双黄连制剂在抗病毒感染中的应用

本发明涉及医药技术领域，具体地涉及双黄连制剂在抗病毒感染中的应用。

背景技术：

在急性传染病中，绝大部分都是病毒性传染病，病毒性传染病的发病率高，死亡率也很高。

2003年我国和世界上许多国家遭到了一次大规模的非典型肺炎(atypicalpneumonias)的侵袭，即由非典型肺炎引起的严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysydrome，sars)。sars的病原体是一种单链rna病毒，命名为sars冠状病毒。

2012年，另一种冠状病毒侵袭了中东的沙特阿拉伯等国家，该病毒为命名为中东呼吸综合症冠状病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus，mers-cov)或mers病毒。mers(middleeastrespiratorysyndrome)。

2019年底，一种新型的冠状病毒再次侵袭人类，该冠状病毒为命名为2019新型冠状病毒(2019-ncov)。2019-ncov冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为具有包膜的单链正义rna病毒。和其他已知冠状病毒类似，2019-ncov冠状病毒也经过吸附、穿入、脱壳、生物合成、子代病毒的组装与释放等几个过程完成子代病毒的增殖。

此外，禽流感等流感病毒也对人类的造成了感染威胁。

一些药物如达菲等，对一些病毒感染造成的急性传染病有一定疗效，然而，一些病毒会产生耐药性，例如已发现了对达菲耐药的流感病毒株。此外，目前的药物对引起急性传染病的冠状病毒(如sars病毒、mers病毒和2019-ncov病毒)的效果有限。

迄今为止，本领域尚缺乏令人满意的有效治疗这类急性病毒性传染病的药物。因此，本领域迫切需要开发针对急性的病毒性传染病的有效的治疗药物和手段。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种针对急性的病毒性传染病的有效的治疗药物，尤其是针对冠状病毒引起的急性传染病的有效的治疗药物。

在本发明的第一方面，提供了一种绿原酸类化合物或其药学上可接受的盐或其提取物的用途，用于制备：(a)抗冠状病毒的组合物；(b)治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒(2019-ncov)感染引起的相关疾病的药物；和/或(c)抑制流感病毒的神经氨酸酶的组合物。

在另一优选例中，所述的冠状病毒选自下组：sars病毒、mers病毒、2019新型冠状病毒(2019-ncov)。

在另一优选例中，所述的冠状病毒为2019新型冠状病毒(2019-ncov)。

在另一优选例中，所述绿原酸类化合物选自下组：绿原酸类、1-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸(即新绿原酸)、1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，4-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸、或其组合。

在另一优选例中，所述的绿原酸类化合物是人工合成的、和/或从植物中提取的。

在另一优选例中，所述的绿原酸类化合物提取自选自下组的植物或药材：金银花、杜仲、甜菊叶、花椒、牛蒡、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物或药材包括根、茎、叶、花、果、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物还包括选自下组的额外组分：抗逆传录病毒的药物或增强免疫力的药物。

在另一优选例中，所述的组合物或药物包括：口服制剂和非口服制剂。

在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。

在另一优选例中，所述的药物为中药制剂。

在另一优选例中，所述的药物为双黄连制剂(口服液)。

在本发明的第二方面，提供了一种双黄连制剂的用途，它被用于制备：(a)抑制冠状病毒的组合物；(b)治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒(2019-ncov)感染引起的相关疾病的药物；和/或(c)抑制流感病毒的神经氨酸酶的组合物。

在另一优选例中，所述的冠状病毒选自下组：mers病毒、2019新型冠状病毒(2019-ncov)。

在另一优选例中，所述的冠状病毒为2019新型冠状病毒(2019-ncov)。

在本发明的第三方面，提供了一种可用于抑制2019新型冠状病毒(2019-ncov)的药物组合物，它含有(a)安全有效量的作为活性成分的绿原酸类化合物或其药学上可接受的盐、或其提取物；(b)任选的其他抗病毒活性成分；和(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物剂型为口服给药或非口服给药剂型。

