Ras相关蛋白2的制药用途的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种ras相关蛋白2的制药用途。

背景技术：

随着人口老龄化以及并发的高血压、动脉硬化等高危因素，主动脉瘤(aoa)及主动脉夹层(aod)的发病人数也随之增多。主动脉瘤表现为主动脉的瘤样扩张，其定义为动脉扩张为正常动脉直径的1.5倍以上。人群中超声筛查发现aoa的发病为:65岁以上男性4％～7％，女性1％～2％。主动脉夹层表现为主动脉壁内膜撕裂，循环中的血液通过内膜破口进入主动脉壁中层，导致中层大范围撕裂并形成夹层。其发病率为每年每十万人群中有0.5到2.95。aoa和aod的病因与患者年龄、男性、吸烟相关。其病理表现为主动脉中弹性蛋白水解、胶原沉积、炎症细胞浸润以及基质金属蛋白酶(mmps)表达增加。大多数aoa没有明显的症状，病程中患者常出现背部或下腹部疼痛，但未经治疗的话，aoa可能突然破裂，患者出现撕裂样疼痛时常提示aod的发生，一旦发生aod将造成内科及外科均无法及时处理的大出血，其死亡率最高可达90％。目前国内对于主动脉瘤及主动脉夹层的外科治疗水平由于设备、技术、经济等原因较为落后，药物治疗也较为单一，因此，寻找新的主动脉瘤及主动脉夹层治疗思路与靶点极为重要。

主动脉平滑肌细胞的结构及功能的完整对于维持主动脉壁的正常生物力学特性尤为重要。在特定条件下，终末分化的正常平滑肌细胞会出现表型转化，导致其生物学特性出现显著改变。有研究表明：在aoa和aod病人的主动脉中，主动脉平滑肌会由分化程度较高，增殖、迁移能力较弱的收缩型转变为分化程度较低，增殖、迁移能力较强的合成型，继而导致主动脉壁功能异常。

ras家族蛋白是一类相对分子质量为21kd的小g蛋白，作为信号转导中重要的分子开关，与许多不同的调控因子和效应器分子相互作用，产生多种细胞功能。ras相关蛋白2(r-ras2)，也称作tc21，属于ras小g蛋白超家族的r-ras亚家族。r-ras2在小鼠多种组织中都有表达，包括胰腺，肾脏，脑，心脏，肺等组织中均有分布，其蛋白在细胞中主要定位在细胞质和细胞核中。有报道指出r-ras2的减少会促进衰老，而过表达r-ras2则可以逆转衰老相关的表型。但r-ras2在心血管疾病中的作用及其机制尚未有任何相关研究和报道。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种ras相关蛋白2的制药用途，通过调节血管平滑肌细胞表型转化，维持血管平滑肌收缩表型，参与主动脉瘤及主动脉夹层的发病。

技术方案：ras相关蛋白2在制备治疗主动脉瘤和主动脉夹层药物中的应用。

所述ras相关蛋白2的氨基酸序列如seqidno.2所示。

ras相关蛋白2在制备诊断主动脉瘤和主动脉夹层试剂盒中的应用。

ras相关蛋白2在筛选针对主动脉瘤和主动脉夹层药物中的应用。

上调ras相关蛋白2表达水平的慢病毒，所含编码ras相关蛋白2的基因序列如seqidno.1所示。

含有如seqidno.1所示编码ras相关蛋白2的基因序列的慢病毒在制备治疗主动脉夹层和主动脉瘤药物中的应用。

有益效果：发明人通过rt-pcr和westernblot发现主动脉夹层病人主动脉组织、血管紧张素ii微渗泵灌注的apoe^-/-小鼠主动脉组织以及血管紧张素ii刺激的人主动脉平滑肌细胞中r-ras2表达水平降低，平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转变。利用小干扰rna敲低平滑肌细胞中r-ras2后发现平滑肌细胞向合成型发生转变，转染r-ras2过表达质粒，能够恢复血管平滑肌细胞收缩表型。通过慢病毒平滑肌特异性的过表达r-ras2能够显著减少血管紧张素ii微渗泵灌注引起的小鼠主动脉扩张，有效抑制主动脉瘤及主动脉夹层的发生。本发明提供了一个主动脉瘤及主动脉夹层新的作用分子，明确其调控平滑肌细胞表型转化，防止主动脉瘤及主动脉夹层的发生，为主动脉瘤及主动脉夹层的诊断及治疗提供了新的靶点。

