一种防治鸡球虫病的药物组合物及其应用的制作方法

本发明属于畜禽用药技术领域，具体而言，涉及一种防治鸡球虫病的药物组合物及其应用，尤其涉及一种以植物乳杆菌p8及绿原酸为活性成分的抗球虫感染药物。

背景技术：

鸡球虫病是一种全球流行、无季节性、高发病率和高死亡率的肠道寄生性原虫病，每年全球造成数30亿美元的经济损失，其是由一种或几种艾美尔球虫寄生在鸡肠道上皮细胞，感染鸡多肠道黏膜上皮受损，肠道消化、吸收差，甚至致死，死亡率高达80％，严重危害养禽业发展。

目前，国内外对于鸡球虫病的防治依然是以药物为主，主要应用离子载体类抗生素(如盐霉素)和化学合成药物(如妥曲珠利、地克珠利等)。然而，长期的药物添加会造成耐药虫株的出现，同时容易造成药物在鸡肉及蛋类产品中残留，给食品安全带来了潜在的威胁。另外，我国养殖业对抗生素使用要求越来越规范和严苛，在生产上寻求可以起到抗生素药物作用的高效、安全、不易产生耐药性和药物残留的绿色饲料添加剂成为当前研究的热点。微生态制剂以及植物提取物等生物活性物质具有无毒副作用、无残留和不产生耐药性和抗药性的优点，对动物体兼有药物性及营养性的双重作用，因此成为众多学者研究的热点。

植物乳杆菌p8(lactobacillusplantarump-8，保藏号：cgmccno.6312)，是从内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗草原上牧民家族自然发酵酸牛奶中分离鉴定出的一株具有益生特性的乳酸菌。通过检索国内外现有技术，目前尚没有文献报道植物乳杆菌p8具有抗球虫感染的生物活性，也没有文献报道植物乳杆菌p8与绿原酸联合应用防治鸡球虫病。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以植物乳杆菌p8及绿原酸为活性成分的抗球虫感染药物及其应用。

本发明首次将植物乳杆菌p8与绿原酸联合使用，并结合发明人多年来的研究经验，筛选出了两种活性物质的合适配比，在此配比下，植物乳杆菌p8可改善肉鸡肠道菌群结构，从而有利于增强绿原酸抗鸡球虫病的疗效，获得了非常显著的协同防治效果。

具体地，本发明的技术方案概括如下：一种防治鸡球虫病的药物组合物，该药物组合物含有植物乳杆菌p8及绿原酸，所述的植物乳杆菌p8的生物保藏号是cgmccno.6312。

需要说明的是，本发明所采用的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8，分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够存活于动物肠道内；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2012年06月28日，保藏号为cgmccno.6312。绿原酸(chlorogenicacid)是由咖啡酸和奎尼酸组成的缩酚酸，化学名3-o-咖啡酰奎尼酸，分子式c16h18o9，分子量354.30，可以采用水提醇沉法从杜仲叶中提取获得。

进一步优选地，如上所述防治鸡球虫病的药物组合物，其中植物乳杆菌p8以活菌数计，绿原酸以质量计，植物乳杆菌p8与绿原酸的用量比为(5000-100000)cfu：1mg。

再进一步优选地，如上所述防治鸡球虫病的药物组合物，其中植物乳杆菌p8以活菌数计，绿原酸以质量计，植物乳杆菌p8与绿原酸的用量比为(5000-20000)cfu：1mg。

在本发明最优选的一个实施例中，如上所述防治鸡球虫病的药物组合物，其中植物乳杆菌p8以活菌数计，绿原酸以质量计，植物乳杆菌p8与绿原酸的用量比为10000cfu：1mg。

另外，由于饲喂植物乳杆菌p8与绿原酸可缓解球虫感染对肉鸡造成的免疫失衡，以及缓解肠道屏障损伤，修复肠道结构，可以显著提高抗炎因子含量并降低促炎因子的含量，使机体免疫趋于正常，因此本发明还提供了如下新用途的技术方案：

