本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种美白保湿护肤品。
背景技术：
1998年，andrewz.fire和craigc.mello共同发现了体内rna干扰的作用机制，并于2006年共同获得了诺贝尔生理医学奖。从而为抵抗病毒、癌症等严重疾病的新一代药物(rna干扰类药物)的研发开启了一扇大门。此rna干扰类药物具有作用方式新颖、作用机制明确、靶向性强和副作用小等优点。rna干扰(rnainterference，rnai)是由双链rna(double-strandedrna，dsrna)分子在mrna水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。rna干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(genesilencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，ptgs)。最早有关rna干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的rna干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了rna干扰现象。1999年，hamilton和baulcombe在发生rna干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的rna片段，这些rna片断被证明是rna干扰所必需的，被称为小分子干扰核酸(sirna)。双链sirna与细胞源性的相关酶和蛋白质形成rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,risc)。在rna干扰过程中，双链sirna中的正义链被排除出复合体，反义链指导risc结合到靶mrna的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶iii降解靶mrna，从而关闭靶基因的表达。
决定肤色主要有三个因素：1.皮肤中黑色素、胡萝卜素等色素含量；2.皮肤厚度及光线在皮肤表面的散射现象；3.皮肤真皮层血管中血液内氧和血红蛋白以及还原血红蛋白的含量。其中起主要作用的是黑色素，因此美白的途径主要从黑色素方面入手。
黑色素形成的生理生化过程可概括为：黑色素由位于表皮基底层的黑色素细胞产生，黑色素细胞约占基底细胞的10％，每个黑色素细胞借助树枝状突起伸向邻近的基底细胞和棘层细胞，输送黑色素颗粒。转移至角质细胞的黑色素颗粒随表皮细胞上行至角质层，从而影响皮肤的颜色并形成色斑，最终随角质层脱落而排泄。黑色素的产生则是从酪氨酸开始。酪氨酸在黑色素细胞内通过酪氨酸酶及多种氧化酶的催化生成黑色素。想要美白只需阻断黑色素生成或转移便可达到效果，因此各种美白成分大多数均是通过抑制、阻断或影响黑色素从而达到美白效果。
酶是一种生物催化剂，抑制住黑色素在细胞内生成过程中各个环节所必需的酶，就够能阻碍黑色素生成从而有效减少黑色素的数量。目前大多数美白成分均以黑色素合成反应前两步中的酪氨酸酶为靶点，抑制其活性而达到美白效果。熊果苷是常用的酪氨酸酶抑制剂。熊果苷主要萃取自熊果(bearberry)的叶子，一些水果和其它植物中也可以发现熊果苷的存在。它能迅速渗入肌肤，在不影响细胞增殖浓度的同时有效地抑制皮肤中酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的形成，并通过自身与酪氨酸酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和斑，而且对黑色素细胞不产生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同时还有杀菌、消炎的作用。
p基因也叫oca2基因，负责合成p蛋白。p蛋白是ilokda的跨膜蛋白，由838个氨基酸残基构成，位于黑色素小体膜上，与黑色素小体膜的完整性有夫，是产生黑素小体所必需的蛋白。另有研究结果表明，p基因编码的蛋白与一些參与阴离子转运的膜转运蛋白具有显著同源性，它作为一种膜通道蛋白可减少黑素小体内质子的浓度，參与黑色素小体内ph值的调节，使局部环境呈中性，这有利于维护高分子酪氨酸-tyrp1-tyrp2复合体的稳定性，增强酪氨酸酶活性，增加黑色素的生成及沉积。因此抑制p基因可以减少黑色素的生成。
皮肤是最大、最易侵入的器官，经皮给药具有易操作、损伤小等优点，避免了胃肠道和肝脏的消化和降解作用。透过皮肤抑制p基因(oca2基因)表达有可能成为皮肤美白的有效途径。
目前，市场是用于美容、护肤的产品很多，主要包括抗衰老、美颜、美白等产品。这些产品对于受环境变化以及工业污染影响所引起的皮肤衰老、皮质老化、颜色变暗、无光泽等具有改善作用。然而，这些制品中大部分都是化学制剂，水溶性较差，因此需要大量或长期使用，才能真正有效地达到美白抗衰老效果，并且由于是化学制剂，大量或长期使用势必会带来较大的副作用，价格也昂贵，难以达到标本兼治的目标。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种含有针对p基因(oca2基因)的小干扰核酸分子的护肤品来实现皮肤美白的解决方案。
本发明提供的美白保湿护肤品，包括溶媒、透皮肽(在本发明中也称透皮十肽-4)和针对p基因的小干扰核酸(p基因sirna)，其中溶媒由下述原料制备而成：水、甘油、凝血酸、谷胱甘肽、丁二醇、牛磺酸、甲氧基水杨酸钾、甘油辛酸酯、辛酰羟肟酸、对羟基苯乙酮、肌肽、产碱杆菌多糖类、甘草酸二钾、透明质酸钠、苯氧乙醇；溶媒、透皮十肽-4和p基因sirna的比例为1g溶媒：0.1-0.5mg透皮十肽-4：10-50ngp基因sirna。具体地，1g溶媒包含下述原料：
