一种自产氧纳米粒及其介导肿瘤光动力治疗的应用的制作方法

本发明属于纳米生物医学技术领域，具体而言，涉及一种新型自产氧靶向纳米粒及其制备方法和介导肿瘤光动力治疗的应用。

背景技术：

光动力疗法(pdt)是一种颇有前景的治疗方法，同传统疗法相比，pdt的优势在于创伤小、毒性低、选择性好、适用性强、可重复治疗并可以协同手术等其它治疗方法从而提高治疗效果，已被用于治疗包括恶性肿瘤在内的多种疾病。pdt依赖于具有特定波长的激发光作为光源照射光敏剂，在分子氧存在的情况下产生单线态氧，导致肿瘤细胞凋亡或坏死。光敏剂是pdt的核心，传统的光敏剂如卟啉及其衍生物存在一些缺陷，包括半衰期长，代谢缓慢，水溶性差，易发生团聚，激发波长短导致组织穿透深度有限，这些不足限制了它们在临床中的应用[pollackm,etal.safetyofresuminganti-pd-1inpatientswithimmune-relatedadverseevents(iraes)duringcombinedanti-ctla-4andanti-pd1inmetastaticmelanoma.annoncol,2018,29:250-255.]。

随着光动力学研究的发展，越来越多的新型光敏剂被发现。近红外荧光染料如icg就是其中一种颇具潜力的光敏剂，研究发现它们不仅具有优异的荧光成像能力，而且具有光热(ptt)和pdt疗效。近红外荧光染料的激发波长位于近红外区，这有利于减少来自于周围组织吸收和荧光的干扰，且较长的近红外光具有更优越的组织穿透性，在近红外(nir)激光照射下，近红外荧光染料能够产生大量的单线态氧，这些特性使它们成为潜在的光敏剂。ir820是一种新型近红外荧光染料，同icg一样也可用于荧光成像和ptt/pdt]。li等人将多西紫杉醇和ir820共同包载进纳米胶束中，在nir激光照射下，ir820能够产生单线态氧协同化疗有效抑制肿瘤的生长[liw,etal.mildphotothermaltherapy/photodynamictherapy/chemotherapyofbreastcancerbylyp-1modifieddocetaxel/ir820co-loadedmicelles.biomaterials,2016,106:119-133.]。

光敏剂通过将光化学作用产生的能量传递给周围分子氧，生成强活性的单线态氧或其它活性氧而发挥pdt治疗作用，因此治疗部位的分子氧水平也是制约pdt疗效的因素之一。由于肿瘤细胞的生长、代谢迅速而氧供往往不足，导致肿瘤微环境呈现低氧状态，且pdt治疗时会不断消耗氧气进而加重缺氧，底物的不足会使单线态氧的产率降低，最终影响pdt的疗效[yangzl,tianw,wangq,etal.oxygen-evolvingmesoporousorganosilicacoatedprussianbluenanoplatformforhighlyefficientphotodynamictherapyoftumors.advsci(weinh),2018,5(5):1700847.]。为了解决这一问题，研究人员已经尝试了多种措施来提高光敏剂周围的氧浓度。例如，cheng等人利用全氟化碳可以容纳比肿瘤微环境更高的氧含量这一原理将光敏剂装载到全氟化碳纳米小滴中，在肿瘤局部，丰富的氧气能够保证光敏剂产生足量的活性氧，从而实现增强的pdt治疗效果[chengy,chengh,jiangc,etal.perfluorocarbonnanoparticlesenhancereactiveoxygenlevelsandtumourgrowthinhibitioninphotodynamictherapy.natcommun,2015,6:8785.]。guo等人将血红蛋白和光敏剂icg封装在脂质体中，可以有效地将氧气输送到肿瘤部位，减轻缺氧状态，增加pdt对肿瘤的抑制作用[guox,quj,zhuc,etal.synchronousdeliveryofoxygenandphotosensitizerforalleviationofhypoxiatumormicroenvironmentanddramaticallyenhancedphotodynamictherapy.drugdeliv,2018,25(1):585-599.]。尽管上述方法在一定程度上增强了pdt的疗效，然而其存在一些问题需要去克服，例如复杂的药物合成程序、携氧稳定性和肿瘤中的氧释放效率等等。

目前的研究发现，与正常组织相比，肿瘤组织中存在更高浓度的过氧化氢(h2o2)(浓度范围：100μm～1mm)，而h2o2在一定条件下能够分解为水和氧气，因此它是肿瘤组织中氧气的潜在储备库。二氧化锰(mno2)可以与h2o2在酸性ph条件下反应产生氧气，反应方程式为：mno2+h2o2+2h⁺→mn²⁺+2h2o+o2↑，利用这一原理，xing等人合成了mno2纳米粒，并将其作为载体，将光敏剂递呈到肿瘤局部，mno2与肿瘤组织中的h2o2反应后增加了氧含量，进而增强了pdt的杀肿瘤作用[aix,hum,wangz,etal.enhancedcellularablationbyattenuatinghypoxiastatusandreprogrammingtumor-associatedmacrophagesvianirlight-responsiveupconversionnanocrystals.bioconjugchem,2018,29(4):928-938.]。然而，繁琐的合成步骤以及过量锰离子摄入带来的潜在的生物安全性等问题仍然存在。因此，寻找安全高效的产氧剂具有重要的意义。

技术实现要素：

鉴于肿瘤微环境乏氧导致光动力治疗中的主要毒性物质ros产量低的不足，本发明的目的在于提供一种以聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体的新型自产氧靶向纳米粒，从而为缓解肿瘤缺氧和改善pdt治疗恶性黑素瘤提供了一种新的思路和方法。

为了实现上述技术目的，发明人考虑到过氧化氢酶(cat)是生物体内产生的一种高效酶，可通过催化h2o2(cat：h2o2＝1：～1,000,000)产生氧气，增加肿瘤局部氧浓度，调节肿瘤缺氧。将cat与光敏剂联合应用能够显著提高光敏剂介导的pdt作用。然而，体内存在的蛋白酶很容易导致游离cat失活，并且游离药物包括光敏剂由于缺乏肿瘤选择性而难以在肿瘤内有效积累，导致产氧量和pdt疗效受限。