在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。

在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂或针剂。

在另一优选例中，所述的绿原酸类化合物的浓度为0.01-100mg/ml，较佳地为0.1-10mg/ml。

在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制冠状病毒的方法，包括步骤：将冠状病毒与绿原酸类化合物接触，从而抑制冠状病毒。

在另一优选例中，所述的冠状病毒选自下组：sars病毒、mers病毒、2019新型冠状病毒(2019-ncov)。

在另一优选例中，所述的冠状病毒为2019新型冠状病毒(2019-ncov)。

在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性地抑制流感病毒的神经氨酸酶的方法，包括步骤：将流感病毒的神经氨酸酶与绿原酸类化合物接触，从而抑制所述的神经氨酸酶。

在另一优选例中，所述的流感病毒选自下组：禽流感病毒。

在另一优选例中，所述的流感病毒为h5n1禽流感病毒。

在本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗由2019新型冠状病毒(2019-ncov)感染引起的相关疾病的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的活性成分，所述活性成分选自下组：绿原酸类化合物、或其药学上可接受的盐或其提取物、或含所述活性成分的药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物为双黄连制剂(口服液)。

在另一优选例中，所述需要的对象为哺乳动物，例如人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个实施例中含绿原酸的活性成分对2019新型冠状病毒(2019-ncov)的抑制作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一类可有效抑制2019新型冠状病毒(2019-ncov)的活性成分，即绿原酸或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其提取物。试验表明，本发明的活性成分可高效地抑制2019新型冠状病毒(2019-ncov)和mers-cov病毒和sars病毒等冠状病毒以及h5n1等禽流感病毒的复制，可有效地用于缓解、预防和/或治疗这些病毒引起的急性病毒性传染病和症状。在此基础上完成了本发明。

冠状病毒

冠状病毒(coronaviruses)是单股正链rna病毒，属于巢病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)正冠状病毒亚科(orthocoronavirinae)，可以感染人、蝙蝠、猪、老鼠、牛、马、山羊、猴子等多种物种。已知感染人的冠状病毒(hcov)有6种，包括中东呼吸综合征相关冠状病毒(mersr-cov)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(sarsr-cov)。

武汉市不明原因肺炎患者下呼吸道分离出的冠状病毒为β属新型冠状病毒，who命名2019-ncov，是第7个可感染人的冠状病毒。目前尚无针对冠状病毒的有效疫苗和治疗药物，主要是通过防范措施控制病毒扩散，密切监控疫情，对疑似病例进行隔离观察。目前冠状病毒尚无特效治疗方法，主要采取对症支持治疗。

流感病毒

流感病毒为rna病毒，属正黏液病毒科。它的宿主是犬科动物、鸟类和一些哺乳动物。人流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型。一类流感病毒为禽流感病毒。

代表性的流感病毒包括(但并不限于)：h5n1、h1n1、h3n2、h5n1、h7n9等亚型的流感病毒。

神经氨酸酶是流感病毒颗粒表面的一种由蛋白构成的酶，是病毒复制和扩散所最关键的酶，为抗病毒药物的作用靶点。神经氨酸酶抑制药物达菲的广泛使用导致达菲耐药流感病毒株的流行。

活性成分

如本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明化合物”、“本发明的绿原酸类化合物及其衍生物”、“本发明的抗病毒的活性成分”可互换使用，都具有抗2019新型冠状病毒(2019-ncov)感染的作用的活性成分。在本发明中，用于抗2019新型冠状病毒(2019-ncov)等冠状病毒的活性成分为绿原酸或其类似物，或其药学上可接受的盐、或其提取物。

绿原酸(chlorogenicacid，以下简称ca)，是由咖啡酸(caffeicacid)与奎尼酸(quinicacid，1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，casno：327-97-9。英文名称为(1r,3r,4s,5r)-3-[(e)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy-1,4,5-trihydroxy-cyclohexane-1-carboxylicacid；或3-caffeoylquinicacid。

