牛蒡根多糖在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用的制作方法

本发明涉及牛蒡根多糖在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用，属于医药及保健食品技术领域。

背景技术：

非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfattyliverdisease,nafld)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致，以肝细胞脂肪变性和脂质沉积为主要特征的临床病理综合征，常与肥胖、胰岛素抵抗(ir)、遗传易感性、线粒体和内质网氧化应激等相关。由于肝脏组织中脂肪变性程度和炎症情况的不同，可从单纯性脂肪肝发展成非酒精性脂肪性肝炎，并进一步发展为肝硬化甚至肝癌。

随着人们生活水平的提高，nafld的发病率也在逐年增加。目前发达国家中的发病率在20-30％，而中国成年人中的发病率约为15％，nafld已成为最常见的慢性肝病之一。nafld的病因及发病机制复杂，胰岛素抵抗(ir)、氧化应激和脂质过氧化是当前公认的关键因素，“二次打击”学说仍占主导地位。脂类在肝脏细胞的细胞质内的聚集(第一次打击)触发了一系列的细胞毒素事件(第二次打击)，导致了肝脏的炎症反应。“第一次打击”主要是指脂肪在肝脏细胞内的过度聚集，这一过程已经被证实与胰岛素抵抗(ir)有关，胰岛素抵抗(ir)会导致细胞内甘油三酯的合成与转运功能紊乱。第二次打击为氧化应激反应，是在“第一次打击”的基础上，由活性氧诱导的发生在肝脏实质细胞内的炎症反应。

目前，nafld的干预措施主要有两大类，即生活方式的改变和药物治疗。大量的临床研究已经证明，选择健康的食物，控制饮食，积极锻炼身体，可以有效改善nafld。此外，天然多糖的活性研究是近年来预防及治疗nafld的一个新的热点，牛蒡(arctiumlappal.)作为一种广泛分布于亚欧地区的菊科草本植物，现已被证实具有治疗糖尿病、降血糖、抗炎等作用，现有研究表明牛蒡子及牛蒡茶对于辅助降低血脂、降体重具有积极的作用，然而目前尚未有关于从牛蒡根中提取出重均分子量为3000-5000da的牛蒡根多糖对于治疗非酒精性脂肪肝的相关报道。

技术实现要素：

本发明针对牛蒡在代谢类疾病领域研究的不足，提供了一种牛蒡根多糖的新应用，具体涉及牛蒡根多糖在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

牛蒡根多糖在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述牛蒡根多糖的重均分子量为3000-5000da。

根据本发明优选的，所述的牛蒡根多糖的制备方法步骤如下：

(1)选择新鲜的牛蒡根，沸水浴5-10min灭酶，将牛蒡根去皮后切成薄片，以料液质量比1:10加入去离子水，设置浸提条件为60-95℃、50-90min，浸提2-3次，合并浸提液后过滤和抽滤，滤液离心收取上清液；

(2)将步骤(1)中制得的上清液在50-70℃下浓缩至原有体积的1/4-3/4，收集浓缩液；之后加入4倍体积的80-100wt％乙醇过夜醇沉，离心保留沉淀；将沉淀以1：100-500的质量比溶解于去离子水中，离心收取上清液；

(3)将步骤(2)制备得到的上清液进行脱色处理，收集脱色后的澄清液；

(4)在步骤(3)制备的澄清液中加入三氯乙酸，使三氯乙酸的浓度为3-10wt％，充分振荡，离心弃去下层变性蛋白沉淀，上清液用1mol/lnaoh溶液中和，用截留分子量3000-5000da的透析袋透析，得到保留液，浓缩，即得脱蛋白的粗多糖溶液；

(5)将步骤(4)制得到的粗多糖溶液经冻干后得到牛蒡根多糖。

进一步优选的，步骤(1)中所述的浸提条件为80℃、60min，浸提3次。

进一步优选的，步骤(1)中所述离心为7000r/min离心20-30min。

进一步优选的，步骤(2)中所述浓缩是将上清液在60℃下置于旋转蒸发仪中蒸发浓缩，浓缩至原有体积的1/2；所述醇沉是加入95wt％乙醇，醇沉后的沉淀以1：400的质量比溶解于去离子水中。