为此，本发明人进一步将cat等游离药物包封于其内部，从而隔离它们与体内分子的接触，既提高了它们的稳定性又不影响它们的生物学功能。基于前期的研究积累和设想，本发明人将ir820和cat共同包载于plga纳米颗粒中。为了提高其靶向肿瘤细胞的能力，在纳米颗粒表面修饰能够靶向cd44分子的透明质酸(ha)从而构建了ha-plga-cat-ir820纳米粒(hcinp)。当载药纳米粒靶向进入肿瘤组织后，其内cat可以通过催化h2o2产生氧气并释放，克服肿瘤组织缺氧，提高局部氧浓度；ir820在nir激光照射下将氧气转化为单线态氧发挥pdt治疗作用。

具体地，本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒，该自产氧纳米粒呈核-壳-壳的球形结构，ir820和cat分布于纳米粒内部，plga构成纳米粒内壳，最外层包被有ha作为外壳，其中ha为透明质酸，plga为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，ir820为新型吲哚菁绿，cat为过氧化氢酶。需要说明的是，在本发明中plga优选plga50:50嵌段共聚物，其是一种经过美国食品药品监督管理局批准可以作为药用辅料的聚合物，具有优异的生物相容性、生物降解性和易于改性等特点。

另外，本发明还提供了一种介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)取cat和ir820加入至浓度为0.7-2.0％的pva水溶液中，充分溶解并混匀；

(2)称取plga溶于有机溶剂中，得到plga溶液；

(3)将步骤(1)所得溶液滴入步骤(2)的plga溶液中，超声乳化得到初级乳液；

(4)取ha加入到浓度为1-4％聚乙烯醇水溶液中，搅拌至充分溶解混匀，然后逐滴加入所述初级乳液，并超声乳化得到复乳；

(5)将步骤(4)得到的复乳在室温下避光搅拌8-16h，搅拌速度为200-400r/min，去除多余的有机溶剂，收集得到的澄清溶液，使用高速冷冻离心机于4℃、14000rpm离心18-23min，收集沉淀，并使用超纯水或pbs对沉淀洗涤2-4次，去除游离药物及杂质，得到自产氧纳米粒。

进一步优选地，如上所述介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒的制备方法，其中的ir820、cat、plga、ha的用量分别为：

再进一步优选地，如上所述介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒的制备方法，其中的ir820、cat、plga、ha的用量分别为：

在本发明的一个最优选的实施例中，如上所述介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒的制备方法，其中的ir820、cat、plga、ha的用量分别为：

进一步优选地，如上所述介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒的制备方法，步骤(2)中的有机溶剂选自如下的一种：二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮。

进一步优选地，如上所述介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒的制备方法，步骤(3)中超声乳化的技术参数为：400-500w超声1.5-2.5min。

进一步优选地，如上所述介导肿瘤光动力治疗的自产氧纳米粒的制备方法，步骤(4)所述超声乳化的技术参数为：320-380w超声4-6min。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和显著进步性：

(1)成功构建cd44靶向自产氧纳米载药系统hcinp，呈球形，单分散性良好，水合粒径为187.4nm，pdi为0.125，表面电荷为-16.3mv；ir820和cat在hcinp纳米粒中的包封率分别为27.6％和19.1％；稳定性测定结果显示hcinp纳米粒在水溶液和培养基环境中都具有良好的稳定性。

(2)hcinp纳米粒的生物相容性良好；将纳米粒处理hsf细胞和mv3细胞后，肿瘤细胞能够大量摄入纳米粒，且其摄入量随材料浓度增加而增加；纳米粒经內吞方式进入细胞，定位于溶酶体。

(3)体外的产氧能力测定结果显示hcinp纳米粒能够催化h2o2产生氧气；荷瘤小鼠模型实验结果显示，经尾静脉注射进入肿瘤组织的hcinp纳米粒能够利用h2o2产生氧气，调节肿瘤局部乏氧状态，下调hif-1α的表达。

(4)体外实验结果显示hcinp纳米粒在nir激光照射下能发挥增强的pdt作用，其作用强于ir820+nir、cinp+nir和hinp+nir治疗组。进入肿瘤组织的hcinp纳米粒在nir激光照射下能发挥增强的pdt作用，其作用强于ir820+nir、、cinp+nir和hinp+nir治疗组，有效抑制黑素瘤生长和复发。

(5)小鼠体重监测、血生化和病理检测结果表明hcinp+nir治疗对荷瘤裸鼠未显示出明显的系统毒副作用。

附图说明

图1：hcinp纳米粒的合成和结构示意图。

图2：hcinp纳米粒的粒径(a)和表面电荷(b)。

图3：cinp(a)和hcinp(b)纳米粒的tem照片。

图4：激光扫描共聚焦显微镜检测ha对纳米粒的修饰。

图5：hcinp纳米粒的紫外/可见/近红外吸收光谱。

图6：标准曲线及线性回归方程；其中，(a)ir820标准品；(b)蛋白质标准品。

图7：hcinp纳米粒在水溶液中(a)和在不同细胞培养溶液中(b)的稳定性。

图8：光学显微镜(a)和超声成像仪(b)研究hcinp催化h2o2产生氧气的能力。

图9：qrt-pcr(a)和免疫荧光法(b)检测cd44在黑素瘤细胞中的表达(注：*与hsf组相比较，p<0.05)。

图10：cck-8法测定hcinp纳米粒对hsf细胞(a)和mv3细胞(b)的细胞毒性。

图11：倒置荧光显微镜检测mv3细胞对f-hcinp(f-np)纳米粒的摄入。

图12：倒置荧光显微镜检测hsf细胞和mv3细胞对f-hcinp(f-np)纳米粒的靶向摄入。

图13：激光扫描共聚焦显微镜检测f-hcinp(f-np)纳米粒的摄入和细胞内定位。

图14：倒置荧光显微镜检测hcinp纳米粒(np)在肿瘤细胞内的产氧能力(a)和平均荧光强度分析(b)(注：*与ctr组相比较，p<0.05)。

图15：live-dead法在体外研究hcinp纳米粒介导的增强的pdt作用；其中，a：ctr组，不加药物不照射激光；b：nir组，不加药物只照射激光；c：hcinp组，只加hcinp；d：ir820+nir组，加入ir820并照射nir激光；e：cinp+nir组，加入cinp并照射nir激光；f：hinp+nir组，加入hinp并照射nir激光；g：hcinp+nir组，加入hcinp并照射nir激光。

