用于构建肌骨组织的自体生长因子补片的制作方法及应用与流程

本发明属于临床医学技术领域，具体为一种应用于用于修复大面积皮质骨缺损、修复肩胛骨韧带损伤以及修复交叉韧带的治疗药物的研究，特别是针对的用于构建肌骨组织的自体生长因子补片的制作方法及应用。

背景技术：

目前现有市场产品仍然采用开放式提取的方法，容易受到污染。目前大部分prp提取产品在离心后仍然使用人工抽取prp的方式，导致操作复杂、粗糙，质量控制不高，操作人员需要大量重复操作才能够对其进行精确提取；且目前市面的prp提取装置只是对prp进行笼统的提取，其中生长因子和白细胞含量不尽相同，也没有针对特定组织进行优化处理，治疗效果不一。

而且现阶段，prp是通过分离自体全血进行提取，由于日常生活习惯，饮食习惯和健康情况不同，血液的个体差异情况比较大。而且大部分人的血液中含有一定的有害毒素如：内源性毒素（肌酐、pth、胆红质、氨、内毒素）和一些外源性毒素如：安眠药、三环类抗抑郁药和茶碱等，对血液进行浓缩提取有可能也同时将以上的毒素也一同浓缩提取出来。

而针对于现在的状况，比如：combinationofbiomaterialbasedscaffoldingandlocalboneactivemolecule——delivery，还有biomaterials188(2019)38–49，以及theamericanjournalofsportsmedicine中的“theeffectivenessofplatelet-richplasmainthetreatmentoftendinopathy:ameta-analysisofrandomizedcontrolledclinicaltrials”，以及orthopaedicjournalofsportsmedicine2017;5:2325967116675272的“variationsinplateletandbloodcomponentsbetween4commoncommercialkits”，以及：theamericanjournalofsportsmedicine2018;46:933-9的“theeffectivenessofplatelet-richplasmainjectionsinglutealtendinopathy:arandomized,double-blindcontrolledtrialcomparingasingleplatelet-richplasmainjectionwithasinglecorticosteroidinjection.”，以及theamericanjournalofsportsmedicine2017;45:2965-74中“acklandt.amidtermevaluationofpostoperativeplatelet-richplasmainjectionsonarthroscopicsupraspinatusrepair:arandomizedcontrolledtrial”，均作出此类针对性的研究。

技术实现要素：

本发明公开的用于构建肌骨组织的自体生长因子补片的制作方法及应用，通过以胶原蛋白为支架将血小板通过膜上的β3整合蛋白受体与支架中的rgd的短肽共价键结合，构建以胶原蛋白为载体的自体生长因子补片，所用胶原蛋白支架来源于猪网膜组织，制造过程中去除猪的dna和细胞成分，得到生物相容性高、高度纯化的具有64纳米交织纤维结构的i型胶原支架，保持了天然胶原蛋白结构的机械强度而不影响其纯度和生物相容性，为细胞浸润和组织整合保留多孔结使得构参与细胞和基质相互作用的能力没有降低。以此胶原蛋白支架为基体的该补片具有骨膜生物强度，它与外源性的生长因子相比，不容易产生抗体；所构建的补片激活prp中血小板极化并释放生长因子，该补片生长因子覆盖的浓度为5x104/cm2从而修复受损伤或缺失的组织；采用的可调控prp提取装置，提取装备底部加装了可调节液面设计，可以精确定位prp所在的层区，通过中间的隔离设备将底部的红细胞层完全隔离，同时根据生长因子的结构不同，分子量不同，设计了生长因子筛选装置，其中包含两个腔体，细腔体中含有氯化钙，能将提取后的prp第一时间活化。在第二个腔体中含有分子筛，在提取prp的过程中，目标生长因子将会通过分子筛被筛除出来，而非目标生长因子会留在前一个腔体中，针对不同生长因子的分子结构和分子量的原理，使用纳米分子筛其进行精密的筛选，提取针对目标组织再生最有效的富血小板生长因子群（prgfs），对病人进行精准治疗，以期取得最佳治疗效果，同时，通过活性纤维将血液中的有害毒素先进行吸附和过滤，从而减少prp中的有毒物质，从而进一步提高提取的prp质量，对现有的prp提取技术进行革命性的改良，通过自有的提取技术对外周血进行一次性全封密离心，从而提取出含有高浓度生长因子的prp，具有极高的推广应用价值和市场价值。