根据咖啡酰在奎尼酸上的结合部位和数目不同，存在多种不同的绿原酸类似物。在本发明中，术语“绿原酸类似物”指与绿原酸具有类似结构的化合物。

在本发明中，代表性的绿原酸或绿原酸类似物包括(但并不限于)：单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体，例如1-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸(即新绿原酸)、1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，4-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸。

在本发明中，绿原酸或其类似物可以人工合成，或从植物中提取。例如，可从植物中提取的绿原酸或其类似物包括：绿原酸、隐绿原酸(band510)(4-咖啡酰奎尼酸)、新绿原酸、异绿原酸a(3，5-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸b(3，4-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸c(4，5-二咖啡酰奎尼酸)、莱蓟素(1，3-二咖啡酰奎尼酸)等。

代表性的可用于提取绿原酸或其类似物的植物或药材包括(但并不限于)：金银花、杜仲、甜菊叶、花椒、牛蒡等。

本发明的活性成分化合物(如绿原酸或绿原酸类似物)可以含有一个或多个不对称中心，并因此以消旋体、外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体化合物和单一非对映体的形式出现。可以存在的不对称中心，取决于分子上各种取代基的性质。每个这种不对称中心将独立地产生两个旋光异构体，并且所有可能的旋光异构体和非对映体混合物和纯或部分纯的化合物包括在本发明的范围之内。本发明包括化合物的所有异构形式。

本发明人的研究首次揭示，绿原酸或其药学上可接受的盐或其衍生物或其提取物可以有效地抑制冠状病毒和禽流感病毒等急性传染病的病毒，因此可作为抗2019新型冠状病毒(2019-ncov)、sars、

较佳地，本发明的治疗药物为含绿原酸类化合物或其药学上可接受的盐或其衍生物或其提取物的中药制剂。

一种优选的中药制剂为中成药双黄连制剂，例如口服液。中成药双黄连制剂的功能主治为疏风解表，清热解毒。用于外感风热所致感冒，症见发热、咳嗽、咽痛。由常用中成药金银花、黄芩、连翘三味中药组成。

中成药双黄连制剂富含绿原酸，以及新绿原酸、3-咖啡酰奎宁酸、4-o-咖啡酰奎宁酸、7-o-葡萄糖苷木犀草素、连翘苷c、4”-o-β-d-吡喃葡萄糖苷木犀草素、3,5-双氧-咖啡酰奎宁酸、4,5-双氧-咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、芹菜素、黄芩素、去甲汉黄芩素、7α-莫诺苷、苄基2-o-β-d-吡喃葡萄糖基-2,6-龙胆酸、汉黄芩素等类化合物。

在双黄连制剂的药品生产中，已将绿原酸作为质量控制的重要指标之一，每毫升双黄连口服液含绿原酸大于0.6mg。

在本发明的优选实施例中，通过实验证实了双黄连制剂(口服液)对严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、流感病毒(influenzavirus)、中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysyndrome，mers)及2019-ncov(新冠状病毒)具有明显的抗病毒效应，证明了含绿原酸的中成药双黄连制剂(如口服液)可用于病毒感染性疾病的治疗。

组合物和施用方法

本发明的抗病毒的活性成分具有抑制2019-ncov等新型冠状病毒复制的作用。因此，当在治疗上施用或给予本发明的抗病毒的活性成分时，可抑制2019新型冠状病毒(2019-ncov)的复制或活力。

本发明的抗病毒的活性成分可抑制2019-ncov等新型冠状病毒的感染活性。因此，当在治疗上施用或给予本发明的的活性成分时，可抑制2019新型冠状病毒(2019-ncov)的感染，进而达到抗病毒作用。

通常，可将本发明的活性成分配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物(包括中药制剂)，它含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，以绿原酸或其类似物为计，例如每天约0.1-100毫克/50kg体重，优选地，每人每日0.2～50mg，优选0.5～20mg，每日服用1～5次(成人)；儿童的用量和次数需在成人的基础上酌情递减。