进一步优选的，步骤(2)中所述离心为7000r/min离心10-30min。

进一步优选的，步骤(3)中所述脱色处理采用的脱色柱为d301r脱色柱，流速为400-600μl/min；优选的脱色柱为d301r大孔树脂脱色柱，流速为500μl/min。

进一步优选的，步骤(4)中所述三氯乙酸的浓度为5wt％。

进一步优选的，步骤(4)中所述充分振荡的时间为10min；所述离心为3000-4000r/min离心10min。

进一步优选的，步骤(4)中所述透析袋的截留分子量为3000-4000da。

根据本发明优选的，所述牛蒡根多糖的使用剂量为100-800mg/kg/d，优选为400mg/kg/d。

一种治疗非酒精性脂肪肝的药物，其特征在于，所述药物包括有效剂量的上述重均分子量为3000-5000da的牛蒡根多糖。

根据本发明优选的，所述药物包括药学上可接受的辅料。

有益效果：

本发明提供了一种牛蒡根多糖的新应用，即重均分子量为3000-5000da的牛蒡根多糖在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。本发明通过hfd(高脂)饲料诱导建立非酒精性脂肪肝(nafld)小鼠模型，对牛蒡根多糖治疗nafld的活性进行研究，结果表明牛蒡根多糖能够产生如下的治疗效果：牛蒡根多糖能够显著降低由hfd引起的肝重及肝指数异常升高；牛蒡根多糖能够显著改善由hfd引起的肝脏形态学异常；牛蒡根多糖能够显著降低由hfd引起的肝脏胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)的积累；牛蒡根多糖能够显著降低由hfd引起的小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)的升高；牛蒡根多糖能够显著降低由hfd引起的小鼠血清中肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-6(il-6)水平的提高；因此，牛蒡根多糖能够对nafld起到积极的治疗作用。

附图说明

图1为不同小鼠肝脏组织切片h&e染色和油红o染色结果；图中，a为h&e染色结果，b为油红o染色结果，从左到右依次为空白对照组、hfd模型组、牛蒡根多糖低剂量组、牛蒡根多糖中剂量组、牛蒡根多糖高剂量组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，具体实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非限制本发明的保护范围。实施例中涉及的材料及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中涉及的百分比，若无特殊说明，均为质量百分比。

实施例1：牛蒡根多糖的制备

牛蒡根多糖的制备方法，包括步骤如下：

(1)选择新鲜的牛蒡根，沸水浴5-10min灭酶，将牛蒡根去皮后切成薄片，以料液质量比1:10加入去离子水，设置浸提条件为80℃、60min，浸提3次，合并浸提液后采用双层滤布进行过滤，之后使用布氏漏斗进行抽滤，滤液以7000r/min离心30min，收取上清液；

(2)将步骤(1)中制得的上清液在60℃下置于旋转蒸发仪中蒸发浓缩，浓缩至原有体积的1/2，收集浓缩液；之后加入4倍体积的95wt％乙醇过夜醇沉，以7000r/min离心30min，保留沉淀；将沉淀以1：400的质量比溶解于去离子水中，7000r/min离心10min，收取上清液；

(3)将步骤(2)制备得到的上清液采用d301r大孔树脂脱色柱进行脱色处理，流速为500μl/min，收集脱色后的澄清液；

(4)在步骤(3)制备的澄清液中加入三氯乙酸，使三氯乙酸的浓度为5wt％，充分振荡10min，以4000r/min离心10min，弃去下层变性蛋白沉淀，上清液用1mol/lnaoh溶液中和，用截留分子量3000-4000da的透析袋透析3天，得到保留液，浓缩，即得脱蛋白的粗多糖溶液；