图16：免疫组化法研究hcinp纳米粒进入肿瘤组织后调节hif-1α的表达(200×)。

图17：荷瘤模型研究hcinp纳米粒对黑素瘤的治疗效果。a：肿瘤生长曲线；b：治疗结束后肿瘤重量分析。

图18：hcinp纳米粒对小鼠主要脏器的组织病理学检测(200×)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：靶向自产氧纳米粒hcinp的合成、鉴定和表征

1材料

plga(50:50,10kd)西安瑞禧生物科技有限公司

pva(30～70kd)美国sigma-aldrich公司

2方法

2.1ha-plga-cat-ir820(hcinp)纳米粒的合成

(1)使用天平准确称取1mg的cat和1mg的ir820粉末加入至0.2ml浓度为1％的pva水溶液中充分溶解并混匀。

(2)称取10mg的plga粉末加入至2mldcm中溶解。

(3)将第一步所得溶液滴入plga溶液中，使用超声波细胞破碎仪(900w)进行超声乳化(冰浴，50％功率，2min)得到初级乳液。

(4)称取0.5mg的ha粉末加入到10ml浓度为2％的pva水溶液中并放置于磁力搅拌器上充分溶解混匀。

(5)将初级乳液逐滴加入至步骤4所述溶液中，将得到的溶液放于超声波细胞破碎仪下进行超声乳化(冰浴，39％功率，5min)得到复乳。

(6)随后，将得到的均匀乳液放置于磁力搅拌器上室温下避光搅拌过夜，挥发有机溶剂。

(7)次日对得到的澄清溶液进行离心(14000rpm，20min)收集，并使用超纯水或pbs对沉淀洗涤3次，除去游离药物和杂质。

(8)最后加入500μl超纯水或pbs重悬浮，所得产物即为hcinp纳米粒，将其放置于4℃冰箱中保存备用。

2.2hcnp、cinp、hinp纳米粒的合成

按照2.1中介导的纳米粒的合成方法进一步合成ha-plga-cat(hcnp)、plga-cat-ir820(cinp)、ha-plga-ir820(hinp)纳米粒，除了合成过程中不投入ir820、ha或cat之外，其它步骤一样。

2.3hcinp纳米粒的鉴定和表征

(1)将hcinp的水溶液使用超纯水进行适量稀释，使用dls粒度分析仪测定纳米粒的水合粒径、pdi和zeta电位。

(2)分别取hcinp和cinp的水溶液进行适量稀释，滴加至喷有碳膜的铜网之上，10min后使用滤纸将溶液吸干；向铜网上滴一滴醋酸双氧铀染色1min，用滤纸将多余的染料沿铜网边缘小心吸干净，晾干后使用tem对样品进行观察拍照，并通过电镜照片和nanomeasurer1.2软件对样品进行粒度分析。

(3)将一定量的细胞膜红色荧光探针dii溶解于dcm中，并使用荧光标记的ha-fitc代替ha，其它步骤不变，按照前述方法合成纳米粒。使用激光扫描共聚焦显微镜对纳米粒进行观察拍照(dii：最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm；fitc：最大激发波长为494nm，最大发射波长为525nm)。

(4)使用超纯水对ir820、hcnp和hcinp溶液进行适量稀释，采用紫外分光光度计测定各组药物的紫外吸收谱。

2.4包封率测定

2.4.1ir820的包封率测定

(1)使用游离ir820配制标准品，设置各浓度分别为0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50μg/ml，通过测定标准品在690nm波长处的吸光度，绘制标准曲线。

(2)将制备hcinp纳米粒过程中离心收集的上清液进行稀释后同标准品一同进行测定。

(3)将样品测定的吸光度值代入通过标准曲线拟合得到的回归方程计算药物浓度，乘以稀释倍数即为样品上清中的药物浓度，最后乘以上清总体积即为游离药物质量。

(4)ir820的包封率＝药物初始质量-游离药物质量/药物初始质量×100％。

2.4.2cat包封率测定

(1)按50:1的体积比混合试剂a和试剂b配制适量bca工作液，混匀后备用。

(2)配置蛋白标准品并稀释至终浓度为0.5mg/ml，将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20μl，则浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

(3)将制备hcinp纳米粒过程中离心收集的上清液进行稀释后取20μl加入到96孔板中。

(4)向上述各孔中分别加入200μlbca工作液，置于37℃培养箱中孵育35min。

(5)通过多功能酶标仪测定标准品和样品在562nm波长处的吸光度，并绘制标准曲线。

(6)将样品测定的吸光度值代入标准曲线拟合得到的回归方程计算浓度，乘以稀释倍数即为样品上清中的药物浓度，最后乘以上清总体积即为游离药物质量。

(7)cat的包封率＝药物初始质量-游离药物质量/药物初始质量×100％

2.5hcinp的稳定性测定

(1)使用超纯水对hcinp纳米粒进行适量稀释，分别于0、3、6、9、12、15d使用dls粒度分析仪对纳米粒的水合粒径和pdi进行测定并记录。

(2)将纳米粒分别加入至pbs、dmem、dmem+10％fbs中进行相同浓度的稀释，使用dls粒度分析仪测定并记录纳米粒在0、24和48h的水合粒径大小。

2.6hcinp的产氧能力检测

分别配置ir820浓度为8μg/ml的hinp溶液和两份hcinp溶液，向hinp和其中一份hcinp溶液中加入一定量的h2o2溶液使其最终浓度为100μm，将混匀的三种溶液放于37℃温箱中孵育1h，对三组溶液中的气泡产生情况进行观察并拍照。