作为抗新型冠状病毒(如2019-ncov)的药物，可以制成口服和非口服制剂。口服给药可制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，所用的赋型剂可以为淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等中的一种或几种。崩解剂可以为马铃薯淀粉、羟甲基纤维素等中的一种或几种。粘合剂可以为阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、糊精等中的一种或几种。口服制剂除上述剂型外，还可以制成乳剂、糖浆剂等。

非口服制剂可以制成注射剂，可以与注射用水、生理盐水、葡萄糖水制成注射剂，也可以在其中加入一定比例的乙醇、丙醇、乙二醇等。

此外，本发明的活性成分还特别适合与其他抗病毒的药物联用。代表性的其他的抗病毒药物包括(但并不限于)：逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、辅助受体拮抗剂、逆转录病毒整合酶抑制剂、病毒吸附抑制剂、特异性病毒转录抑制剂、抗体、或其组合。

本发明的主要优点包括：

(a)以绿原酸为活性成分的药物(包括中药制剂、和中药药材)，对严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、流感病毒(influenzavirus)、中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysyndrome，mers)及2019-ncov(新冠状病毒)明显的抗病毒效应。

(b)本发明的以绿原酸为活性成分的药物具有低毒副作用，使用安全性高。

(c)本发明的以绿原酸为活性成分的药物，将对人冠状病毒防控和治疗面具有重大的意义，可为目前仍在流行的人类冠状病毒以及未来有可能爆发的新型人类冠状病毒提供有效的预防和治疗的药物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.绿原酸对sars病毒活性的抑制作用

在本实施例中，通过抗sars病毒(病毒株：bj-01)活性筛选(病毒-细胞水平模型)，验证绿原酸对sars病毒是否有抑制作用。

测试原理：以vero-e6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品抵抗病毒感染细胞的作用，检测指标为细胞变性反应(cpe)以及感染细胞保护率。

测试方法：

将vero-e6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％co2培养，分别加入不同稀释浓度的样品和sars病毒，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录cpe，并用中性红染色测定od值，参照对照进行样品抗sars病毒活性作用的计算和评价。

结果如表1所示：

结果表明，双黄连制剂的有效成分绿原酸对sars病毒具有抑制效应。

实施例2.双黄连制剂(口服液)对禽流感病毒的抑制作用。

在本实施例中，通过抗流感病毒活性筛选(神经氨酸酶活性抑制试验)，测试双黄连制剂(口服液)对禽流感病毒的抑制作用。

病毒株：禽流感病毒株h5n1(2004)，达菲耐药流感病毒株h1n1

双黄连制剂(口服液)：市售。

测试原理：

神经氨酸酶(na)是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，在流感病毒复制和传播中发挥重要作用。流感病毒神经氨酸酶(na)抑制剂是目前临床常用抗流感病毒药物达菲的作用靶点。以流感病毒神经氨酸酶作为活性药物筛选和评价靶点，可以高效、快速地筛选和评价具有抑制流感病毒神经氨酸酶作用的化合物。na抑制剂能够与病毒的na特异性结合，阻断该酶的活性，使病毒不能轻易地从感染细胞表面释放，促进病毒凝集，阻止病毒进一步扩散，从而发挥抗流感作用。本试验利用流感病毒上清含有的糖蛋白神经氨酸酶(na)能够催化底物4-munana(2-(4-methylumbelliferyl)-a-d-n-acetylneuraminicacid)生成荧光产物4-methylumbelliferone，通过检测反应溶液中的荧光强度的变化，可以评价药物是否对流感病毒神经氨酸酶具有抑制活性。