附图说明

图1为r-ras2在正常人和主动脉夹层病人的主动脉组织中的mrna表达水平：提取正常人和主动脉夹层病人主动脉组织中的mrna后，用rt-pcr检测r-ras2的表达。*p<0.05。

图2为r-ras2在正常人和主动脉夹层病人的主动脉组织中的蛋白表达水平：提取正常人和主动脉夹层病人主动脉组织中的蛋白后，用westernblot检测r-ras2的表达。*p<0.05。

图3为r-ras2在埋植生理盐水和angii微渗泵apoe^-/-小鼠主动脉中的mrna表达水平：提取埋植生理盐水和angii微渗泵的apoe^-/-小鼠主动脉组织中的mrna后，用rt-pcr检测r-ras2的表达。*p<0.05。

图4为r-ras2在埋植生理盐水和angii微渗泵apoe^-/-小鼠主动脉中的蛋白表达水平：提取埋植生理盐水和angii微渗泵的apoe^-/-小鼠主动脉组织中的蛋白后，用westernblot检测r-ras2的表达。*p<0.05。

图5为r-ras2和α-sma在埋植生理盐水和angii微渗泵apoe^-/-小鼠主动脉组织切片中的表达水平：提取埋植生理盐水和angii微渗泵的apoe^-/-小鼠主动脉组织后进行oct包埋，冰冻切片后，用免疫荧光检测r-ras2和α-sma的表达。

图6为angii刺激hasmcs后检测r-ras2表达水平：hasmcs给予1μmangii刺激24小时，westernblot检测r-ras2蛋白表达水平。*p<0.05。

图7为敲低r-ras2对平滑肌细胞收缩表型标志物的影响：hasmcs转染r-ras2小干扰rna后，westernblot检测r-ras2以及平滑肌细胞收缩表型标志物calponin1、α-sma蛋白表达水平。*p<0.05。

图8为过表达r-ras2对平滑肌细胞收缩表型标志物的影响：hasmcs转染r-ras2质粒后，给予1umangii刺激24小时，westernblot检测平滑肌细胞收缩表型标志物calponin1、α-sma蛋白表达水平。*p<0.05。

图9为慢病毒过表达r-ras2对主动脉瘤发生的影响：apoe^-/-小鼠腹腔注射对照病毒和r-ras2病毒，皮下埋植生理盐水泵作为对照组，或埋植angii渗透泵，构建小鼠主动脉瘤模型，于28天后收取其主动脉血管，主动脉血管大体拍照。

图10为病毒过表达r-ras2对血管形态的影响：apoe^-/-小鼠腹腔注射对照病毒和r-ras2病毒，皮下埋植生理盐水泵作为对照组，或埋植angii渗透泵，构建小鼠主动脉瘤模型，于28天后收取其主动脉血管，he染色检测主动脉血管形态。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1.质粒转染人主动脉平滑肌细胞

(1)将人主动脉平滑肌细胞种板培养于含2wt.％胎牛血清的smcm培养液中。

(2)细胞融合至约75％时，弃培养液，用预热的pbs洗涤细胞2次以除去培养基中剩余的血清，然后每孔加入800μlopti-mem。采用脂质体lipofectaminetm3000进行转染。

(3)吸取5μl/孔的lipo3000(使用前轻轻摇匀)加入100μlopti-mem。轻轻混匀后在室温下孵育5min。吸取2500ng质粒加入100μlopti-mem稀释，再加入10μlp3000，轻轻混合均匀。将上述所得液体等体积混合，轻轻混匀。将200μl的质粒-转染试剂混合液滴加至每孔中，轻轻摇匀。