1)植物乳杆菌p8在制备防治鸡球虫病的药物或饲料添加剂中的应用，所述的植物乳杆菌p8的生物保藏号是cgmccno.6312。

2)植物乳杆菌p8与绿原酸在制备防治鸡球虫病的药物或饲料添加剂中的应用，所述的植物乳杆菌p8的生物保藏号是cgmccno.6312，其中植物乳杆菌p8以活菌数计算，绿原酸以质量计，植物乳杆菌p8与绿原酸的用量比为(5000-100000)cfu：1mg。

3)植物乳杆菌p8与绿原酸在制备修复球虫感染后肠道屏障损伤的药物中的应用，所述的植物乳杆菌p8的生物保藏号是cgmccno.6312，其中植物乳杆菌p8以活菌数计，绿原酸以质量计，植物乳杆菌p8与绿原酸的用量比为(5000-100000)cfu：1mg。

与现有技术相比，本发明提供的防治鸡球虫病的药物组合物，具有如下优点和进步性：

(1)植物乳杆菌p8与绿原酸联用可显著提高球虫感染后肉鸡的平均日增重和降低料重比，并降低了球虫感染肉鸡的死亡率。

(2)植物乳杆菌p8和绿原酸联合应用可显著降低肉鸡粪便中球虫卵囊数量，有效减少鸡血便量。

(3)植物乳杆菌p8与绿原酸联用可显著提高球虫感染后肉鸡血清和空肠肠粘膜中的抗氧化指标，缓解球虫感染对肉鸡造成的氧化应激。

(4)植物乳杆菌p8与绿原酸联用可缓解球虫感染对肉鸡造成的免疫失衡与肠道损伤，可以显著提高抗炎因子含量并降低促炎因子的含量，使机体免疫趋于正常。

(5)植物乳杆菌p8与绿原酸联用可以缓解肠道屏障损伤，修复肠道结构，增强肠黏膜的抵抗力，有利于肠道健康，搭配使用具有协同作用，效果最好。

(6)可全部替代或部分替代化学合成类抗球虫药物及抗生素产品，无药残，无公害，绿色、安全、环保。

附图说明

图1正常对照组肉鸡空肠肠道病理切片图；

图2球虫感染组肉鸡空肠肠道病理切片图；

图3p8组肉鸡空肠肠道病理切片图；

图4绿原酸组肉鸡空肠肠道病理切片图；

图5p8+绿原酸组肉鸡空肠肠道病理切片图；

图6地克珠利组肉鸡空肠肠道病理切片图。

具体实施方式

下面通过试验例进一步说明本发明。应该理解的是，以下试验例仅仅是用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不是对本发明保护范围的限制，在总体构思前提下对该方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

1试验材料

植物乳杆菌p8(lactobacillusplantarump-8，保藏号：cgmccno.6312)，本实验所用菌粉浓度为2×10¹¹cfu/g，购自北京科拓恒通生物技术有限公司。

绿原酸(chlorogenicacid，98％，通过高效液相色谱法测定)，采用水提醇沉法从杜仲叶中提取，购自长沙一科生物技术有限公司。

抗球虫药物：地克珠利预混剂，购自河南惠康动物药业有限公司。

2试验方法

将500只肉鸡随机分为5个处理组，每个处理组10个重复，每个重复10只鸡，饲养42天。基础日粮见表1。

表1：基础日粮的组成和营养水平(干重)

注：1)一千克预混料包含以下成分：铁(硫酸亚铁)90g；铜(硫酸铜)6g；锌(硫酸锌)50g；锰(硫酸锰)100g；硒(亚硒酸钠)0.25g；i(碘化钾)0.6g。2)一千克的多维包含以下成分：va35000000iu；vd310000000iu；ve75000iu；vk310g；vb110g；vb225g；vb615g；vb120.1g；烟酸100g；d-泛酸50g；叶酸5g；生物素0.4g；抗氧化剂0.2g。3)营养水平的计算值。