为实现上述目的，本发明是通过如下方式方法达到的：

用于构建肌骨组织的自体生长因子补片的制作方法及应用，包括可调控prp提取装置，所述可调控prp提取装置包括上部仓（1），所述上部仓（1）的顶部设置有注入口（2），所述注入口（2）内部安装有橡胶塞（3），所述注入口（2）的一侧还设置有排气口（4），所述排气口（4）的内部安装有旋塞（5），所述上部仓（1）的下方设置有隔断装置（19），所述隔断装置（19）的下方连接有下部仓（6），所述下部仓（6）的外壁设置有螺纹一（7），所述下部仓（6）的外侧套接有旋转调节装置（8），所述旋转调节装置（8）包括外部的旋转部（9），旋转部（9）的内部安装有与下部仓（6）过盈配合的旋转活塞（10），所述旋转部（9）内壁还设置有螺纹二（11），且螺纹二（11）与螺纹一（7）对应，所述可调控prp提取装置还包括负压针管（12），所述负压针管（12）的一端设置有氯化钙仓（13），所述氯化钙仓（13）的一端设置有与隔断装置（19）连接的连接螺纹，氯化钙仓（13）的另一端设置有负压仓（14），所述负压仓（14）的靠近氯化钙仓（13）的一端安装有分子筛（15），所述负压仓（14）的内部还滑动设置有负压活塞（16），所述负压活塞（16）的另一端安装有手柄；

本发明还包括以下制备方法，包括如下步骤：

步骤一：制备胶原蛋白支架，得到载体备用；

步骤二：取血，得到自体全血；

步骤三：将步骤二的自体全血通过活性纤维过滤器过滤，将血液中的毒素过滤排除，得到改良全血；

步骤四：将步骤三得到的改良全血加入可调控prp提取装置，并打开隔断装置（19）；

步骤五：将步骤四的可调控prp提取装置放入离心装置，进行离心处理，得到分离液；

步骤六：将步骤五得到的可调控prp提取装置取出，并通过可调控prp提取装置的旋转调节装置（8）调节红细胞液面，调节到合适位置，将可调控prp提取装置的隔断装置（19）调节为隔断状态，将红细胞液面与plamsa分离，plamsa进入可调控prp提取装置的上部仓（1）；

步骤七：将步骤六得到的plamsa液通过负压针管（12）吸入负压针管（12）的氯化钙仓（13）中，与其中的氯化钙混合，进行活化，并再通过分子筛（15），得到所需目标生长因子得到prgfs；

步骤八：将步骤七中活化后的prgfs与步骤一得到的载体结合，使prgfs与β3整合蛋白/rgd共价结合，制备得到自体生长因子补片。

作为一种优选的技术方案，所述上部仓（1）的下部设置为锥形结构，所述下部仓（6）的上部设置为锥形结构。

作为一种优选的技术方案，所述隔断装置（19）的一侧还设置有提取口（1901），所述隔断装置（19）的内部设置有上部锥形结构通道（1902）、下部锥形结构通道（1903）、中部圆柱形结构通道（1904），所述中部圆柱型结构通道（1904）内部还设置有球形阀座（1905），所述球形阀座（1905）内部设置有球体（1909），所述球体（1909）连接有阀杆，所述球形阀座（1905）开设有通道一（1906）、通道二（1907）、通道三（1908），且球体（1909）内设置有对应的通道四（1910）、通道五（1911）、通道六（1912），所述通道一（1906）、通道四（1910）联通上部仓（1），所述通道二（1907）、通道五（1911）联通下部仓（6），通道三（1908）、通道六（1912）联通提取口（1901）。