(4)将细胞置于标准培养条件下，6小时后更换新鲜正常培养基继续培养。

(5)r-ras2过表达质粒购买于北京义翘神州科技有限公司。

r-ras2基因序列如下：seqidno.1:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/293597518/

atgtcctattttgtaacggattatgatccaaccattgaagattcttacacaaagcagtgtgtgatagatgacagagcagcccggctagatattttggatacagcaggacaagaagagtttggagccatgagagaacagtatatgaggactggcgaaggcttcctgttggtcttttcagtcacagatagaggcagttttgaagaaatctataagtttcaaagacagattctcagagtaaaggatcgtgatgagttcccaatgattttaattggtaataaagcagatctggatcatcaaagacaggtaacacaggaagaaggacaacagttagcacggcagcttaaggtaacatacatggaggcatcagcaaagattaggatgaatgtagatcaagctttccatgaacttgtccgggttatcaggaaatttcaagagcaggaatgtcctccttcaccagaaccaacacggaaagaaaaagacaagaaaggctgccattgtgtcattttctagr-ras2氨基酸序列如下：seqidno.2:

msyfvtdydptiedsytkqcviddraarldildtagqeefgamreqymrtgegfllvfsvtdrgsfeeiykfqrqilrvkdrdefpmilignkadldhqrqvtqeegqqlarqlkvtymeasakirmnvdqafhelvrvirkfqeqecppspeptrkekdkkgchcvif

2.rt-pcr

(2)样本加入1mltrizol，充分吹打裂解后吸取至去rna酶(rnaasefree)的离心管中，裂解5min。

(3)每个ep管内加入200μl的氯仿，剧烈振荡，斡旋数秒后，置于冰上裂解10min。

(4)离心，4℃，12000rpm，15min，小心吸取上层清液(500μl左右)转移至新的ep管中。

(5)加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10min。

(6)离心，4℃，12000rpm，15min，弃上清，加75％乙醇洗涤。

(7)离心，4℃，12000rpm，5min，弃上清，风干，加入适量的depc水(20～50μl)，检测rna浓度。

(8)rna的逆转录反应体系程序如下：

(9)引物设计：使用primerpremier5软件辅助设计引物，所有引物均由英潍捷基生物科技有限公司合成。

3.western-blot

(1)sds-page(聚丙烯酰氨凝胶)电泳：配制12％的分离胶和3％的浓缩胶。取15μl样品液和3μl6×加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。110v恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。

sds-page的配制：

(2)转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液(3.6g/ltris，300ml/l甲醇，17.3g/l甘氨酸)中平衡10～20min。用湿转的方法将蛋白条带转移至pvdf膜上(sds-凝胶位于负极，pvdf膜位于正极)，0.3a恒流电泳80min。

(3)封闭：转膜结束后，取下pvdf膜，pbs浸泡5min后将膜浸于含5％脱脂奶粉的pbs(mpbs)中1h。

(4)一抗孵育：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入抗体，4℃摇动下过夜。

(5)二抗结合：tbs-t(tbs中加入tween-20，浓度为0.05％)快速洗膜一遍后，tbs-t洗膜10min×3遍。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊第二抗体(1％mpbs1:2000稀释)，室温下孵育1h。tbs-t快速洗膜一遍，再洗膜10min×3遍。

(6)ecl显色：临用前将ecl显色液a与b混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，观察结果。

4.主动脉血管免疫荧光染色

(1)将石蜡切片放入65℃烘箱烘烤30min。

(2)脱蜡：二甲苯5min，共3次。100％乙醇1min。95％乙醇1min。70％乙醇1min。

(3)抗原修复：0.01m枸橼酸钠缓冲溶液(ph6.0)预热至37℃，微波炉低火加热20min。

(4)pbs缓冲液洗片，每次5min，共3次。

(5)封闭：在组织上滴加含10％山羊血清的pbs中，37℃烘箱放置20min，甩去液体。

(6)在组织上滴加一抗，4℃冰箱过夜。

(7)pbs缓冲液洗片，每次10min，共3次。

(8)滴加荧光素标记的二抗，37℃烘箱孵育30min。

(9)pbs缓冲液洗片，每次10min，共3次。

(10)滴加dapi染色液，室温放置5min。

(11)pbs缓冲液洗片，每次10min，共3次。

(12)甩去pbs，甘油缓冲液封片。

5.apoe^-/-小鼠平滑肌组织特异性过表达慢病毒

(1)取apoe^-/-sm22αcre小鼠，雄性，4周龄小鼠尾静脉注射r-ras2慢病毒(lenti-r-ras2滴度为10⁸ifu/只)

