石墨烯基复合材料、制备方法及应用

1.本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及石墨烯基复合材料、制备方法及在肿瘤治疗领域的应用。


背景技术：

2.癌症(恶性肿瘤)是严重危害人类健康的难治疾病之一，每年都具有较高的发病率和死亡率。因此，对于肿瘤形成及治疗方法的研究，目前己经成为研究人员的研究重点和热点。近年来，生物医学与纳米技术的结合为癌症的治疗带来了新机遇。具有独特的光学、磁学、电学和声学等理化性质的纳米药物为重大疾病的预防、诊断和治疗带来了新思路。
3.石墨烯的性质优异，拥有极大的比表面积，极高的杨氏模量和电子迁移率以及最高的热导率等，同时具有优异的化学稳定性和生物相容性，使得其在传感器、催化、能源、生物等领域具有极大的应用前景。借助于拥有巨大比表面积的石墨烯，可有效负载药物，实现体内药物的释放。目前而言，研究较多的是氧化石墨烯在生物体内的应用，但是氧化石墨烯的制备方法以hummers方法(w.s.hummers,et al.j.am.chem.soc.1958,80,1339)为主，伴随而来的是石墨烯品质较差，纯度较低，含氧量较高，并且后处理复杂以及污染严重等问题。而且通常在生物体内利用氧化石墨烯时，均需要将其进行破碎处理得到小于200nm的石墨烯片层，繁琐耗时。
4.除此之外，随着纳米材料作为药物载体在生物医药方面的广泛应用，如何让纳米材料同时兼具肿瘤热疗和化疗的联合治疗，已成为关注的焦点。而最近，新兴的微波热疗技术由于穿透深度深、副作用小等，逐渐得到了众多研究者的青睐，而相关的研究还处于研究起步阶段。发展一种基于微波热疗和化疗相结合的纳米复合材料具有极其重大的意义。


技术实现要素：

5.为克服上述缺陷，本发明提供一种石墨烯基复合材料、制备方法及应用。
6.本发明一方面提供一种石墨烯基复合材料，包括修饰有两亲性表面活性剂的石墨烯、相变材料和负载的药物；所述石墨烯的片径尺寸为100～300nm，层数为1～10层；所述两亲性表面活性剂和所述相变材料适用于人体或动物体且无毒害，所述相变材料的相变温度为38-45℃；所述药物为治疗肿瘤的药物。
7.根据本发明的一实施方式，所述石墨烯中氧的元素含量百分比低于5％、拉曼光谱中d峰强度与g峰强度的比值小于0.5。
8.根据本发明的另一实施方式，所述相变材料为1-十四醇。
9.根据本发明的另一实施方式，所述药物为脂溶性药物，优选阿帕替尼。
10.根据本发明的另一实施方式，所述两亲性表面活性剂选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇(plga-peg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、聚马来酸酐-十八烯-聚乙二醇(c18pmh-peg)中的一种或多种，其中聚乙二醇的分子量≥2000。
11.本发明另一方面提供一种石墨烯基复合材料的制备方法，包括：s1，利用微波等离
子体化学气相沉积法、电弧放电法或者射频法制备石墨烯；s2，对所述石墨烯修饰两亲性表面活性剂；以及s3，将修饰有两亲性表面活性剂的石墨烯、相变材料和药物混合；其中，所述石墨烯的片径尺寸在100～300nm，层数为1～10层；所述两亲性表面活性剂和所述相变材料适用于人体或动物体且无毒害，所述相变材料的相变温度为38-45℃；所述药物为治疗肿瘤的药物。
12.本发明又一方面提供一种上述石墨烯基复合材料在治疗肿瘤中的应用。
13.根据本发明的一实施方式，所述肿瘤为胃癌、乳腺癌、肝癌、舌癌中的一种或多种。
14.根据本发明的另一实施方式，在微波辐照下进行治疗，微波频率为300～700mhz。