3结果

3.1hcinp载药纳米粒的合成

如图1所示，采用水相/油相/水相(w/o/w)双乳化溶剂挥发法制备hcinp载药纳米粒。设置药脂比为1:10，选择二氯甲烷作为有机相，pva作为乳化剂。ir820和cat分布于纳米粒的核中，外面有plga形成的壳结构，最外层则修饰有ha。

3.2hcinp的粒径和表面电荷

使用dls法测定纳米粒的水合粒径、pdi和表面电荷。实验结果显示hcinp纳米粒的平均水合粒径为187.4nm，pdi为0.125，较窄的粒径分布和较小的pdi数值表明我们所合成纳米粒的粒径大小较均匀(图2a)。zeta电位结果显示hcinp的表面电荷为-16.3mv(图2b)。

3.3tem观察纳米粒的形貌特征

使用tem分别观察并比较了cinp和hcinp纳米粒的形貌特征。如图3a所示，cinp纳米粒表现为典型的核-壳结构。而hcinp由于表面包裹有ha，因此在tem照片上呈现出核-壳-壳结构。hcinp纳米粒呈球形，单分散性较好，平均粒径为132.6nm(图3b)。

3.4激光扫描共聚焦显微镜检测ha对纳米粒的修饰

为了进一步验证ha成功修饰到纳米颗粒上，我们使用红色荧光探针dii和绿色荧光探针fitc分别对纳米粒和ha进行标记，采用同样的合成方法合成了荧光双标的纳米粒，并使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察并拍照。实验结果显示绿色的ha能够同红色的纳米粒具有良好的共定位关系，在merge的图片上可以看出其重叠后表现为橙黄色荧光(图4)。该结果表明ha成功的修饰到纳米粒上，同tem的结果相一致。

3.5hcinp的吸收光谱表征

紫外/可见/近红外吸收光谱显示hcnp纳米粒在400～1000nm的波长范围内没有吸收峰，游离ir820的最大吸收峰位于690nm，hcinp分别在740nm和830nm处具有较大的吸收，表明成功包载了ir820，cat在水溶液中的吸收峰约为230nm(图5)。

3.6纳米粒的药物含量测定

使用紫外分光光度法来测定ir820的包封率。由图5的吸收光谱可知ir820在水溶液中的吸收峰位于690nm，而纳米体系中的其它成分在该波长位置均没有吸收峰，不会干扰ir820的检测，故选择此波长作为ir820的检测波长。使用游离ir820配置标准品，绘制标准曲线，进行线性拟合得到回归方程：a＝0.0136c+0.0504，r2＝0.9996，ir820在0～50μg/ml浓度范围内线性关系良好(图6a)。根据方程计算游离药物量，根据公式(包封率＝(药物初始质量-游离药物质量)/药物初始质量×100％)计算得到ir820的包封率为27.6％。

使用bca法来测定cat的包封率，检测波长为562nm，ir820及其它成分在此波长位置均没有吸收峰，不会干扰检测结果。绘制标准曲线，进行线性拟合得到回归方程：a＝0.8386c+0.1111，r2＝0.9993(图6b)。根据方程式计算游离药物量，根据上述包封率公式计算得到cat的包封率为19.1％。

3.7hcinp的稳定性检测

通过测定hcinp纳米粒在0、3、6、9、12、15d时的水合粒径和pdi变化来检测其在水溶液中的稳定性。dls测量结果显示，hcinp的平均粒径和pdi在15d内保持稳定，说明纳米粒能够均匀分散在水溶液中，未发生团聚和分解，因此该纳米粒在水溶液中具有良好的稳定性(图7a)。

我们随后将等量的hcinp加入至pbs、dmem和dmem+10％fbs中来模拟纳米粒在不同生理环境中的状态从而研究纳米粒在细胞培养条件下的稳定性。如图7b所示，纳米粒在dmem+10％fbs中的水合粒径(185nm)同在水溶液中的相近，且随着时间延长未见明显变化。而pbs(194.4nm)和dmem(195.7nm)中的纳米粒的粒径有轻微的增加，但仍然小于200nm，而且也并未随着时间延长而改变。这些结果表明我们合成的hcinp纳米粒能够在水溶液和生理溶液中保持良好的稳定性。

3.8hcinp纳米粒催化h2o2产生氧气

h2o2分解产生的氧气在水溶液中会产生气泡，因此可以通过检测气泡的生成来判断hcinp纳米粒的产氧作用。将反应一段时间的各组溶液滴到玻片上，光学显微镜观察可见，hinp中由于不含有cat，因此同h2o2共孵育后未见气泡生成；单独hcinp组由于缺少催化底物因此也无气泡产生；而hcinp和h2o2共孵育一段时间后在管壁和溶液中可见大量气泡存在，显微镜照片也显示存在大量大小不一的气泡，表明有氧气产生(图8a)。

超声成像结果显示hinp+h2o2组和hcinp组未见气体超声信号，而hcinp+h2o2组在管壁间存在强回声信号，表明有大量气泡存在(图8b)，同光学显微镜的结果一致。这些结果证明cat成功包载到hcinp纳米粒中，且其酶活性良好，能够催化h2o2产生氧气。

实施例2：靶向自产氧纳米粒hcinp的体外抗肿瘤作用研究

1材料

细胞株：人皮肤成纤维细胞hsf购自北京北纳创联生物技术研究院、人皮肤黑素瘤细胞mv3、m14、a375购自中科院上海细胞库。

2方法

2.1细胞培养与细胞计数

2.1.1细胞培养所需试剂的配置：

(1)pbs配置：将pbs粉末倒入烧杯，加90％标准体积的超纯水溶解；取5ml的超纯水溶解袋中残余粉末，倒入烧杯中，重复三次；根据标准体积进行定容。

(2)dmem完全培养基：dmem基础培养基中加入10％胎牛血清和1％的青霉素-链霉素溶液(100×)。

(3)细胞冻存液：细胞冻存液需现用现配，向胎牛血清中按9:1的比例加入dmso，放于4℃冰箱备用。

2.1.2细胞复苏

(1)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放于已升温至37℃的水浴锅中，待其融化后放入超净工作台。