分组为：(1)正常对照组饲喂基础日粮；(2)艾美尔球虫感染组攻毒球虫，饲喂基础日粮；(3)植物乳杆菌p8组(p8组)感染球虫并饲喂含有10⁷cfu/g的植物乳杆菌p8的日粮；(4)绿原酸组(绿原酸组)感染球虫并饲喂含有1g/kg绿原酸的日粮；(5)植物乳杆菌+绿原酸组(p8+绿原酸组)感染球虫并饲喂含有10⁷cfu/g的植物乳杆菌p8和1g/kg绿原酸的日粮；(6)地克珠利组(抗球虫药物组)感染球虫并饲喂抗球虫药物地克珠利预混剂200mg/kg。试验分组及处理见下表2。

表2：试验分组及处理

饲养至第14天，除正常对照组以外的所有处理通过灌胃法，接种4×10⁵个孢子化艾美尔球虫卵囊。在第42天，于每组每个重复中随机取1只鸡，通过心脏穿刺采集血液样品，后剖杀，从空肠刮下粘膜投入液氮备用。另取5cm空肠肠段，剪下投入4％的甲醛溶液中。

3测定指标

3.1生产性能与病死率

试验期每周以重复为单位称鸡只空腹重，试验过程中每天记录每个重复的供料量和剩料量，记录每只鸡的平均日增重和平均日采食量以计算料重比，并记录死亡情况。

3.2粪便卵囊排出情况

攻毒后第7d时，收集每个重复(笼)中的粪便，计算每只鸡粪便卵囊数。方法：将收集的粪便样品搅匀后，称取2g，加适量饱和食盐水搅匀，用60目网筛充分过滤。将滤液稀释定容至60ml，然后用麦氏计数板计数，最后求其平均值。如果卵囊的数量太多，则按照梯度稀释，然后计数，再乘以稀释倍数。

3.3抗氧化指标

血液和空肠黏膜中的丙二醛(mda)，超氧化物歧化酶(sod)，过氧化氢酶(cat)，谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)，总抗氧化能力(t-aoc)使用试剂盒测定，试剂盒购自苏州格锐思生物科技有限公司，测定方法按照试剂盒说明书进行。血液中抗氧化酶的含量表示单位为u/ml(每ml血液中含有的国际单位)，粘膜组织中抗氧化酶的含量表示单位为u/mgprotein(每mg组织总蛋白中含有的国际单位)。血液中mda的含量表示单位为nmol/ml(每ml血液中含有的nmol)，粘膜组织中mda的含量表示单位为nmol/mgprotein(每mg组织总蛋白中含有的nmol)。

3.4免疫指标

血清和空肠黏膜中的白细胞介素6(il-6)、白细胞介素10(il-10)，肿瘤坏死因子(tnf-α)、血清中的免疫球蛋白a(iga)和空肠中的分泌型免疫球蛋白a(siga)使用酶联免疫吸附测定方法，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，测定方法按照试剂盒说明书进行。血液中免疫指标的含量表示单位为pg/ml或μg/ml(每ml血液中含有的pg或μg)，粘膜组织中免疫指标的含量表示单位为pg/mgprotein或ng/mgprotein(每mg组织总蛋白中含有的pg或ng)。

3.5肠道形态及通透性指标

血清中反映肠道通透性指标d-乳酸和二胺氧化酶含量采用酶联免疫吸附测定方法，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，测定方法按照试剂盒说明书进行。

观察石蜡切片测定肠绒毛高度及隐窝深度：将组织块从4％甲醛溶液中取出，清洗、脱水、石蜡包埋、切片，用he染色后在体式镜下观察绒毛形态，每张组织切片选较完整的10根绒毛测定绒毛高度及隐窝深度。

4实验结果

4.1生产性能与病死率

表3：各组肉鸡的生产性能与病死率比较

由表3的试验统计结果可以看出，攻毒前(0-14d)：平均日增重、平均日采食量和料重比在各组之间均无显著差异(p>0.05)。攻毒后(14-42d)：球虫感染显著降低了肉鸡的平均日增重(p<0.05)。与球虫感染组相比植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组、地克珠利组均可以显著提高肉鸡的平均日增重，其中植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组与正常对照组相比已无显著差异(p>0.05)。球虫感染显著提高了肉鸡的料重比(p<0.05)。与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组均可降低球虫感染肉鸡的料重比(p<0.05)，且均与正常对照组相比无显著差异(p>0.05)。各组平均日采食量之间均无显著差异(p>0.05)。