作为一种优选的技术方案，所述通道一（1906）为槽型结构，所述通道二（1907）为圆孔型结构，所述提取口（1901）外侧安装有阻断旋塞（5）。

作为一种优选的技术方案，所述通道四（1910）、通道五（1911）、通道六（1912）之间还设置有联通腔。

作为一种优选的技术方案，所述通道四（1910）、通道五（1911）为平行结构，通道四（1910）与通道六（1912）为垂直结构。

作为一种优选的技术方案，所述分子筛（15）的靠近负压活塞（16）一端设置有阻止装置一（17），所述负压仓（14）的靠近顶端位置设置有阻止装置二（18）。

作为一种优选的技术方案，所述胶原蛋白支架为猪网膜组织，所述胶原蛋白支架的制备方法为：制造过程中去除猪的dna和细胞成分，并将其制备成为64纳米交织纤维结构的i型胶原支架。

作为一种优选的技术方案，步骤八中提取的prgfs在胶原蛋白支架上的覆盖的浓度为1x10⁴/cm²~10x10⁴/cm²。

更进一步来讲，步骤八中提取的prgfs在胶原蛋白支架上的覆盖的浓度为4x10⁴/cm²~6x10⁴/cm²。

本发明具有如下有益效果：

（1）本发明通过以胶原蛋白为支架将血小板通过膜上的β3整合蛋白受体与支架中的rgd的短肽共价键结合，构建以胶原蛋白为载体的自体生长因子补片；该补片具有骨膜生物强度，它与外源性的生长因子相比，不容易产生抗体；

（2）本发明所构建的补片激活prp中血小板极化并释放生长因子，该补片生长因子覆盖的浓度为5x104/cm2，从而修复受损伤或缺失的组织；

（3）本发明通过活性纤维吸附血液中的毒素，防止毒素与prp一同被浓缩，从而提高prp的治疗效果；

（4）本发明将对现有的prp提取技术进行革命性的改良，通过自有的提取技术对外周血进行一次性全封密离心，从而提取出含有高浓度生长因子的prp；

（5）本发明通过对血小板的激活后，针对不同生长因子的分子结构和分子量的原理，使用纳米分子筛其进行精密的筛选，提取针对目标组织再生最有效的富血小板生长因子群（prgfs），对病人进行精准治疗，取得最佳治疗效果；

（6）目前现有市场产品仍然采用开放式提取的方法，容易受到污染。目前大部分prp提取产品在离心后仍然使用人工抽取prp的方式，导致操作复杂、粗糙，质量控制不高，操作人员需要大量重复操作才能够对其进行精确提取；而本产品是第一个可调控prp提取装置，真空采血，封闭式离心，一次性提取prp，避免交叉污染安全性高；设备特殊的隔断式设计可以直接隔断prp层，从而具备“傻瓜式”操作，质量控制程度高和可重复性强的优势。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明中可调控prp提取装置的结构示意图；

图2为本发明中可调控prp提取装置的负压针管的结构示意图；

图3为本发明的可调控prp提取装置的主视结构示意图；

图4为本发明的隔断装置中球形阀座与球体的结构示意图，可见：通道一、通道二、通道三、通道四、通道五、通道六之间的位置关系；

图5为本发明的隔断装置中上部锥形结构通道、下部锥形结构通道、中部圆柱形结构通道的结构示意图；

图6为本发明的补片中prp与胶原蛋白支架的连接关系示意图；

图7为制备的胶原蛋白支架的放大图；

图8为本发明的补片的制备流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1~8所示，本发明公开的一种用于构建肌骨组织的自体生长因子补片的制作方法及应用，包括可调控prp提取装置，所述可调控prp提取装置包括上部仓（1），所述上部仓（1）的顶部设置有注入口（2），所述注入口（2）内部安装有橡胶塞（3），所述注入口（2）的一侧还设置有排气口（4），所述排气口（4）的内部安装有旋塞（5），所述上部仓（1）的下方设置有隔断装置（19），所述隔断装置（19）的下方连接有下部仓（6），所述下部仓（6）的外壁设置有螺纹一（7），所述下部仓（6）的外侧套接有旋转调节装置（8），所述旋转调节装置（8）包括外部的旋转部（9），旋转部（9）的内部安装有与下部仓（6）过盈配合的旋转活塞（10），所述旋转部（9）内壁还设置有螺纹二（11），且螺纹二（11）与螺纹一（7）对应，所述可调控prp提取装置还包括负压针管（12），所述负压针管（12）的一端设置有氯化钙仓（13），所述氯化钙仓（13）的一端设置有与隔断装置（19）连接的连接螺纹，氯化钙仓（13）的另一端设置有负压仓（14），所述负压仓（14）的靠近氯化钙仓（13）的一端安装有分子筛（15），所述负压仓（14）的内部还滑动设置有负压活塞（16），所述负压活塞（16）的另一端安装有手柄；