(2)打开冻存管，使用移液器将细胞悬液移入离心管中，加入4ml完全培养基，1000rpm离心5min。

(3)弃去上清液，加入5ml新鲜的完全培养基，轻轻吹打使细胞重悬。

(4)将细胞悬液加到培养皿中，补充培养基，随后放入细胞培养箱中培养。

2.1.3细胞传代

(1)从培养箱中取出细胞置于超净工作台，弃去旧的培养基，加入pbs溶液洗涤细胞后吸出。

(2)加入1ml胰蛋白酶液后放于培养箱中消化细胞，当从显微镜下看到细胞有部分变圆后立刻向培养皿中加入含血清的培养液终止消化。

(3)使用吸管将细胞轻轻吹打下来，加入至离心管中1000rpm，5min进行离心。

(4)弃去上清，加入适量完全培养基轻轻吹打细胞使其重悬，将细胞悬液分别加入到新的培养皿中，补加培养基，放入细胞培养箱中培养。

2.1.4细胞计数

(1)按2.1.3步骤将细胞消化后离心，重悬制成单细胞悬液。

(2)将待测细胞悬液吹打均匀，然后吸取少量液体沿盖玻片边缘缓缓滴入，保证盖玻片下充满悬液，且避免气泡存在。

(3)计数4个大方格内细胞数量。

(4)根据公式：细胞数目/ml＝(4个大方格的细胞数目之和/4)×10⁴。

2.1.5细胞冻存

(1)细胞冻存前一天对细胞进行换液。

(2)按照2.1.3中的方法将细胞消化后离心。

(3)弃去上清，加入预冷的细胞冻存液，使用移液器轻轻吹打细胞使其分散均匀。

(4)将细胞悬液分装到冻存管中，每管1ml。

(5)将冻存管进行梯度降温，具体步骤为4℃冰箱10min，-20℃冰箱30min，-80℃冰箱过夜，次日转入液氮罐中进行长期保存。

2.2黑素瘤细胞中cd44表达水平检测

2.2.1qrt-pcr法检测黑素瘤细胞中的cd44表达水平

查阅相关文献并利用pubmedprimer-blast系统进行引物设计和检测特异性，引物序列为：

gapdh上游引物5'–ggagcgagatccctccaaaat–3'

gapdh下游引物5'–ggctgttgtcatacttctcatgg–3'

cd44上游引物5'–gaagaaagccagtgcgtctc–3'

cd44下游引物5'–gtgctctgctgaggctgtaa–3'

以上序列由上海生工生物技术有限公司合成。

2.2.1.1细胞总rna提取：

(1)将处于对数生长期的hsf、mv3、m14、a375细胞培养皿置于冰上，弃去培养基，用pbs洗两次。加入1mltrnzol总rna提取试剂裂解5min，用枪头轻轻吹打后吸取液体至无核酶ep管中。

(2)加入0.2ml氯仿，颠倒混匀液体，静置5min。

(3)12,000rpm，4℃离心15min。

(4)吸取0.45ml上清至新的ep管中，加入等体积异丙醇，室温静置20min，

(5)12,000rpm，4℃离心10min，弃上清。

(6)向ep管中加入1ml的75％乙醇洗涤沉淀，静置1～2min，使之充分接触沉淀，充分溶解有机试剂。

(7)5,000rpm，4℃离心5min，倒出液体，将ep管再次放于离心机中瞬时离心，弃掉管壁残余液体。

(8)将ep管置于超净台中干燥3～5min，加入30～50ul的nuclease-free水，震荡充分溶解沉淀。

(9)使用超微量分光光度计测量样品在260/280nm的吸光度并计算rna浓度和纯度。

2.2.1.2逆转录反应：

(1)根据上步测定的rna浓度进行定量，取细胞总rna2μg，各实验组使用nuclease-free水进行配平。

(2)按照5×all-in-onertmastermix试剂盒操作步骤向管中加入2μl的accurtreactionmix(4×)，补nuclease-free水定容至8μl，室温放置5min。

(3)向管中加入2μl的accurtreactionstopper(5×)。

(4)冰上依次加入5×all-in-onertmastermix4μl，nuclease-free水6μl，使总反应体系为20μl。

(5)将反应体系轻轻混匀，于pcr仪上按照下列条件反应：25℃10min，42℃15min，85℃5min，取出pcr管置于-20℃冰箱保存。

2.2.1.3qpcr反应

(1)于冰上按照evagreen2×qpcrmastermix试剂盒说明配置qpcr反应体系：向管中分别加入10μl的evagreen2×qpcrmastermix，上下游引物各0.6μl，2μl的cdna，补nuclease-free水定容至20μl。

(2)实时荧光定量pcr仪上执行反应程序：95℃，10min，一个循环；95℃，15s，60℃，60s，共40个循环。

(3)按照2^－△△ct公式计算目标基因表达情况。

2.2.2免疫荧光法检测黑素瘤细胞中cd44的表达

(1)铺板：取处于对数生长期的hsf细胞和mv3细胞，胰酶消化后进行计数，以1×10⁵/ml接种于共聚焦显微镜专用细胞培养皿，每孔1.5ml，置37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h。

(2)固定：吸去多余培养基，使用恢复室温的pbs振荡洗涤三遍，加入4％多聚甲醛覆盖细胞，室温放置15min，使用pbs振荡洗涤三遍。

(3)通透：加入0.5％tritonx-100通透液覆盖细胞，室温静置30min，pbs振荡洗涤三次。

(4)封闭：加入0.5％bsa封闭液覆盖标本表面37℃封闭1h。

(5)一抗：cd44单克隆抗体用bsa以1:100稀释，覆盖标本表面，4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h，pbs洗三次。

(6)二抗：荧光二抗用bsa以1:200稀释，覆盖标本表面。37℃避光孵育50min，pbs避光振荡洗涤三次。

(7)核染：加入dapi溶液覆盖标本表面，室温避光静置5min，pbs避光振荡洗涤三次。

(8)镜检：使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察拍照。(alexafluor488：最大激发波长为495nm，最大发射波长为519nm；dapi和双链dna结合后：最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm)。

