松茸提取物的应用的制作方法

本发明涉及药品和化妆品技术领域，具体涉及松茸提取物的应用。

背景技术：

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)广泛存在于动物中,分布于人体所有细胞的胞浆中，其中包括皮肤细胞。g6pd是磷酸戊糖途径的关键酶，催化6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时将nadp+还原为nadph，供生物合成及维持细胞内的还原状态。研究表明，g6pd在氧化应激过程中，发挥着重要作用。它会被激活并催化生成nadph，主要用于许多生物化学反应,如还原性生物合成，谷胱甘肽还原，解毒和氧化酶介导的超氧化物产生等,进而维持细胞内氧化还原状态的平衡。因此6-磷酸葡萄糖脱氢酶获悉的高低可以从一定程度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。

g6pd缺乏时，若身体接触到具氧化性的特定物质或服用了这类药物，红血球就容易被破坏而发生急性溶血反应。蚕豆病是g6pd缺乏症的一个类型，表现为进食蚕豆后引起溶血性贫血。溶血具体机制不明，同一地区g6pd缺乏者仅少数人发病，而且也不是每年进食蚕豆都发病。到目前为止，具有提高g6pd表达效果的增强剂很少在文献中报导。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的一个目的在于提供松茸提取物在制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)增强剂中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供松茸提取物在制备抗氧化剂中的应用；

松茸(tricholomamatsutake[s.itoetimai]sing)，学名松口蘑，是食用菌的一种，含有多种生理活性物质，如蛋白质、粗脂肪、粗纤维、维生素b1维生素b2、维生素c、尼克酸、多种氨基酸、多糖、不饱和脂肪酸、核酸衍生物、肽类物质和微量元素等元素。它不仅具有很高的营养价值,还具有药用价值，能抗细菌、抗真菌、防癌、抗过敏、抗氧化和增强免疫能力以及防止过早衰老。目前国内外关于上述松茸对于人体内源性抗氧化系统如6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pd)方面影响的研究还未见报导。

在小鼠试验中，松茸提取物组相比正常对照组、uvb诱导皮肤损伤模型组、维生素c组能够显著促进g6pd在皮肤组织中的表达，含量有明显提高，可以应用于由于g6pd缺乏而引起的疾病、组织的老化和组织的功能降低；鉴于松茸提取物能够显著增强g6pd表达的作用，本发明进一步验证了其对ros清除作用，松茸提取物组相比正常对照组、uvb诱导皮肤损伤模型组、维生素c组能够显著降低ros的含量，具有很明显的抗氧化作用，可应用于修复光损伤/光老化后皮肤的损伤中。

基于上述技术效果，本发明提出了松茸提取物在制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)增强剂中的应用；以及松茸提取物在制备抗氧化剂中的应用，所述抗氧化剂在本发明实施方式中为抗ros氧化剂。

同时，根据上述应用，本发明还提供了一种g6pd增强剂或抗氧化剂，包含松茸提取物，所述松茸提取物的含量至少为0.1％w/w，更优选为至少为0.42％w/w，进一步优选为0.42％w/w-20％w/w；在本发明具体实施方式中，所述松茸提取物的含量为0.42％w/w或4.2％w/w。

本发明所述g6pd增强剂或抗氧化剂剂型优选为膏体制剂或液体剂型，除作为活性成分的松茸提取物外，还可以包含其它适宜的活性成分和/或载体辅料，所述载体辅料为药学上、美容产品上或化妆品上可接受的载体辅料，包括但不限于稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂，可选择任意一种或多种。在本发明具体实施方式中，所述载体辅料为甘油和水；或者为硬脂酸、氢氧化钾、甘油和去离子水。所述其他适宜的活性成分为其他与松茸提取物不发生拮抗反应的的天然产物和化学药品。

作为优选，所述松茸提取物按照如下方法制备获得：

将松茸粉碎后用乙醇水溶液通过浸泡加热法提取，常规过滤后收集一次滤液；冷却后第一次滤膜过滤得到二次滤液；二次滤液第二次滤膜过滤得到三次滤液；将三次滤液浓缩、干燥得到松茸提取物。其中，第二次滤膜过滤的滤膜孔径小于第一次滤膜过滤的滤膜孔径。

其中，所述粉碎为粉碎机对松茸进行粉碎，优选的细度要求在10目或以下。

所述松茸粉碎后优选按1:5～1:20的重量比加入70％乙醇水溶液提取，即每1g粉碎的松茸加入5g～20g的70％乙醇水溶液。

在一些实施方案中，所述松茸粉碎后按1:10的重量比加入70％乙醇水溶液提取。

所述乙醇水溶液中的水优选为蒸馏水。所述提取时间优选为至少为30min，更有选为120-360min，在本发明具体实施方式中为240min。

本发明所述松茸提取物的制备方法中在经乙醇提取过滤后获得一次滤液即松茸提取液，然后先后进行两次滤膜过滤。作为优选，先通过1～5μm滤膜过滤得到二次滤液；二次滤液通过0.1～0.65μm滤膜过滤得到三次滤液。

在一些实施方案中，所述松茸提取液松茸提取液先通过5μm滤膜过滤得到二次滤液；二次滤液再通过0.25μm滤膜过滤得到三次滤液。

本发明所述松茸提取物的制备方法中所述三次滤液经浓缩、干燥得到松茸提取物。作为优选，所述干燥为真空冷冻干燥。

由以上技术方案可知，本发明提供了松茸提取物在提高体内源性抗氧化系统的能力中的应用，可以修复光损伤/光老化后皮肤的损伤以及治疗由于g6pd缺乏而引起的疾病、组织的老化和组织的功能降低，并可应用于g6pd增强剂或抗氧化剂的制备中。