试验全期(0-42d)：球虫感染可显著降低肉鸡平均日增重(p<0.05)。与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组、地克珠利组均可显著提高球虫感染肉鸡的平均日增重(p<0.05)，其中植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组与正常对照组相比无显著差异(p>0.05)。球虫感染显著提高了肉鸡的料重比(p<0.05)。与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组均可降低球虫感染肉鸡的料重比(p<0.05)。各组平均日采食量之间均无显著差异(p>0.05)。

球虫感染显著提高了肉鸡的死亡率(p<0.05)。与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组、地克珠利组死亡率显著降低(p<0.05)，且均与正常对照组无显著差异(p>0.05)。

4.2粪便中球虫卵囊数

表4：各组肉鸡粪便中球虫卵囊数比较

由表4的试验统计结果可以看出，在接种球虫后第7天，与正常组相比，球虫感染组肉鸡粪便中球虫卵囊数明显增加(p<0.01)。绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组、地克珠利组与球虫感染组相比，粪便中球虫卵囊数明显降低(p<0.01)。其中植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组、地克珠利组与正常对照组相比已无显著性差异(p>0.05)。

4.3抗氧化指标

表5：各组肉鸡血清中的抗氧化指标比较

由表5的试验统计结果可以看出，球虫感染可显著降低肉鸡血清总抗氧化能力(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组可显著提高球虫感染肉鸡血清总抗氧化能力(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著降低肉鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶的活性(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组、地克珠利组均可显著提高球虫感染肉鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶的活性(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著提高肉鸡血清丙二醛的含量(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组、地克珠利组均可降低球虫感染肉鸡血清丙二醛的含量(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)。各组之间过氧化氢酶与超氧化物歧化酶活性均无显著差异(p>0.05)。

表6：各组肉鸡的空肠肠粘膜中的抗氧化指标比较

由表6的试验统计结果可以看出，球虫感染可显著降低肉鸡空肠肠粘膜的总抗氧化能力(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组和地克珠利组可显著提高球虫感染肉鸡空肠肠粘膜总抗氧化能力(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著降低肉鸡空肠肠粘膜超氧化物歧化酶的活性(p<0.05)，与球虫感染组相比，地克珠利组可显著提高球虫感染肉鸡空肠肠粘膜超氧化物歧化酶的活性(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著提高肉鸡空肠肠粘膜丙二醛的含量(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组和地克珠利组均可降低球虫感染肉鸡空肠肠粘膜丙二醛的含量(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)。各组之间过氧化氢酶与谷胱甘肽过氧化物酶活性均无显著差异(p>0.05)。

4.4免疫指标

表7：各组肉鸡血清中炎症因子及免疫球蛋白含量比较

由表7的试验统计结果可以看出，球虫感染可显著提高肉鸡血清中的白细胞介素6的含量(p<0.05)，与球虫感染组相比，地克珠利组可显著降低球虫感染肉鸡血清中的白介素6的含量(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著降低肉鸡血清中的白细胞介素10的含量(p<0.05)，与球虫感染组相比，地克珠利组肉鸡血清中白细胞介素10的含量与正常对照组无显著差异(p>0.05)；与正常对照组相比，植物乳杆菌p8组与绿原酸组的球虫感染肉鸡血清中肿瘤坏死因子显著提高(p<0.05)；与正常对照组相比，植物乳杆菌p8组与绿原酸共同饲喂组与地克珠利组的球虫感染肉鸡血清中免疫球蛋白a的含量显著提高(p<0.05)。