2.3cck-8法测定hcinp纳米粒对hsf细胞和mv3细胞的细胞毒性

(1)取处于对数生长期的hsf细胞和mv3细胞，胰酶消化并计数，配置成3×10⁴/ml的细胞悬液，将细胞接种于96孔板，每孔0.1ml，加药孔周边加pbs进行封边，放于培养箱中培养使细胞贴壁。

(2)吸出旧的培养基，分别加入含不同hcinp浓度(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)的细胞培养基，并设对照组，每组设5个平行孔，继续培养24h。

(3)每孔加入cck-8溶液10μl置于37℃培养箱中孵育2h。

(4)用酶标仪测定450nm波长处每孔的吸光度，记录实验结果。

2.4倒置荧光显微镜检测hsf细胞和mv3细胞对载药纳米粒的摄入

2.4.1按照第一部分合成纳米粒的方法将香豆素-6包载到纳米粒中制备具有荧光示踪功能的纳米粒，命名为f-hcinp。

2.4.2倒置荧光显微镜检测hsf细胞和mv3细胞对f-hcinp纳米粒的摄入

(1)分别取hsf细胞和mv3细胞按照前述方法进行消化、离心，加入培养基进行细胞重悬并计数，以2×10⁵个/孔的细胞密度接种于6孔板，放于培养箱中培养使细胞贴壁。

(2)分别加入含4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml浓度的f-hcinp纳米粒的培养基，并设对照组，每组设3个复孔，放入培养箱中继续培养6h。

(3)弃去培养基，用pbs洗涤三次，加入4％多聚甲醛覆盖细胞，室温放置15min，使用pbs振荡洗涤三次。

(4)加入dapi溶液覆盖细胞表面，室温避光静置5min，pbs避光洗涤三次。

(5)使用倒置荧光显微镜进行观察拍照。

2.5激光扫描共聚焦显微镜检测mv3细胞对f-hcinp纳米粒的摄入和细胞内定位

(1)取处于对数生长期的mv3细胞，胰酶消化后进行计数，配置成1×10⁵/ml的细胞悬液，将细胞接种于共聚焦显微镜专用细胞培养皿，每孔1.5ml，置37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养。

(2)待细胞贴壁后，弃去旧的培养基，加入含8μg/ml浓度的f-hcinp纳米粒的培养基，并设对照组，每组设3个复孔，放入培养箱中继续培养6h。

(3)弃去培养基，加入pbs洗涤三次，加入1ml含lyso-trackerred的细胞培养基，避光放置于37℃培养箱中孵育1h。

(4)吸出含染料的培养基，加入pbs轻轻洗涤三次。

(5)使用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照(lyso-trackerred染色液：最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm；香豆素-6：最大激发波长为466nm，最大发射光波长为504nm)。

2.6hcinp纳米粒在肿瘤细胞内产氧能力检测

(1)按前述方法消化mv3细胞，离心后重悬并对细胞进行计数，以2×10⁵个/孔的细胞密度接种于6孔板，置37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养。

(2)向细胞中加入含浓度为5μm的[ru(dpp)3]cl2的培养基预处理4h。

(3)弃去培养基，分别加入含4μg/ml、8μg/ml浓度的hcinp纳米粒的培养基，并设对照组，每组设3个复孔，放入培养箱中继续培养12h。

(4)弃去培养基，用pbs洗涤三次。

(5)使用倒置荧光显微镜进行观察拍照，并使用imagej软件对[ru(dpp)3]cl2的荧光强度进行定量分析。

2.7体外研究hcinp纳米粒介导的增强的pdt作用

(1)实验分组：a：ctr组，不加药物不照射nir激光；b：nir组，只照射nir激光(3w/cm²)；c：hcinp组，只加hcinp(8μg/ml)；d：ir820+nir组，加入ir820(8μg/ml)并照射nir激光(3w/cm²)；e：cinp+nir组，加入cinp(8μg/ml)并照射nir激光(3w/cm²)；f：hinp+nir组，加入hinp(8μg/ml)并照射nir激光(3w/cm²)；g：hcinp+nir组，加入hcinp(8μg/ml)同时辐照nir激光(3w/cm²)。

(2)按前述方法消化mv3细胞，离心后重悬并对细胞进行计数，以3×10⁴个/孔的细胞密度接种于24孔板，置于细胞培养箱中过夜贴壁。

(3)弃去旧的培养基，按照上述分组方法加入含相应药物的培养基，每组设置三个复孔，将孔板放入培养箱中继续培养12h。

(4)取出孔板，弃去培养基，使用pbs洗涤以除去未进细胞的药物。将孔板放置于激光器下照射，设置照射功率为3w/cm²，持续时间为5min。

(5)治疗完成后，向各孔中分别加入2μm钙黄绿素(calcein-am)和4μm碘化丙啶(pi)对细胞进行染色，将孔板放置于培养箱中孵育35min。

(6)倒置荧光显微镜进行拍照。

3结果

3.1cd44高表达黑素瘤细胞株的筛选

我们用qrt-pcr法筛选高表达cd44的黑素瘤细胞进行后续的体内外实验。使用人皮肤成纤维细胞hsf作为对照组，对3种常用的黑素瘤细胞mv3、m14、a375的cd44表达水平进行检测。实验结果显示，同hsf细胞相比，三种黑素瘤细胞中cd44的表达量都升高，差异有统计学意义(p<0.05)；其中mv3细胞中cd44的表达量最高(约4.2倍)(图9a)。

免疫荧光实验证明了mv3中cd44的表达量同hsf细胞比较明显上调，与qrt-pcr结果相一致，并且可以看出cd44主要分布于细胞膜上(图9b)。这些特点是其作为药物靶点的重要理论依据，故在后续的体内外实验中选用mv3细胞作为研究对象。

