备方法获得的治疗i型糖尿病汤剂。

上述治疗i型糖尿病汤剂作为降低血糖药物、升高胰岛素药物、减轻肝脏纤维化药物、降低血清中alt药物和/或降低血清中ast药物的应用。

本发明的有益效果如下：

1、本发明治疗由stz(链脲佐菌素：自由基激活剂，能够选择性的破坏胰岛β细胞，引起糖代谢紊乱；又能够使己糖激酶缺乏，使葡萄糖不能磷酸化，从而葡萄糖穿过细胞膜逸出，造成高血糖及糖尿病症状)诱导的i型糖尿病，通过治疗小鼠发现，治疗i型糖尿病汤剂可明显抑制i型糖尿病小鼠体重减轻状况，具有降低血糖含量、升高血清及胰腺中胰岛素水平的优点，人和小鼠同属于哺乳动物，并且在药物吸收分布代谢排泄方面途径基本相同，因此，本发明治疗i型糖尿病汤剂对人体i型糖尿病具有良好的改善作用。

2、糖尿病长期高血糖多会导致并发性肝病，服用本发明的治疗i型糖尿病汤剂后通过肝功能等一系列检测发现血清中alt(丙氨酸氨基转移酶)、ast(天冬氨酸氨基转移酶)水平明显降低，肝脏指数明显改善，减少由糖尿病引起的糖原沉积及纤维化情况、提高血清及肝脏的抗氧化和抗炎水平。

3、治疗i型糖尿病汤剂采用口服方式给药，可以避免皮下注射造成的用药不便等弊端。

附图说明

图1a为小鼠的血糖；

图1b为小鼠血清中谷氨酸转氨酶(alt)的含量；

图1c为小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(ast)的含量；

图2a为小鼠在给药六周内的体重变化；

图2b为小鼠的血糖；

图2c为小鼠胰腺中的胰岛素含量；

图2d为小鼠血清中的胰岛素含量；

图3a为小鼠血清中谷氨酸转氨酶(alt)的含量；

图3b为小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(ast)的含量；

图3c为小鼠的肝脏指数；

图4为小鼠肝右叶组织的he染色和masson染色，其中，a～g为he染色，h～n为masson染色，a：正常组，b：模型组，c：阳性组，d：灌胃实施例5治疗i型糖尿病汤剂，e：灌胃实施例6治疗i型糖尿病汤剂；f：灌胃实施例7治疗i型糖尿病汤剂，g：灌胃实施例8治疗i型糖尿病汤剂；

h：正常组，i：模型组，g：阳性组，k：灌胃实施例5治疗i型糖尿病汤剂，l：灌胃实施例6治疗i型糖尿病汤剂；m：灌胃实施例7治疗i型糖尿病汤剂，n：灌胃实施例8治疗i型糖尿病汤剂。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

下述实施例中所涉及的仪器型号和厂家如下：

全自动生化分析仪型号smt100北京普朗新技术有限公司

旋转蒸发仪型号n-1100上海爱朗仪器有限公司

稳豪倍优型血糖仪型号cnhbc58强生(中国)医疗器材有限公司

下述实施例中所涉及药品的购买源如下：

stz(链脲佐菌素)(cayman公司)

天冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒(北京瑞正善达生物工程技术有限公司)

丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒(北京瑞正善达生物工程技术有限公司)

胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司)

0.1m柠檬酸钠缓冲溶液(beijingsolarbbioscience&technologyco.lta)

masson三色染色液(北京雷根生物技术有限公司)

实施例1

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和3g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数之和和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数之和和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至0.429g/ml，得到76.92ml治疗i型糖尿病汤剂。

实施例2

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和9g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至0.507g/ml，得到76.92ml治疗i型糖尿病汤剂。

实施例3

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和12g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至0.546g/ml，得到76.92ml治疗i型糖尿病汤剂。

实施例4

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和15g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至0.585g/ml，得到76.92ml治疗i型糖尿病汤剂。

分组及给药：选取动物为健康且体重为20±2g的昆明种小鼠，适应性喂养一周，随机分配为正常组、模型组、阳性组和治疗i型糖尿病汤剂组，正常组、模型组和阳性组每组10只小鼠，治疗i型糖尿病汤剂组80只。

除正常组外，其余组小鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射stz溶液(0.1m柠檬酸钠缓冲液(ph＝4.5)溶解stz，冰浴，现配现用)，stz溶液中stz的浓度为0.625mg/ml，小鼠每10g重量给予腹腔注射stz溶液0.1ml。正常组腹腔注射生理盐水(小鼠每10g重量给予腹腔注射0.1ml生理盐水)。所有小鼠的注射均1次/d，每天早九点注射,连续5d，间隔5d后使用血糖仪，通过尾静脉取血，检测随机血糖值。若随机血糖值高于13.9mmol/l，即可初步判断造模成功。