测试方法：

液体制剂中成药倍比稀释，2μl/孔加入96孔平板。加入病毒液24μl/孔，室温摇床混匀30分钟。同时设阳性对照孔(阳性对照药物达菲)和阴性对照孔(无药物)。加入assaybuffer稀释的4-munana24ul/孔(100μm/孔)。37℃孵育30分钟后，加入stopbuffer50ul/孔终止反应。355nm/460nm测定荧光强度(rfu)。参照阳性对照孔和阴性对照孔的rfu值，对样品进行抑制流感病毒神经氨酸酶的活性作用评估。

流感病毒na活性抑制％＝(阳性对照孔rfu值-样品rfu值)/(阳性对照孔rfu值-阴性对照孔rfu值)。

结果如表2所示。

表2

注：1ml培养液中含有1.14微升双黄连制剂(口服液)，依此类推。

结果表明，双黄连制剂(口服液)对禽流感及达菲耐药流感病毒株的病毒神经氨酸酶具有抑制效应。

实施例3.

双黄连制剂(口服液)对mers-cov病毒活性的抑制作用

在本实施例中，通过抗mers-cov假病毒侵入活性筛选(病毒-细胞水平模型)，验证双黄连制剂(口服液)对mers-cov病毒是否有抑制作用。

测试原理：以huh7细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品阻断mers-cov膜蛋白修饰假病毒感染细胞的活性，该活性可反应样品干预mers-cov感染关键靶点的抗病毒活性。检测指标为假病毒基因组上报告基因活性水平。

测试方法：

huh7细胞提前一天接种于96孔培养板，分别设活性板和细胞毒性板，置37℃，5％co2培养。活性测定板和细胞毒性测定板按同样加样方式，加入不同稀释浓度的样品和mers-cov假病毒悬液，设病毒对照、细胞对照和样品对照。继续培养3天后，细胞毒性板采用mtt法测定细胞存活率。活性板吸去培养液后加入100μl每孔细胞裂解液，震荡裂解5分钟后，每孔再加入100μl的luciferase反应检测液，震荡孵育5分钟后测定化学发光值。

评价方法：

细胞毒性(mtt法)：通过比较病毒对照、细胞对照和样品对照的od值，计算细胞的存活率，并进一步计算样品的细胞毒作用。

假病毒感染率：以细胞对照组读值为本底，将病毒对照和样品对照的化学发光值扣除本底后，计算相对病毒对照孔的相对感染率，进而计算样品对病毒感染细胞的保护活性。

结果如表3所示。

表3

结果：双黄连制剂(口服液)对mers-cov病毒具有抑制效应。

实施例4.双黄连制剂(口服液)对2019新型冠状病毒(2019-ncov)的抑制作用

在本实施例中，通过抗2019-ncov(新冠状病毒)活性(病毒-细胞水平模型)，测试双黄连制剂(口服液)对2019-ncov病毒的抑制作用。

测试原理：以vero-e6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品抵抗病毒感染细胞的作用，检测指标为镜检细胞变性反应(cpe)(用于观察药物对细胞的毒副作用性)以及实时荧光定量pcr方法测定培养上清中病毒基因组含量(用于观察对2019新型冠状病毒(2019-ncov)的抑制作用)。

测试方法：

vero-e6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％co2培养，分别加入不同稀释浓度的样品和2019-ncov病毒，moi＝0.01，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录cpe。病毒感染后24小时收取培养上清，提取病毒核酸，并采用实时荧光定量pcr方法测定培养上清中病毒基因组含量，计算相对病毒对照孔的病毒复制水平，计算样品对病毒复制的抑制活性。

结果图1所示。在0.3125％-10％(v/v,按培养液中双黄连制剂(口服液)的添加量计)的浓度下，双黄连制剂(口服液)对2019-ncov病毒具有显著的抑制效应。

此外，表4的结果表明，双黄连制剂(口服液)具有良好的安全性。在0.3125％～2.5％(v/v)浓度下，对细胞基本上具有毒性。

表4细胞毒性效应

细胞毒性效应：以+表示细胞病变程度，<25％+，25％～50％++，50％～75+++，>75％++++。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。