3.2hcinp纳米粒的细胞毒性测定

为了验证hcinp纳米粒的生物相容性，我们配制了一系列浓度的纳米粒溶液分别处理hsf细胞和mv3细胞，继续培养24h，加入cck-8溶液进行检测。实验结果显示，当hcinp的浓度低于8μg/ml时，hcinp纳米粒对hsf细胞和mv3细胞无明显细胞毒性。在较高浓度时细胞活力有轻微下降，当hcinp的溶度达到16μg/ml时，hsf细胞和mv3细胞的细胞活力分别为90.5％(图10a)和91.3％(图10b)。两种细胞的细胞活力下降趋势相似，但细胞活力仍在90％以上。为了避免这一因素干扰，我们在后续的实验当中选择8μg/ml作为实验浓度。

3.3肿瘤细胞对纳米载药系统的摄入

为了方便研究肿瘤细胞对纳米粒的摄入和后续的细胞内定位，我们使用香豆素-6对纳米粒进行标记，合成了f-hcinp纳米粒。将纳米粒暴露于肿瘤细胞一段时间后，dapi对细胞核进行染色，并使用倒置荧光显微镜和流式细胞仪对细胞荧光进行检测。实验结果显示，mv3细胞对f-hcinp纳米粒的摄入明显，且随着浓度增加其摄入量增加，具有浓度依赖性(图11)。

3.4肿瘤细胞对载药纳米粒的靶向摄入作用研究

使用相同浓度的f-hcinp纳米粒分别处理hsf细胞和mv3细胞一定时间后，倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测两种细胞对纳米粒的摄入量。实验结果显示，hsf细胞中的绿色荧光较暗，表明纳米粒摄入较少；而mv3细胞中有明亮的绿色荧光，说明mv3细胞能够大量摄入纳米粒(图12)。因此我们合成的载药纳米粒具有良好的肿瘤靶向摄入作用。

3.5激光扫描共聚焦显微镜检测纳米粒的摄入和细胞内定位

激光扫描共聚焦显微镜照片显示(图13)，不经过纳米粒处理的细胞(ctr组)中无绿色荧光，而加入f-hcinp纳米粒处理一段时间后，细胞内可见明亮的绿色荧光，主要分布于细胞核周围的细胞质中，表明mv3细胞能够大量摄入纳米粒，该结果同倒置荧光显微镜和流式细胞仪实验的结果一致。为了研究纳米粒在细胞内的定位，我们使用er-trackerred对溶酶体进行染色，显微镜下呈红色，merge照片可见绿色的f-hcinp纳米粒和红色的溶酶体能够很好的重合(黄色)，该结果表明纳米粒进入了溶酶体。

3.6hcinp纳米粒在肿瘤细胞内产氧能力检测

[ru(dpp)3]cl2是一种溶解氧检测指示剂，其荧光可被氧分子猝灭，导致荧光强度降低。用hcinp纳米粒处理mv3细胞12h，然后通过倒置荧光显微镜观察并拍照。实验结果表明，对照组(ctr组)细胞显示出明亮的红色荧光，而加入hcinp纳米粒处理过的细胞的荧光强度明显减弱，其荧光强度随着纳米粒子浓度的增加而降低(p<0.05)(图14a、b)。这些结果表明细胞中存在的h2o2可以渗透进入hcinp纳米粒中，进而被纳米粒内部的cat催化产生氧气。

3.7hcinp纳米粒介导的增强的pdt作用

将各组药物加入到培养基中处理肿瘤细胞12h，照射808nm激光，然后使用calcein-am/pi对治疗后的细胞进行染色，活细胞被染成绿色，而死细胞被染成红色。实验结果显示，ctr组、nir组和hcinp组无明显细胞死亡，细胞形态正常，表明纳米粒的生物相容性良好，同cck-8实验结果相一致。ir820在nir激光照射后会引起部分细胞死亡，大部分细胞仍然存活。cinp+nir组和hinp+nir组的细胞死亡数进一步增加，但仍有部分细胞残存，残存细胞形态发生改变。hcinp+nir组可见照射区域细胞几乎全部死亡，具有强的肿瘤杀伤作用(图15)。

实施例3：靶向自产氧纳米粒hcinp在荷瘤小鼠体内抗肿瘤作用研究

1材料

balb/c-nu雌性裸鼠，6～8周龄，体重约19～21g，购于徐州医科大学动物中心。裸鼠饲养于徐州医科大学spf级屏障系统中。饲料和饮水由动物房经灭菌处理后供动物自由饮食。

2方法

2.1建立荷瘤小鼠模型

取对数生长期mv3细胞消化离心后收集，用pbs洗3次，配成4×10⁷/ml的混合液，取100μl接种于balb/c裸鼠右后肢。spf环境中饲养三周，建立荷瘤小鼠模型。

2.2注射药物并取材固定、切片、染色

待肿瘤长至200～400cm³后将裸鼠随机分成3组分别为对照组(ctr)、hinp组和hcinp组，每组3只。进行尾静脉注射药物：ctr组注射100μl生理盐水；hinp组和hcinp组分别按1mg/kg注射相应药物。注射药物24h后处死小鼠，剥离肿瘤，使用10％的中性甲醛溶液固定48h，石蜡切片，免疫组化染色，置显微镜观察并拍照。

2.3移植瘤模型研究hcinp纳米粒介导的增强的pdt作用

(1)实验分组：ⅰ：normal(不接肿瘤)，ⅱ：control(ctr)，ⅲ：nir，ⅳ：hcinp，ⅴ：ir820+nir，ⅵ：cinp+nir，ⅶ：hinp+nir，ⅷ：hcinp+nir

(2)待肿瘤长至200～400cm³后将裸鼠随机分成7组(ⅱ～ⅷ组)，每组5只。

(3)进行尾静脉注射药物：control组和nir组注射100μl生理盐水；ir820组每只注射1mg/kgir820；其余各组注射含1mg/kgir820的各组纳米粒。

(4)注射药物后24h用水合氯醛进行腹腔注射麻醉，用808nm激光器进行肿瘤部位照射处理，3w/cm²，5min。

(5)记录肿瘤生长情况，每两天称量小鼠体重和测量肿瘤体积，自给药开始连续观测14天。体积由以下公式得到：

v(mm³)＝(d²×d)/2。

其中d和d分别为肿瘤的短径和长径，单位为mm。

2.4组织病理学和血生化检测

2.4.1组织病理学检测

治疗14d后处死小鼠，解剖出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，浸泡于10％的中性甲醛固定液中固定48h。石蜡切片，he染色，正置显微镜观察并拍照。