15.根据本发明的另一实施方式，微波功率为0.5～10w，辐照时间为0～15min。
16.本发明通过选用特定尺寸的石墨烯制备含药物分子的石墨烯基复合材料。同时利用该复合材料，在微波的作用下，可实现原位的药物释放，达到化疗和热疗的联合治疗，共同作用以杀死肿瘤细胞。
附图说明
17.通过参照附图详细描述其示例实施方式，本发明的上述和其它特征及优点将变得更加明显。
18.图1是本发明实施例制备的石墨烯的拉曼光谱图。
19.图2是本发明实施例制备的石墨烯的透射电镜图。
20.图3是本发明实施例制备的石墨烯的电磁波吸收曲线图。
21.图4是本发明实施例制备的石墨烯基复合材料的制备过程及作用原理的示意图。
22.图5是本发明实施例制备的修饰表面活性剂的石墨烯在微波辐照下的升温图。
23.图6是本发明实施例制备的石墨烯基复合材料在微波辐照下的药物释放图。
24.图7a和图7b为是本发明实施例制备的石墨烯基复合材料的细胞实验图。
25.图8是本发明实施例制备的石墨烯基复合材料的石墨烯基复合材料的细胞抑制实验图。
26.图9是小鼠的体重随时间的变化对比图。
27.图10是小鼠的肿瘤体积随时间的变化对比图。
28.图11是小鼠的生存曲线对比图。
29.图12是小鼠在第15天时的肿瘤重量对比图。
具体实施方式
30.以下内容提供了不同的实施例或范例，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。当然，这些仅仅是范例，而非意图限制本发明。在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应当被视为在本文中具体公开。对于s1、s2、s3仅用于区分不同的步骤，不意在限定各步骤的顺序。
31.本发明的石墨烯基复合材料，包括修饰有两亲性表面活性剂的石墨烯相变材料和负载的药物。石墨烯的片径尺寸为100～300nm，层数为1～10层。两亲性表面活性剂和相变
材料适用于人体或动物体且无毒害。相变材料的相变温度为38-45℃。药物为治疗肿瘤的药物。
32.由于生物体的血管尺寸限制，尺寸在100～300nm的石墨烯适用于药物载体用于人体治疗，同时其高的比表面积可保证其高的载药率。优选，石墨烯中氧的元素含量百分比低于5％、拉曼光谱中d峰强度与g峰强度的比值小于0.5。石墨烯中低的氧含量(低于5％)以及极高的品质(d峰强度与g峰强度的比值小于0.5)有利于保持石墨烯结构的完美性，有利于电磁波的吸收，并通过介电损耗在原位产生热量，从而使相变材料由固态转换成液态同时释放负载的药物达到化疗和热疗的联合治疗。石墨烯修饰两亲性表面活性剂使得其在血液中能够良好分散。两亲性表面活性剂应当是适用于对人体或动物体、对人体或动物体没有毒害的。具体但不限于，聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇(plga-peg)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、聚马来酸酐-十八烯-聚乙二醇(c18pmh-peg)等修饰，其中peg的分子量≥2000等。
33.相变材料也应当是适用于对人体或动物体、对人体或动物体没有毒害的。且相变材料的相变温度点应当是38-45℃之间，即当石墨烯在微波作用下温度提升时，可促进相变材料由固态转换成液态从而将负载的药物释放，达到原位药物释放的目的，实现化疗的目的。
34.复合材料中的药物可以是任何适用于肿瘤治疗的药物。药物可以是但不限于脂溶性药物，例如阿帕替尼等。
35.石墨烯基复合材料中，两亲性表面活性剂的含量、相变材料的含量、和药物的含量可以根据实际需要适当选择。例如两亲性表面活性剂与石墨烯的比例可以是1：1～1：3，药物载药率可以为10～30wt％。