本发明还包括以下制备方法，包括如下步骤：

步骤一：制备胶原蛋白支架，得到载体备用；

步骤二：取血，得到自体全血；

步骤三：将步骤二的自体全血通过活性纤维过滤器过滤，将血液中的毒素过滤排除，得到改良全血；

步骤四：将步骤三得到的改良全血加入可调控prp提取装置，并打开隔断装置（19）；

步骤五：将步骤四的可调控prp提取装置放入离心装置，进行离心处理，得到分离液；

步骤六：将步骤五得到的可调控prp提取装置取出，并通过可调控prp提取装置的旋转调节装置（8）调节红细胞液面，调节到合适位置，将可调控prp提取装置的隔断装置（19）调节为隔断状态，将红细胞液面与plamsa分离，plamsa进入可调控prp提取装置的上部仓（1）；

步骤七：将步骤六得到的plamsa液通过负压针管（12）吸入负压针管（12）的氯化钙仓（13）中，与其中的氯化钙混合，进行活化，并再通过分子筛（15），得到所需目标生长因子得到prgfs；

步骤八：将步骤七中活化后的prgfs与步骤一得到的载体结合，使prgfs与β3整合蛋白/rgd共价结合，制备得到自体生长因子补片。

作为一种优选的技术方案，所述上部仓（1）的下部设置为锥形结构，所述下部仓（6）的上部设置为锥形结构。

作为一种优选的技术方案，所述隔断装置（19）的一侧还设置有提取口（1901），所述隔断装置（19）的内部设置有上部锥形结构通道（1902）、下部锥形结构通道（1903）、中部圆柱形结构通道（1904），所述中部圆柱型结构通道（1904）内部还设置有球形阀座（1905），所述球形阀座（1905）内部设置有球体（1909），所述球体（1909）连接有阀杆，所述球形阀座（1905）开设有通道一（1906）、通道二（1907）、通道三（1908），且球体（1909）内设置有对应的通道四（1910）、通道五（1911）、通道六（1912），所述通道一（1906）、通道四（1910）联通上部仓（1），所述通道二（1907）、通道五（1911）联通下部仓（6），通道三（1908）、通道六（1912）联通提取口（1901）。

作为一种优选的技术方案，所述通道一（1906）为槽型结构，所述通道二（1907）为圆孔型结构，所述提取口（1901）外侧安装有阻断旋塞（5）。

作为一种优选的技术方案，所述通道四（1910）、通道五（1911）、通道六（1912）之间还设置有联通腔。

作为一种优选的技术方案，所述通道四（1910）、通道五（1911）为平行结构，通道四（1910）与通道六（1912）为垂直结构。

作为一种优选的技术方案，所述分子筛（15）的靠近负压活塞（16）一端设置有阻止装置一（17），所述负压仓（14）的靠近顶端位置设置有阻止装置二（18）。

作为一种优选的技术方案，所述胶原蛋白支架为猪网膜组织，所述胶原蛋白支架的制备方法为：制造过程中去除猪的dna和细胞成分，并将其制备成为64纳米交织纤维结构的i型胶原支架。

针对于prgfs在胶原蛋白支架上的覆盖的浓度的选择，如下表所示：

由此可知，步骤八中提取的prgfs在胶原蛋白支架上的覆盖的浓度为4x10⁴/cm²~6x10⁴/cm²时，效果最佳，基于性价比的考虑，最实用的方案为5x10⁴/cm²。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。