造模成功后进行给药：正常组和模型组均按每10g小鼠体重灌胃0.1ml生理盐水，每天早九点灌胃；阳性组按小鼠每10g重量皮下注射0.091u胰岛素，早晚各一次；治疗i型糖尿病汤剂组按小鼠每10g体重灌胃0.1ml本发明实施例1～8中一种治疗i型糖尿病汤剂，每个实施例灌胃10只小鼠，每早九点灌胃一次。以上给药持续6周。

血糖的检测：给药期间每隔7天于早9点测量小鼠空腹血糖值及体重变化，小鼠尾部静脉取血。测量小鼠空腹血糖值及体重变化前一天末次给药当晚禁食12个小时。静脉取血的方法：体积分数为75％乙醇擦拭小鼠尾部，尾部静脉采血一滴于血糖试纸，血糖仪读数。采血过程动作轻柔，避免外界压力使小鼠产生应激反应。

小鼠血清的收集：实验各组小鼠灌胃6周后，禁食12h，采用体积分数为1％戊巴比妥钠水溶液按0.1ml每10g小鼠体重的剂量将小鼠麻醉，腹主动脉取血，4℃冰箱静置3h，于4℃高速离心机3000r/min，离心10min，取上清液，获得血清，-80℃冰箱冻存备用。

血清中alt、ast检测：-80℃冰箱取出血清，待完全融化后，在震荡混悬仪上混合均匀后，取部分血清。利用全自动生化仪检测alt、ast，操作严格按照试剂说明书进行。

统计学方法：spss17.0分析实验数据，实验数据均采用均数±标准差(x±s)。

图1a为实验各组小鼠血糖的变化情况，可以观察到治疗i型糖尿病汤剂组对i型糖尿病小鼠的血糖均有改善作用，其中实施例1和实施例2的效果最为明显，实施例2的效果最佳且优于阳性组。

图1b和图1c分别为血清中谷氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)含量，为评价肝功能的重要指标，当肝脏受损时，肝脏细胞膜的通透性增加，alt、ast释放入血。与模型组相比，本发明的治疗i型糖尿病汤剂各剂量组均可以降低血清中alt和ast的含量，实施例2对肝功能的改善效果优于其他三个比例，最接近阳性组水平。

实施例5

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和9g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至1.521g/ml，得到25.64ml治疗i型糖尿病汤剂。

实施例6

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和9g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至0.507g/ml，得到76.92ml治疗i型糖尿病汤剂。

实施例7

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和9g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至0.225g/ml，得到173.3ml治疗i型糖尿病汤剂。

实施例8

一种治疗i型糖尿病汤剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在熬药罐中，将30g百合和9g乌药混合，进行2次水提，其中，

第1次水提：加入水，先浸泡50分钟，于80℃熬制60分钟，采用三层纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；百合和乌药的质量份数和第1次水提所加入水的体积份数的比为1:7，质量份数为g，体积份数为ml。

第2次水提：将滤渣加入水，于80℃熬制40分钟，采用三层纱布过滤，得到第二滤液；百合和乌药的质量份数和第2次水提所加入水的体积份数的比为1:4，质量份数为g，体积份数为ml。

步骤2，将第一滤液和第二滤液混合，得到原液，用旋转蒸发仪浓缩原液的浓度至0.1125g/ml，得到346.67ml治疗i型糖尿病汤剂。

肝脏的取材及病理学检测：取小鼠肝脏，用质量分数0.9％生理盐水把其冲洗干净，放入直径为5cm的培养皿中，称重。取肝脏整个右叶放入质量分数为4％多聚甲醛水溶液中固定，后脱水石蜡包埋，用石蜡切片机按3μm厚度切片，二甲苯脱蜡至水约1h，he和masson染色，脱水透明封片，于光学显微镜下观察并拍照分析。

胰岛素含量测定：血清及胰腺中胰岛素含量均按照南京建成生物工程研究所试剂盒进行实验。

i型糖尿病指标为体重、血糖、胰腺胰岛素和血清胰岛素。

图2a为实验组小鼠给药六周中体重变化图。正常组小鼠体重呈稳步增长；模型组体重出现明显的抑制现象；治疗i型糖尿病汤剂组体重相较于模型组体重出现明显升高，其中实施例5和实施例7对体重的改善效果优于阳性组。