0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠和0.002克苯氧乙醇。。
在另外一种实施方案中，本发明提供的美白保湿护肤品还可以包括熊果苷，浓度为2-5％。
本发明还提供了美白保湿护肤品的制备方法，将制备溶媒的原料按如下配方加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌：0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠和0.002克苯氧乙醇，搅拌二十分钟后加入透皮十肽-4和p基因sirna，三者的比例为1g溶媒：0.1-0.5mg透皮十肽-4：10-50ngp基因sirna，再继续搅拌十分钟。
本发明提供的另外一种美白保湿护肤品的制备方法，将上述制备溶媒的原料按如下配方加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌：0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠和0.002克苯氧乙醇，搅拌二十分钟后加入透皮十肽-4、p基因sirna和熊果苷，四者的比例为1g溶媒：0.1-0.5mg透皮十肽-4：10-50ngp基因sirna：2-5％的熊果苷，再继续搅拌十分钟。
本发明中制备溶媒所用的原料均采购自广州元基生物科技有限公司，产品目录号如下：
其中的透明质酸吸水能力非常强,亲和吸附的水分约为本身质量的500-1000倍,是公认的天然保湿因子。
透皮十肽-4的序列如中国授权专利cn106084006b所示，由自广州元基生物科技有限公司合成。
本发明所用的熊果苷，cas号：497-76-7，采购自广州元基生物科技有限公司
p基因sirna由广州市锐博生物科技有限公司合成。
本发明美白保湿护肤品，美白护肤品效果显著，可增强皮肤的锁水能力，降低皮肤黑色素含量，具有美白保湿的功效。
本发明的有益效果
本发明提供的美白保湿护肤品，能够高效、特异地抑制皮肤中p基因的表达，降低黑色素的生成，增强皮肤的锁水能力，同时具有较低的毒副作用，可长期使用并达到标本兼治的目标。
具体实施方式
本发明设计了针对p基因的sirna，可以针对性的降低乃至沉默p基因的表达，进而降低皮肤中黑色素的含量，从而起到皮肤美白的效果。
本发明实施例公开了一种设计、获得针对p基因的小干扰核酸分子的方法以及应用这些小干扰分子制备美白保湿护肤品的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数和辅料/原料组分实现，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的小干扰核酸及护肤品组合物已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
本发明基于seqidno.1-4所示的p基因(nc_000015.10，geneid:4948)序列设计、筛选活性小干扰rna(sirna)序列。
p-sirna1：正义链5’-gaucuucacaaacauuggadtdt-3’seqidno.1
反义链5’-uccaauguuugugaagaucdtdt-3’seqidno.2
p-sirna2：正义链5’-gagcgaagauaccugcuaadtdt-3’seqidno.3
反义链5’-uuagcagguaucuucgcucdtdt-3’seqidno.4
p-sirna3：正义链5’-gcggaggugcggaccuuaadtdt-3’seqidno.5
反义链5’-uuaagguccgcaccuccgcdtdt-3’seqidno.6
p-sirna4：正义链5’-ccuggagaaagaucugcaadtdt-3’seqidno.7
反义链5’-uugcagaucuuucuccaggdtdt-3’seqidno.8
p基因核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如下：
(1)寡聚核糖核苷酸的合成：寡聚核糖核苷酸的合成是在自动dna/rna合成仪上进行。由于小干扰核酸是由一段19个寡聚核糖核苷酸和2个脱氧胸苷酸组成。因此，起始物为固相连接的5’-0_对二甲氧基-胸苷，具体的每一个循环合成可分为四步来完成，第一步是将与固定连接的胸苷上5’位的保护基在三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂s-乙基四唑的作用下，将5’-0-对二甲氧基三苯甲基_胸苷亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯，偶合时间偶合次数均按仪器厂家提供的程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05m碘水作用下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如，羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，从而达到封闭的作用，以减少整体副产物的产生，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脱保护：将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密封的小瓶中，并加入1毫升的乙醇/胺(体积比为1：3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出溶液，并将固相再次用双蒸水淋洗，收集洗脱液，并干燥去除溶剂。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(im)，室温放置4-12小时，再经过乙醇沉淀，得到小干扰核酸的粗产物。