36.本发明的石墨烯基复合材料可以通过如下方法制备，s1，利用微波等离子体化学气相沉积法、电弧放电法或者射频法制备石墨烯；s2，对石墨烯修饰两亲性表面活性剂；以及s3，将修饰有两亲性表面活性剂的石墨烯、相变材料和药物混合，达到相变材料包裹石墨烯，药物负载于石墨烯的目的；其中，石墨烯的片径尺寸在100～300nm，层数为1～10层；两亲性表面活性剂和相变材料适用于人体或动物体且对人体或动物体无毒害，相变材料的相变温度为38-45℃；药物为治疗肿瘤的药物。
37.例如采用微波等离子体化学气相沉积法制备石墨烯时可以是，微波功率为2450mh或者915mhz，频率为300～2000w，惰性气体选自氩气、氪气和氙气中的一种或多种。碳源选自烃、醇、醚、酮和酚中的一种或多种。采用上述参数，利用微波等离子体设备可以实现石墨烯的气相生长。除此之外，还可以采用电弧放电法或者射频法制备石墨烯。通过微波等离子体化学气相沉积法制备的石墨烯含氧量极低，品质极高。可以达到比表面积大于250m2/g，杂质含量～0，氧含量(元素含量)<0.7％，石墨烯的拉曼光谱中，位于1340cm-1
附近的d峰强度与位于1580cm-1
附近的g峰强度的比值小于0.5，且位于2700cm-1
附近的2d峰强度与位于1580cm-1
附近的g峰强度的比值大于0.75。适合用作药物的载体，实现热疗和化疗的联合治疗。同样，电弧放电法或者射频法制备的石墨烯也可以达到本发明要求的高品质、小尺寸，可以作为药物的载体用于肿瘤的治疗，实现热疗和化疗的联合治疗。
38.本发明的石墨烯基复合材料可以用于肿瘤的治疗。静脉注射或者病灶部位注射的方式注入人体或动物体内。之后，利用微波进行辐照。在微波辐照的作用下，复合材料产生
热量并释放药物，实现化疗和热疗的联合治疗。优选，所用微波热疗的频率为300～700mhz，微波功率为0.5～10w，微波热疗时间为0～15min。由于微波的频率较低，因此其波长较大，穿透深度大，有利于微波热疗的进行，而且由于石墨烯的热效应一方面促进肿瘤细胞的死亡，同时促进药物释放，达到了微波下原位热疗和化疗的同时进行。本发明的复合材料可以但不限于，胃癌、乳腺癌、肝癌、舌癌等的治疗
39.以下结合具体实施例详细解释本发明的发明构思。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
40.实施例1
41.制备石墨烯
42.向微波等离子体化学气相沉积系统中通入1200sccm ar吹赶体系中残留的空气。通过调节微波功率至700w并引发体系产生ar等离子体，之后通入3sccm ch4进入体系中。此时体系产生明亮的发光现象，同时在石英管尾端可见黑色絮状物持续飘离体系，收集黑色絮状物。反应约25分钟后关闭ch4流量计，并可见微波反应腔区域的石英管壁残留较多的黑色物质。在700w功率下，此时通入9.9sccm氧气进入体系中进行残留石墨烯的刻蚀，约1～2分钟后可见微波反应腔区域的石英管壁无明显黑色物质残留，表明该区域残留石墨烯被刻蚀完全。连续重复上述步骤反应约10h，得到大量粉体石墨烯，实现粉体石墨烯的连续放量制备。
43.图1是制备的石墨烯的拉曼图谱，其中i
d
/i
g
<0.3,i
2d
/i
g
>1.0，可以看出得到的石墨烯具有极高的品质。图2是制备的石墨烯的透射电镜(tem)图，可以看出其石墨烯的尺寸在100～300nm之间。图3是制备的石墨烯的电磁波吸收曲线图，可以看出石墨烯在低频下具有吸波性能。
44.制备石墨烯基复合材料(dpa@石墨烯)
45.结合图4说明本发明的石墨烯基复合材料的制备过程及作用原理。
46.取100mg的制备的石墨烯，100mg的dspe-peg