表8：各组肉鸡空肠肠粘膜中的炎症因子及免疫球蛋白含量比较

由表8的试验统计结果可以看出，球虫感染可显著提高肉鸡空肠肠粘膜中白细胞介素6的含量(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8与绿原酸共同饲喂组与地克珠利组可显著降低球虫感染肉鸡空肠肠粘膜中白细胞介素6的含量(p<0.05)，且与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著提高肉鸡空肠肠粘膜中肿瘤坏死因子的含量(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组、绿原酸组、植物乳杆菌p8与绿原酸共同饲喂组与地克珠利组均可显著降低空肠肠粘膜中肿瘤坏死因子的含量(p<0.05)，其中植物乳杆菌p8与绿原酸共同饲喂组与地克珠利组与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著提高肉鸡空肠肠粘膜中分泌型免疫球蛋白a的含量(p<0.05)，而植物乳杆菌p8组和绿原酸组与正常对照组无显著差异(p>0.05)。各组之间白细胞介素10的含量均无显著差异(p>0.05)。

4.5肠道通透性指标

表9各组肉鸡血清中的d-乳酸和二胺氧化酶含量比较

由表9的试验统计结果可以看出，球虫感染可显著提高肉鸡血清中d-乳酸的含量(p<0.05)，与球虫感染组相比植物乳杆菌p8组、植物乳杆菌p8组与绿原酸共同饲喂组和地克珠利组均可显著降低球虫感染肉鸡血清中d-乳酸的含量(p<0.05)，且均与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染可显著提高肉鸡血清中二胺氧化酶的含量(p<0.05)，与与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组与绿原酸共同饲喂组和地克珠利组均可显著降低球虫感染肉鸡血清中二胺氧化酶的含量(p<0.05)，且均与正常对照组无显著差异(p>0.05)。

4.6肠道形态指标

表10：各组肉鸡肠道形态指标比较

由表10的试验统计结果可以看出，球虫感染显著降低了肠绒毛高度(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组与绿原酸共同饲喂组和地克珠利组可显著提高肠绒毛高度(p<0.05)，且均与正常对照组无显著差异(p>0.05)；球虫感染显著降低了绒隐比(p<0.05)，与球虫感染组相比，植物乳杆菌p8组与绿原酸共同饲喂组和地克珠利组可显著提高绒隐比(p<0.05)，且均与正常对照组无显著差异(p>0.05)。各组之间隐窝深度均无显著差异(p>0.05)。

空肠肠道的病理切片如图1-图6所示。由图2可见，球虫感染后肠绒毛形态大量出现绒毛断裂、脱落，局部绒毛缺损，肠道损伤比较严重；而饲喂了植物乳杆菌p8组和绿原酸组，肠道绒毛虽仍出现断裂、脱落等损伤(图3、图4)，但相比球虫感染组，肠道损伤得以修复；而植物乳杆菌p8和绿原酸共同饲喂组和地克珠利组的肠道修复更为明显，肠绒毛断裂脱落等损伤出现更少(图5、图6)，接近正常对照组(图1)。

5结论

(1)植物乳杆菌p8与绿原酸均可提高球虫感染后肉鸡的平均日增重和降低料重比，两者共同饲喂后效果更加明显，与正常对照组无显著差异；植物乳杆菌p8与绿原酸均可降低球虫感染肉鸡的死亡率。

(2)植物乳杆菌p8和绿原酸联合应用与抗球虫药物均可以显著降低肉鸡粪便中球虫卵囊数量，与正常对照组相比无显著差异。

(3)植物乳杆菌p8与绿原酸均可提高球虫感染后肉鸡血清和空肠肠粘膜中的抗氧化指标，缓解球虫感染对肉鸡造成的氧化应激，共同饲喂效果更明显。

(4)饲喂植物乳杆菌p8与绿原酸可缓解球虫感染对肉鸡造成的免疫失衡与肠道损伤，可以显著提高抗炎因子含量并降低促炎因子的含量，使机体免疫趋于正常，搭配使用效果最好。

(5)饲喂植物乳杆菌p8与绿原酸可以缓解肠道屏障损伤，修复肠道结构，有利于肠道健康，搭配使用具有协同作用，效果最好。

综合以上试验结果来看，植物乳杆菌p8与绿原酸联合应用效果最好，具有替代抗球虫药物的作用。