图2b为实验各组小鼠给药六周后血糖情况。与正常组小鼠相比，造模后各组小鼠血糖浓度明显升高，存在极显著性差异，给予治疗i型糖尿病汤剂灌胃六周后，血糖均得到明显改善，灌胃实施例5及实施例6治疗i型糖尿病汤剂的小鼠的血糖下降最为明显，优于阳性组。

图2c为实验各组小鼠胰腺中胰岛素含量。胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。造模后，与正常组相比，模型组胰岛素含量明显降低，阳性组与治疗i型糖尿病汤剂组胰腺胰岛素含量明显高于模型组,治疗i型糖尿病汤剂组的效果接近于阳性组。说明治疗i型糖尿病汤剂对胰岛β细胞存在修复作用。

图2d为实验各组小鼠血清中胰岛素含量。胰腺分泌胰岛素释放入血，从而增加组织细胞对葡萄糖的利用。与正常组相比，模型组血清中胰岛素含量明显降低，阳性组由于皮下注射胰岛素后，血清中胰岛素含量相对于模型组显著性升高；治疗i型糖尿病汤剂组治疗六周后血清中胰岛素含量明显升高，实施例6效果与阳性组水平相同，实施例7和实施例8的效果优于阳性组。

图3a和图3b分别为血清中谷氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)含量，为评价肝功能的重要指标，当肝脏受损时，肝脏细胞膜的通透性增加，alt、ast释放入血。与正常组相比，模型组alt、ast水平明显升高，阳性组和治疗i型糖尿病汤剂组与模型组相比均能降低alt和ast的含量，且呈梯度依赖性。实施例7和实施例8的效果趋于阳性组基本回归正常水平，表明治疗i型糖尿病汤剂对stz诱导的糖尿病肝病具有较好的改善作用。

图3c为实验各组小鼠给药六周后肝脏指数的变化。肝脏指数为肝指数＝肝脏质量/体质量×100％。与正常组相比，模型组小鼠肝脏指数明显升高,表明糖尿病小鼠的肝脏发生了炎性肿大，治疗i型糖尿病汤剂组与模型组相比可降低糖尿病小鼠的肝脏指数，其实施例5和实施例8的治疗效果优于阳性组。

图4a～g为各组小鼠的肝右叶组织he染色，a：正常组，b：模型组，c：阳性组，d：灌胃实施例5治疗i型糖尿病汤剂，e：灌胃实施例6治疗i型糖尿病汤剂；f：灌胃实施例7治疗i型糖尿病汤剂，g：灌胃实施例8治疗i型糖尿病汤剂；其中，正常组小鼠的肝组织结构完整，肝细胞排列致密，模型组肝细胞受损严重，肝细胞排列松散，肝糖原沉积：肝细胞质和细胞核内均可出现糖原沉积，可见细胞核内糖原空洞，阳性组以及灌胃治疗i型糖尿病汤剂组各实施例肝细胞排列紧密，肝索排列整齐，对肝糖原沉积均有良好的改善作用，治疗i型糖尿病汤剂组各实施例肝脏he染色结果和正常组接近。

图4h-n为各组小鼠的肝右叶组织masson染色，h：正常组，i：模型组，g：阳性组，k：灌胃实施例5治疗i型糖尿病汤剂，l：灌胃实施例6治疗i型糖尿病汤剂；m：灌胃实施例7治疗i型糖尿病汤剂，n：灌胃实施例8治疗i型糖尿病汤剂，其中，纤维被染成蓝色，正常组小鼠肝组织结构正常，没有胶原纤维沉积，且没有空泡。模型组肝组织中央静脉和汇管区有胶原纤维沉积被染成蓝色，阳性组组纤维化情况得到明显改善，治疗i型糖尿病汤剂组几乎无纤维化趋近于正常组。

从上述实验结果中可以观察到，对于糖尿病实施例5和实施例6表现出较好的降糖效果，在肝脏的保护方面，实施例7和实施例8表现出较好的降低alt，ast的效果，因此对于不同的病况可以选择不同的浓度，原液的浓度较大(高剂量)有利于降糖，原液的浓度较小(相对低剂量)更有利于保肝。

本发明的治疗i型糖尿病汤剂同时具有良好的降糖和保肝作用，上述对小鼠i型糖尿病造模方式基本还原了人体糖尿病的发病过程，并且人和小鼠同属于哺乳动物，并且在药物吸收分布代谢排泄方面途径基本相同，因此，本发明的治疗i型糖尿病汤剂会在人体上表现出相同的治疗效果。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。