(3)纯化分离：将小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升的乙酸铵水溶液中，然后经过反应c18高压液相色谱的分离，运用梯度淋洗的方法，收集小干扰核酸主产物(淋洗液a:0.im乙酸铵；淋洗液b:20％的0.im乙酸铵和80％的乙腈)，除去主产物中的溶剂，并加入5毫升80％的乙酸水溶液，在室温静置15分钟，然后将此溶液进行阴离子交换的分离(deae-5pw，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90％以上的小干扰核酸(梯度淋洗，淋洗液a：0.025m的tris-hcl,0.025m的nacl，ph＝8，5％的乙腈；淋洗液b：0.025m的tris-hcl，2.om的nacl，ph＝8，5％的乙腈)。
(4)脱盐：纯化的小干扰核酸经过透析，除去盐份，随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退火处理形成稳定的双链小干扰核酸，其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核苷酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(iommtris,ph＝7.5-8.0,50mmnacl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以备随时使用。
实施例1
将制备溶媒的原料按如下配方加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌：0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠和0.002克苯氧乙醇，搅拌20分钟后加入透皮十肽-4和p-sirna1，三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：10ngp-sirna1，再继续搅拌10分钟得到实施例1的美白保湿护肤品。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：25ngp-sirna1，得到实施例2的美白保湿护肤品。
实施例3
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：50ngp-sirna1，得到实施例3的美白保湿护肤品。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：10ngp-sirna1，得到实施例4的美白保湿护肤品。
实施例5
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：25ngp-sirna1，得到实施例5的美白保湿护肤品。
实施例6
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：50ngp-sirna1，得到实施例6的美白保湿护肤品。
实施例7
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：将p-sirna1换成熊果苷，三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：2％熊果苷，得到实施例7的美白保湿护肤品。
实施例8
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：将p-sirna1换成熊果苷，三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：5％熊果苷，得到实施例8的美白保湿护肤品。
实施例9
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：将p-sirna1换成熊果苷，三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：2％熊果苷，得到实施例9的美白保湿护肤品。
实施例10
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：将p-sirna1换成熊果苷，三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：5％熊果苷，得到实施例10的美白保湿护肤品。
实施例11
将制备溶媒的原料按如下配方加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌：0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠和0.002克苯氧乙醇，搅拌20分钟后加入透皮十肽-4，p-sirna1和熊果苷，四者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：10ngp-sirna1：2％熊果苷，得到实施例11的美白保湿护肤品。