2.4.2血生化检测

小鼠处死前进行眼球取血，4,000rpm离心6min。样品送徐州医科大学附属医院检验科进行血生化检测，检测指标包括谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、总胆红素(tbil)、尿素氮(bun)、肌酐(crea)、尿酸(ua)。

3结果

3.1hcinp纳米粒改善肿瘤组织缺氧

hif-1α的表达水平受到肿瘤组织氧含量的调节，通过检测肿瘤组织中hif-1α的表达量可以反应肿瘤微环境的缺氧情况。免疫组化实验结果显示，ctr组和hinp组的肿瘤组织中hif-1α呈高表达状态，定量分析平均阳性面积分别为1522和1503，两者之间无明显差异；而hcinp组hif-1α的平均阳性面积为1092，同ctr组和hinp组相比，其表达量显著下调(图16)。该结果表明hcinp纳米粒能够在肿瘤组织中发挥自产氧作用，改善肿瘤组织缺氧。

3.2载药纳米粒介导的增强的pdt作用

通过比较不同组小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量来评估pdt疗效。肿瘤生长曲线显示，对照组和hcinp组中的肿瘤体积随时间延长快速增加。nir组肿瘤生长速度略有减慢，但仍呈现快速增长趋势。ir820+nir组肿瘤生长受到抑制，表明游离ir820在nir照射下能部分抑制肿瘤生长，但由于pdt效果有限，肿瘤生长迅速。cinp+nir组和hinp+nir组肿瘤生长速度明显慢于ir820+nir组。hcinp+nir组小鼠的肿瘤在第14天几乎完全消失(图17a)。治疗结束后对各组小鼠的肿瘤进行剥离后称重，结果显示各组肿瘤之间存在差异，同肿瘤生长曲线结果一致(图17b)。

3.3hcinp纳米粒治疗的系统安全性检测

为了评估hcinp纳米系统治疗的生物安全性，我们进一步对治疗期间小鼠体重变化以及治疗结束后血生化水平和主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的组织病理学进行研究。实验结果显示，治疗过程中所有治疗组中小鼠的体重未出现明显下降。与同normal组(未接种肿瘤)相比，在hcinp+nir治疗14天后心、肝、脾、肺、肾的病理切片中没有显示出明显的病理学变化(图18)。此外，血生化检查结果显示谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、总胆红素(tbil)、尿素氮(bun)、肌酐(crea)、尿酸(ua)的值同normal组相比无显著差异，说明治疗后无明显的系统毒性(表1)。这些结果表明hcinp纳米粒介导的pdt治疗具有良好的生物安全性和潜在的临床应用价值。

表1normal组和hcinp+nir治疗组血生化结果

实施例1和实施例2已经对hcinp纳米粒的性质和功能进行了初步探索，实施例3进一步使用动物荷瘤模型来研究hcinp在体内介导的抗肿瘤作用，并对其治疗后是否具有系统毒性进行探究。首先我们对载药纳米粒是否能够改善肿瘤局部缺氧状态进行检测。hif-1是一种机体内普遍存在的受氧气水平调控的核蛋白，由hif-1α亚单位和hif-1β亚单位构成，参与肿瘤细胞增殖、转移、免疫、耐药以及肿瘤血管生成。因此，hif-1是一个颇有潜力的癌症治疗靶点，研究发现抑制hif-1的表达能够抑制肿瘤的发生和发展，并能发挥增敏化疗、pdt治疗的作用。其中，hif-1α的表达水平受到肿瘤组织缺氧调节，其机制为：在常氧状态下，表达的hif-1α很快被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，而在缺氧条件下，该降解通路受阻,hif-1α能够稳定存在；后者进入细胞核与hif-1β亚基聚合形成完整的异二聚体hif-1，进而发挥转录因子的作用。肿瘤组织的hif-1α免疫组化结果显示，ctr组和hinp组的hif-1α呈高表达状态，两者之间无显著差异，而hcinp组hif-1α的表达下调，该结果表明将hcinp纳米粒经尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，hcinp能够靶向进入肿瘤组织，催化肿瘤局部的h2o2产生氧气并释放，提高肿瘤微环境中的氧浓度，改善肿瘤组织乏氧状态。

肿瘤组织中增加的氧气为pdt治疗提供丰富的底物，产生更多的单线态氧，从而增加pdt的抗肿瘤作用。动物实验结果显示，对照组和hcinp组中的肿瘤体积增加迅速，表明单独应用hcinp对肿瘤生长没有影响。nir组肿瘤生长速度略有减慢，这可能是由于激光刺激所致，但整体仍呈现快速增长趋势。ir820+nir组肿瘤生长受到抑制，表明游离ir820在nir激光照射下能发挥光动力治疗作用部分抑制肿瘤生长，但由于ir820缺乏靶向性，最终进入肿瘤细胞的药物浓度有限，故pdt效果欠佳，随后肿瘤又迅速生长。cinp可以通过被动靶向作用将ir820递送到肿瘤局部，且cat的存在能够增加局部氧浓度，进而提高单线态氧的产量，故其抑瘤效果强于游离的ir820，但由于其作用并不能完全杀灭肿瘤细胞，因此后期肿瘤又出现生长的趋势。而hinp纳米粒则可以通过主动靶向和被动靶向作用进入肿瘤细胞，提高肿瘤内药物浓度，具有较强的抗肿瘤作用，但由于缺失cat的作用因而也不能完全杀灭肿瘤细胞，后期表现出同cinp+nir组相似的趋势。hcinp+nir的肿瘤在第14天几乎完全消失，这归因于药物在肿瘤局部积累的主动和被动肿瘤靶向以及自产氧作用引起的单线态氧的有效产生。小鼠体重监测、血生化以及主要组织器官病理学分析显示hcinp+nir治疗后无明显的系统毒性。这些证据表明应用hcinp药物递送系统是一种安全有效的抗肿瘤策略。