(5)将步骤(4)制得到的粗多糖溶液经过冷冻干燥机冻干后得到牛蒡根多糖，所述牛蒡根多糖的重均分子量为3000-4000da。

实施例2：牛蒡根多糖对hfd(高脂)诱导非酒精性脂肪肝(nafld)小鼠肝重及肝指数的影响

实验方法：

nafld小鼠模型的建立：

雄性昆明小鼠，体重18±2g/只，共随机分为5组，每组10只；

空白对照组：饲喂正常饲料，普通饮用水，直到实验周期结束；

hfd模型组：饲喂高脂饲料，普通饮用水，直到实验周期结束；

牛蒡根多糖低剂量组：饲喂高脂饲料，普通饮用水，20周建模后，牛蒡根多糖(100mg/kg/d)灌胃8周；

牛蒡根多糖中剂量组：饲喂高脂饲料，普通饮用水，20周建模后，牛蒡根多糖(400mg/kg/d)灌胃8周；

牛蒡根多糖高剂量组：饲喂高脂饲料，普通饮用水，20周建模后，牛蒡根多糖(800mg/kg/d)灌胃8周。

结果分析：牛蒡根多糖对nafld模型小鼠的肝重及肝指数的影响如表1所示，结果表明，hfd模型组小鼠肝重及肝指数较空白对照组显著提高(^##p＜0.01)，而牛蒡根多糖低、中、高剂量组小鼠肝重及肝指数较hfd模型组显著降低(^*p＜0.05，^**p＜0.01)，其中牛蒡根多糖中剂量组的小鼠肝重及肝指数与空白对照组最为接近。由此可见长期饲喂高脂饲料会导致小鼠肝重上升，加剧肝脏脂肪积累，而使用牛蒡根多糖灌胃8周后，能够降低小鼠肝脏脂质的蓄积，表明牛蒡根多糖在治疗非酒精性脂肪肝上具有积极作用。

表1.牛蒡根多糖对nafld小鼠肝重及肝指数的影响(n＝10，x±s)

注：与空白对照组相比，^##p＜0.01；与模型组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

实施例3：牛蒡根多糖对nafld小鼠肝脏组织形态学的作用

实验方法：将实施例2中实验周期结束后的5组小鼠进行解剖，离体肝脏组织经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和染色后，在显微镜下观察肝脏组织形态学变化并作判断。每张小鼠肝脏组织染色切片选取上中下左右视野进行观察，描述肝脏组织的脂肪变性程度及炎症反应情况。

具体制片及染色过程如下：

制片：

1)固定：将切取的新鲜肝脏组织浸泡于多聚甲醛中固定24h；

2)脱水：依次用85％乙醇浸泡60min；95％乙醇浸泡30min，浸泡2次；无水乙醇浸泡10min，浸泡3次；

3)透明：二甲苯浸泡2h；

4)浸蜡：56℃，浸泡30min，浸泡2次；

5)包埋：80℃硬蜡+蜂蜡包埋，室温下保存；

6)切片：厚度4μm；

7)烤片：70℃，40min；

h&e染色：

1)脱蜡：将上述制得的切片二甲苯浸泡10min，浸泡3次；无水乙醇浸泡5min，95％乙醇浸泡5min，85％乙醇浸泡5min，75％乙醇浸泡5min，水洗3次；

2)苏木素中浸染5min，然后水洗3次；

3)乙醇+浓盐酸分化10s，然后水洗3次；

4)nahco3返蓝10s；

5)伊红溶液浸染30s，然后水洗3次；

6)脱水透明：85％乙醇浸泡1min；95％乙醇浸泡1min，浸泡2次；无水乙醇浸泡1min，浸泡2次；二甲苯浸泡1min，浸泡2次；

7)中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。

油红o染色：

1)将切取的肝脏组织冰冻切片，10μm；

2)60％异丙醇浸洗2min；

3)油红o染液染色5min；

4)60％异丙醇分色，水洗；

5)苏木素复染30s；

6)蒸馏水返蓝；

7)甘油明胶封片，光镜下观察肝脏脂滴的分布情况。

结果分析：不同小鼠肝脏组织切片h&e染色和油红o染色结果如图1所示，染色切片显示，空白对照组小鼠肝组织中肝细胞排列紧密，肝索沿中央静脉呈放射状排列，且肝细胞内无脂滴沉积，形态结构正常；与空白对照组相比，hfd模型组小鼠肝组织切片出现明显的病理改变，其肝小叶边界模糊，少数区域肝索结构紊乱，肝细胞呈圆形，肿胀，界限不清。细胞内可见不同大小的脂滴，脂肪变性细胞呈病灶状分布；对比hfd模型组，牛蒡根多糖低、中、高剂量组中小鼠肝细胞间脂肪空泡减少，细胞排列较为紧密，脂滴分布减少，由此表明，牛蒡根多糖可以显著抑制肝脏脂肪变性以及脂质堆积，从而起到缓解nafld的作用。