附图说明

图1所示为葡萄糖6磷酸脱氢酶(g6pd)试剂盒定量检测皮肤组织g6pd的表达含量结果；其中，各组间差异比较用单因素方差分析(one-wayanova)，与空白组相比：#p＜0.05；与模型组相比：*p＜0.05，**p＜0.01；

图2所示为ros试剂盒定量检测皮肤组织ros水平；其中，各组间差异比较用单因素方差分析(one-wayanova)，与空白组相比：#p＜0.05；与模型组相比：*p＜0.05，**p＜0.01。

具体实施方式

本发明公开了松茸提取物的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，所述松茸提取物按照如下方法提取：

将松茸粉碎后按1:5～1:20的重量比加入70％乙醇水溶液，20℃～60℃采用浸泡加热法提取240分钟，常规过滤后收集一次滤液；冷却后通过1～5μm滤膜过滤得到二次滤液；二次滤液通过0.1～0.65μm滤膜过滤得到三次滤液；将三次滤液浓缩、干燥得到松茸提取物。

以下就本发明所提供的松茸提取物的应用做进一步说明。

实施例1：提取松茸提取物

将松茸粉碎后，称取50g粉末按1:10的重量比加入70％乙醇水溶液，20℃～60℃采用浸泡加热法提取240分钟，常规过滤后收集一次滤液；冷却后通过1～5μm滤膜过滤得到二次滤液；二次滤液通过0.1～0.65μm滤膜过滤得到三次滤液；将三次滤液浓缩、冷冻干燥得3.68g松茸提取物冻干粉。

实施例2：g6pd增强试验

称取松茸提取物1.25g，加入到28.25g膏霜基质(包含如下按质量百分比计的组分：硬脂酸20.0％，氢氧化钾(80％w/w)1.25％，甘油10.0％，去离子水68.75％)中，混匀，配制成4.2％w/w松茸提取物的膏霜，取其中部分，用膏霜基质配制成松茸提取物含量为0.42％w/w的膏体；称取维生素c125mg，加入到29.38g膏霜基质，配制成0.42％w/w，备用。

spf级昆明小鼠，雌性6～7周龄(广东中医药大学，18-22g)24只，5只一组，分成正常组、uvb照射组、维生素c组、松茸提取物高剂量防护组和松茸提取物低剂量防护组，共5组。每组小鼠背部皮肤脱毛，用6％w/w硫化钠水溶液除去绒毛，正常组每日只使用凡士林涂抹背部皮肤，除了正常组外，其余各组每日进行uvb(302nm)照射，建立uvb诱导皮肤损伤模型。第一周紫外光的起始强度为最小红斑剂量(med)，照射剂量100mj/cm²，光源约高10cm，持续到第4周，为4个最小红斑剂量(med)，5次/周(除周六、日外)，在剩下的几个周期内400mj/cm²/次。整个辐射剂量约13j/cm²，整个实验周期为8周；uvb照射前2h，按分组随即于背部涂抹118mg/1次/天，松茸提取物涂抹剂量浓度分别为4.2％w/w、0.42％w/w，正常对照组和模型组涂抹118mg膏霜基质。

g6pd酶活测试:

取放置-80℃适量皮肤组织，冰上冻融。按每100mg皮肤组织加入1ml预冷的磷酸缓冲溶液，使用组织研磨仪进行组织研磨处理，在4℃以10000g离心10分钟，所有测试样品均采用二喹啉甲酸(bca)法进行蛋白质统一标定。

部分上述样品总上清液用于小鼠皮肤6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pd)试剂盒(北京索莱宝)进行含量测定。

测定结果见图1，松茸提取物能够显著促进g6pd的表达，含量显著多于正常对照组、模型组以及维生素c组。

实施例3：ros清除试验

称取松茸提取物1.25g，加入12.5ml甘油和12.5ml水，混匀，配制成4.2％w/w松茸提取物的甘油水溶液，取其中部分溶液，用甘油水溶液稀释至0.42％w/w，再称取维生素c125mg，加入12.5ml甘油和12.5ml水，混匀，配制成0.42％w/w，备用。

spf级昆明小鼠，雌性6～7周龄(广东中医药大学，18-22g)25只，5只一组，分成正常组、uvb组、维生素c组、松茸提取物高剂量防护组和松茸提取物低剂量防护组，共5组。每组小鼠背部皮肤脱毛，用6％w/w硫化钠水溶液除去绒毛，正常组每日只使用甘油水溶液涂抹背部皮肤，除了正常组外，其余各组每日进行uvb(302nm)照射，建立uvb诱导皮肤损伤模型。第一周紫外光的起始强度为最小红斑剂量(med)，照射剂量100mj/cm²，光源约高10cm，持续到第4周，为4个最小红斑剂量(med)，5次/周(除周六、日外)，在剩下的几个周期内400mj/cm²/次。整个辐射剂量约13j/cm²，整个实验周期为8周；uvb照射前2h，按分组随即于背部涂抹100l/1次/天,松茸提取物剂量浓度分别为164mm(或4.2％w/w)、16.4mm(或0.42％w/w),维生素c组涂抹剂量浓度为15mm(或0.42％w/w)，正常对照组和模型组涂抹100l相同甘油和水溶剂。

ros酶联免疫吸附实验(elisa)测试:

取放置-80℃适量皮肤组织，冰上冻融。按每100mg皮肤组织加入1ml预冷的磷酸缓冲溶液，使用组织研磨仪进行组织研磨处理，在4℃以10000g离心10分钟，部分样品总上清液用于小鼠ros因子酶联免疫试剂盒(江苏酶标)进行含量测量。

测定结果见图2，松茸提取物能够显著降低ros的含量，优于正常对照组、模型组以及维生素c组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。