实施例12
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：10ngp-sirna1：5％熊果苷，得到实施例12的美白保湿护肤品。
实施例13
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：25ngp-sirna1：2％熊果苷，得到实施例13的美白保湿护肤品。
实施例14
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：25ngp-sirna1：5％熊果苷，得到实施例14的美白保湿护肤品。
实施例15
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：50ngp-sirna1：2％熊果苷，得到实施例15的美白保湿护肤品。
实施例16
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：50ngp-sirna1：5％熊果苷，得到实施例16的美白保湿护肤品。
实施例17
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：10ngp-sirna1：2％熊果苷，得到实施例17的美白保湿护肤品。
实施例18
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：10ngp-sirna1：5％熊果苷，得到实施例18的美白保湿护肤品。
实施例19
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：25ngp-sirna1：2％熊果苷，得到实施例19的美白保湿护肤品。
实施例20
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：25ngp-sirna1：5％熊果苷，得到实施例20的美白保湿护肤品。
实施例21
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：50ngp-sirna1：2％熊果苷，得到实施例21的美白保湿护肤品。
实施例22
与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：50ngp-sirna1：5％熊果苷，得到实施例22的美白保湿护肤品。
实施例23
与实施例22基本相同，区别仅仅在于将p-sirna1替换成p-sirna2，得到实施例23的美白保湿护肤品。
实施例24
与实施例22基本相同，区别仅仅在于将p-sirna1替换成p-sirna3，得到实施例24的美白保湿护肤品。
实施例25
与实施例22基本相同，区别仅仅在于将p-sirna1替换成p-sirna4，得到实施例25的美白保湿护肤品。
实施例26小鼠皮肤的黑色素抑制实验
上述所示的实施例得到美白保湿护肤品1-25，仅含溶媒的对照组别为26。将130只成年雌性c57bl/6小鼠安置在环境控制的动物护理实验室中，使用标准的小鼠饮食。用剪刀仔细修剪腹部1cm×1cm区域的毛发(不使用任何有明显皮肤损伤迹象的小鼠)。选择小鼠并将其随机分为不同的组，每组5只。每天一次将各组别护肤品涂抹在腹部剔除毛发的区域。应用上述配方7天后，处死小鼠，将皮肤切成薄片以测量黑色素抑制活性。为了提取黑色素，在80℃下将皮肤组织块的细胞悬液与等体积的含有10％二甲基亚砜和1nnaoh的混合物一起摇动60分钟。在2,000rpm下离心10分钟后，使用spectroquestreader在475nm处测定od值，od值越高，表明黑色素生成越多。
表1各组别抑制黑色素的效果
根据上表所示的数据，在仅有护肤品溶媒的情况下，od值最高，说明皮肤中含有的黑色素最多；而在使用本发明提供的护肤品后7天，小鼠皮肤中的黑色素明显降低，组合22即1g溶媒，0.5mg透皮肽，50ngp基因sirnano.1，5％熊果苷对黑色素的抑制效果最好。
实施例27肌肤的保湿效果测试
皮肤角质层水合率试验：工作原理是以电容器为仪器探头，由于水是皮肤上介质常数最大的物质，当皮肤水分含量发生变化时，皮肤的电容值也发生变化，所以可以通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面水分含量。常用的仪器是corneometercm825。
实验方法：在应试者左右前臂屈侧划出3×3cm2大小的正方形实验区域，以左臂作为保湿品的测试区域，均匀涂抹本发明实施例1-25制备的美白保湿护肤品1ml(仅含溶媒的对照组别为26)，右臂相应的对称区域为空白对照，然后用corneometercm825测试每个试验部位的水分含量，分别重复5次，得出平均值；仅含溶媒的组别为26。用下列公式计算水合率。
水合率＝(测试值-空白值)/空白值×100％
表2保湿效果测试结果
从上表所示，与溶媒组相比，本发明所提供的护肤品保湿时间长，效果好，尤其以实施例21和22的保湿效果最好。
综上所述，本发明所提供的护肤品，均具有美白和保湿效果。综合抑制黑色素和保湿效果，实施例22即1g溶媒，0.5mg透皮肽，50ngp基因sirnano.1，5％熊果苷效果最好。
序列表
<110>深圳市百吉因生物科技有限公司
<120>一种美白保湿护肤品
<130>szjhbl2020002cn
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
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