2000
，冰水浴下于二氯甲烷中进行超声震荡～2h，之后蒸干得到修饰有dspe-peg
2000
的石墨烯。取20mg的该石墨烯于锥形瓶中，加入2ml乙醇，再取11.4mg阿帕替尼，12.9mg的1-十四醇于锥形瓶中，超声溶解分散均匀，然后用油泵抽干，之后利用乙醇洗涤，水洗，得到负载药物的石墨烯基复合材料。
47.将上述修饰有dspe-peg
2000
的石墨烯分散于生理盐水(0.9％nacl水溶液)中形成稳定的分散液。采用450mhz、1.8w微波辐照，图5示出不同含量的该分散液随辐照时间的变化的温度变化曲线。如图5中可以看出，辐照5min后且石墨烯浓度为10mg/ml时，其可较生理盐水多升温8.2℃，可以说明本发明的石墨烯对微波具有较好的响应，有利于该石墨烯基复合材料用于肿瘤治疗时可以实现热疗的目的。
48.通过测量上清液的吸光度可以计算上述制得的石墨烯基复合材料的药物释放情况。图6示出了上述制得的石墨烯基复合材料在微波辐照下的药物释放效果图。从图中可以看出，当未有微波辐照时50h后石墨烯释放药物百分比仅为19.71％，而当有微波辐照时50h后石墨烯释放药物百分比高达45.29％，这表明微波可作为“温控开关”促进药物释放。
49.对小鼠肿瘤细胞的体外检测
50.将小鼠正常成纤维细胞l929，小鼠肝癌细胞h22平铺在96孔板中并在适宜的条件
下培养24h(37℃，5％co2)。取上述制得的石墨烯基复合材料分别按照0μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml和200μg/ml的剂量置于l929细胞和h22细胞培养基中，并进行培养24h，通过mtt法测得细胞存活率。将h22平铺在6孔板中并在适宜的条件下培养24h，分别在空白、药物阿帕替尼、微波辐照、50μg/ml的石墨烯基复合材料以及50μg/ml的石墨烯基复合材料并辅助以微波辐照5min的环境下进行培养，mtt法统计细胞的存活率。
51.图7a和图7b示出了制备的石墨烯基复合材料的细胞实验图，可以看出本发明的石墨烯基复合材料的毒性较小。图8示出各组材料对小鼠肝癌细胞h22的细胞实验图，可以看出当加入该复合材料同时施加微波辐照时，h22细胞可被大部分杀死，表明体外测试时该复合材料的有效性。
52.对小鼠肿瘤细胞的体内检测
53.选择体重在22g左右并携带有h22肿瘤细胞的雌性小鼠作为实验小鼠，将小鼠随机分为5组(每组5只，肿瘤体积150
±
30mm3)。分别按照空白对照组、加入阿帕替尼药物组、单纯微波辐照组、加入50mg/kg负载药物的石墨烯基复合材料组、加入50mg/kg负载药物的石墨烯基复合材料并辅助以微波辐照组进行动物实验。每天记录小鼠的体重、肿瘤的大小。在第十五天时杀死小鼠，记录肿瘤的重量。
54.图9是小鼠的体重随时间的变化图，各小组变化趋势接近一致。图10是小鼠的肿瘤体积随时间的变化图，可见加入负载药物的石墨烯基复合材料并辅以微波辐照的小组小鼠肿瘤体积最小，肿瘤抑制率高达85％以上。图11是小鼠的生存曲线，定义肿瘤体积大于1300mm3即代表小鼠死亡，可见加入负载药物的石墨烯基复合材料并辅以微波辐照的小组小鼠在14天内均存活。图12是小鼠的在最后一天的肿瘤重量图，可见加入负载药物的石墨烯基复合材料并辅以微波辐照的小组小鼠肿瘤体积是最小的。
55.综上可知，本发明提供的石墨烯基复合材料，在微波的作用下，可以实现原位的药物释放，达到化疗和热疗的联合治疗，共同作用以杀死肿瘤细胞。并且该复合材料在动物实验中展现出高的肿瘤抑制率，高达86.7％。
56.当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。