实施例4：牛蒡根多糖对nafld小鼠肝脏胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)水平的影响

实验方法：将实施例2中实验周期结束后的5组小鼠进行解剖，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例在离心管中加入肝组织和无水乙醇，于冰上进行机械匀浆，此后在1000r/min、4℃条件下离心10min，取上清液至新的离心管中。之后按照tc、tg试剂盒说明书进行测定。

结果分析：牛蒡根多糖对nafld小鼠肝脏tc、tg的影响如表2所示，结果表明，和空白对照组小鼠相比，hfd模型组小鼠肝脏中的tc、tg水平显著升高(^##p＜0.01)；和hfd模型组小鼠相比，牛蒡根多糖低、中、高剂量组小鼠肝脏中的tc、tg水平分别呈现不同程度的显著性降低(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)。tc、tg过高会加重肝脏代谢负担，引发肝损伤，表2表明，牛蒡根多糖能够显著降低肝脏中的tc、tg水平，从而缓解nafld，并对肝脏起到一定的保护作用。

表2.牛蒡根多糖对nafld小鼠肝脏tc、tg的影响(n＝10,x±s)

注：与空白对照组相比，^##p＜0.01；与模型组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001。

实施例5：牛蒡根多糖对nafld小鼠血清谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)的作用

实验方法：按照实施例2的实验方法建模饲喂，实验周期结束后，5组小鼠禁食禁水12h后，进行取血，于4℃静置2h后离心(3000rpm/min，15min)，吸取上清后进行第二次离心，待上清颜色清亮无杂，吸取上清至无菌离心管中，置于-80℃保存。之后按照alt、ast试剂盒说明书进行测定。

结果分析：牛蒡根多糖对nafld小鼠血清alt、ast的影响如表3所示，和空白对照组小鼠相比，hfd模型组小鼠血清中的alt、ast水平显著增高(^##p＜0.01)；和hfd模型组小鼠相比，牛蒡根多糖低、中、高剂量组小鼠血清中的alt、ast水平显著降低(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)。alt、ast是反应肝细胞损伤的重要指标，由此可以得出，牛蒡根多糖能够显著改善由nafld引起的肝损伤，从而对肝脏起到一定的保护作用。

表3.牛蒡根多糖对nafld小鼠血清alt、ast的影响(n＝10,x±s)

注：与空白对照组相比，^##p＜0.01；与模型组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001。

实施例6：牛蒡根多糖对nafld小鼠免疫炎症反应的作用

实验方法：按照实施例5的实验方法，制备5组小鼠的血清，并按照肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-6(il-6)的检测试剂盒说明书进行测定，具体方法如下：

1)除空白孔外，分别将样品加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min；

2)洗板5次，最后一次置于吸水纸上拍干；

3)加入生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min；

4)洗板5次，最后一次置于吸水纸上拍干；

5)加入酶结合物工作液，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃孵育30min；

6)洗板5次，最后一次置于吸水纸上拍干；

7)加入显色剂，避光37℃孵育20min；

8)加入终止液，混匀后立即测量od值。

结果分析：tnf-α、il-6是脂肪肝的肝细胞损伤过程中的重要炎症调节因子，测定结果如表4所示，对比空白对照组，hfd模型组小鼠血清中的tnf-α、il-6浓度显著上升(^##p＜0.01)；和hfd模型组相比，牛蒡根多糖低、中、高剂量组小鼠血清中的tnf-α、il-6浓度显著降低(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)。由此可以得出，牛蒡根多糖对nafld引起的炎症起到了缓解作用。

表4牛蒡根多糖对nafld小鼠血清中炎症因子的影响(n＝10,x±s)

注：与空白对照组相比，^##p＜0.01；与模型组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001。