(2)小鼠spf级饲养环境饲养4周，使慢病毒稳定表达于平滑肌组织。

(3)小鼠8周龄时，埋植angii灌注微渗泵(1μg/min/kg)，对照组给予生理盐水。

(4)埋植angii灌注微渗泵4周后提取主动脉血管组织，心脏组织，测量体重等指标。

(5)r-ras2过表达慢病毒合成于苏州吉脉基因药物生物科技有限公司。

6.主动脉血管he染色

(1)将石蜡切片放入65℃烘箱烘烤30min。

(2)脱蜡：二甲苯5min，共3次。100％乙醇1min。95％乙醇1min。70％乙醇1min。

(3)蒸馏水浸洗，至玻片上不挂水珠，甩尽切片上水分，苏木素染色5min。

(4)自来水浸洗，除去切片上的浮色。

(5)1％盐酸乙醇1-3s。自来水洗涤数次。

(6)scott液1min，自来水洗数次。甩尽水分，伊红染色，血管10s。

(7)蒸馏水洗涤数下，洗去切片上浮色。70％乙醇迅速浸洗一下。95％乙醇迅速浸洗一下。100％乙醇30s，共3次。

(8)二甲苯2min，共3次。二甲苯未干时用中性树胶封片。

实验结果

为了探索在正常人主动脉组织中和主动脉夹层病人的主动脉中r-ras2是否参与了主动脉的病变，rt-pcr定量检测r-ras2mrna表达的水平，与正常人主动脉组织相比，主动脉夹层病人的主动脉组织中r-ras2的mrna表达水平明显降低(图1)。接下来，我们在蛋白水平上进一步验证此结果，发现相比于正常人主动脉组织，主动脉夹层病人主动脉组织中r-ras2的蛋白表达水平也明显降低(图2)。

为了进一步明确r-ras2蛋白在主动脉瘤及主动脉夹层中的作用，我们在apoe^-/-小鼠上埋植生理盐水和angii(1μg/min/kg)微渗泵，4周后提取小鼠主动脉血管组织，发现与生理盐水组相比，angii组小鼠主动脉组织中r-ras2的mrna(图3)和蛋白(图4)表达水平都明显降低。通过免疫荧光检测了小鼠血管组织中的r-ras2蛋白表达水平。与生理盐水组相比，埋植angii微渗泵的小鼠血管组织中r-ras2蛋白表达量降低(图5)。在细胞上水平，我们培养hasmcs细胞，angii(1μm)刺激24小时，相比于对照组，血管紧张素ii刺激能降低r-ras2蛋白表达水平(图6)。以上实验结果提示：在主动脉瘤的细胞和动物模型中，r-ras2蛋白表达水平都明显降低。

为了进一步明确r-ras2蛋白在主动脉瘤及主动脉夹层中的作用，我们将r-ras2的小干扰rna转染hasmcs细胞，发现r-ras2蛋白被小干扰rna敲低之后，hasmcs收缩型蛋白表达降低(图7)。接着，构建r-ras2过表达质粒转染hasmcs细胞，后给予angii刺激，检测收缩型蛋白表达情况，过表达r-ras2后能够明显恢复angii刺激引起的收缩型蛋白降低(图8)；

为了进一步验证r-ras2在主动脉瘤及主动脉夹层中的作用，我们分别给予4周龄apoe^-/-sm22α小鼠，尾静脉注射平滑肌特异性过表达r-ras2的慢病毒，14天后埋植生理盐水和angii微渗泵。造模4周后，提取小鼠主动脉血管，观察血管大体形态(图9)，he染色对血管瘤进行组织学分析(图10)，结果显示，平滑肌特异性过表达r-ras2慢病毒可有效防止腹主动脉扩张。he染色显示r-ras2平滑肌特异性过表达慢病毒减少主动脉瘤的形成。以上实验结果可以进一步证明：通过过表达r-ras2蛋白能够有效抑制主动脉瘤及主动脉夹层的发生。

以上的实验结果充分证明，r-ras2参与主动脉瘤及主动脉夹层的进程。通过转染过表达r-ras2的质粒或病毒，上调r-ras2的蛋白表达，可以有效抑制主动脉瘤及主动脉夹层的发展。因此，我们认为r-ras2蛋白可以作为临床上治疗主动脉瘤及主动脉夹层的一个新的重要靶标，在主动脉瘤及主动脉夹层的防治中具有潜在的临床应用价值。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南京医科大学

<120>ras相关蛋白2的制药用途

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>510

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgtcctattttgtaacggattatgatccaaccattgaagattcttacacaaagcagtgt60

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aagaaaggctgccattgtgtcattttctag510

<210>2

<211>169

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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151015

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130135140

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lyslysglycyshiscysvalilephe

165