一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统及其制备方法和应用与流程
本发明属于药物技术领域，涉及肿瘤靶向药物递送系统，尤其是一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统及其制备方法和应用。
背景技术：
根据国际癌症研究机构(iarc)最新统计数据，2018年，全球1810万肿瘤新发病例，960万死亡病例，而我国肿瘤发病率、死亡率均为世界之首。在肿瘤化疗中，抗癌药物的靶向效率不高，全身毒副作用强是最突出的问题，甚至是三分之一病人死亡的直接或间接原因，因而需充分利用肿瘤和正常组织之间的差异，进行肿瘤特异性治疗，降低对正常组织的毒性。
脂质体(liposome)是由人工制备的磷脂双分子层闭合囊泡，粒径在60～200nm之间，其能够利用肿瘤组织高渗透滞留效应(epr效应)，即肿瘤被动靶向作用，改善药物的体内分布，提高药物在肿瘤部位的富集量，降低全身毒副作用。目前为止，已有多个脂质体制剂在国内外上市，并在临床应用中得到肯定，如阿霉素脂质体
外泌体(exosome)是指由细胞分泌具有生物活性的囊泡，其直径一般为30～150nm，含有母体细胞中的多种生物分子。已有研究表明外泌体在人体生理病理过程中发挥着重要作用，参与血管再生、细胞迁移、免疫应答及肿瘤的发生发展等过程，承担着细胞之间分子递送、信息交流的任务。因其性质尚具有很多未知性，外泌体成为近年来生命科学领域的国际研究热点。外泌体作为内源性囊泡，具有天然的分子转运特性和良好的生物相容性,已有研究表明其可用于递送化学药物(如阿霉素、吉西他滨、卡铂、5-氟尿嘧啶等)、蛋白质、肽配基和rna等多种药物。外泌体的药物递送应用也存在一定的技术难题。目前，外泌体通过转染母细胞包载rna类药物的技术较为成熟，然而，对于细胞毒性药物来说，将高浓度的药物与母细胞一起培养，对于母细胞具有杀伤作用，显著影响含药外泌体的分泌；直接将药物载入外泌体常用电穿孔法，往往会对外泌体膜或药物的完整性造成影响。对于细胞毒性药物的载药能力低，是外泌体作为肿瘤药物递送系统研究亟待解决的瓶颈问题。
如何利用脂质体和外泌体的优势，而克服各自的局限性？研究发现，在特定条件下构成膜结构的磷脂分子能够发生重排，实现囊泡间的杂化融合。脂质体与外泌体均为磷脂双分子层膜闭合囊泡，且粒径范围相近，yukot.sato等将raw264.7细胞外泌体、高表达her2受体的cms7外泌体与peg链修饰的脂质体通过冻融循环进行杂化融合，成功制备杂化载体，并进行了细胞摄取能力评价。这一研究说明利用脂质体和外泌体形成杂化载体在技术上是可行的，然而，该研究尚未涉及杂化载体对于抗肿瘤药物的包载和靶向递送，所选用的外泌体种类亦不具有肿瘤趋向性。
不同细胞分泌的外泌体具有不同的功能特性。间充质干细胞是一类存在于成体，含多项分化潜能的非造血干细胞，其表面表达有cd105、cd73、cd44、mhc类分子等，具有免疫原性低、肿瘤趋向性及实体瘤穿透能力强等特点。间充质干细胞来源的外泌体同样具有间充质干细胞的某些特性，如能够避免与调理素蛋白、抗体、凝血因子等产生相互作用,从而逃避网状内皮系统的吞噬，延长体内循环时间，还可趋近聚集于肿瘤的原发和转移部位。目前尚无间充质干细胞来源外泌体的肿瘤趋向性机制研究，也无利用其肿瘤趋向性靶向递送抗肿瘤药物的研究。
肿瘤治疗的预后差，绝大多数是因为肿瘤耐药性导致。多药联合应用在癌症治疗领域占据越来越重要的地位，如不同作用靶点的药物联用，不同作用机制的药物联用等。自2014年fda批准了达拉菲尼(dabrafenib，braf抑制剂)和曲美替尼(trametinib，mek抑制剂)组合治疗brafv600突变阳性的黑色素瘤，联合用药成为癌症治疗的发展趋势。2016年美国临床肿瘤学会报道这种组合疗法对brafv600e突变的nsclc也呈现很强的临床疗效，这种从抗癌药物中寻找潜在的组合方式成为癌症研究之一，如两种化疗药5-azacytidine(dnmt1抑制剂)和butyrate(hdac抑制剂)组合能有效靶向乳腺癌干细胞。
通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的公开文献：
cn107913408a公开了一种外泌体-核酸适配体脂质体复合载药系统及其制备方法和应用；cn107980004a公开了用于医治疾病的外泌体的用途。期刊文献：meilu,etal.comparisonofexosome-mimickingliposomeswithconventionalliposomesforintracellulardeliveryofsirna.internationaljournalofpharmaceutics,2018(550):100-113.公开了制备模拟外泌体的脂质体将vegfsirna递送至上皮细胞，可提高转染效率。masatonishio,etal.real-timeassayforexosomemembranefusionwithanartificiallipidmembranebasedonenhancementofgramicidinachannelconductance.biosensorsandbioelectronics,2020(150):11918.公开了一种基于gramicidina通道电导增强的人工脂膜与外体膜融合的实时检测技术。
通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统及其制备方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统，所述药物递送系统由间充质干细胞外泌体和脂质体通过杂化融合构建而成。
而且，所述间充质干细胞外泌体来源于动物的骨髓间充质干细胞、骨骼肌间充质干细胞、骨外膜间充质干细胞、骨小梁间充质干细胞、脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。
而且，所述脂质体为由胆固醇类成分、磷脂材料组成的磷脂双分子层闭合囊泡；
其中，所述胆固醇类成分选自胆固醇或其衍生物；
所述磷脂材料选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、1-硬脂酰-溶血磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、培化磷脂酰乙醇胺、二芥酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺中的一种或两种以上混合物。
而且，所述杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统呈囊泡状，其粒径分布中，中位径在60～200nm；
或者，所述多重载药杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统能够包含几种脂溶性药物，或脂溶性药物组合水溶性药物，或几种水溶性药物。
一种如上所述的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统的制备方法，步骤如下：
s1将胆固醇类成分和磷脂材料按照重量比5-20：80-95溶解于有机溶剂中，再加入脂溶性抗肿瘤药物，水浴35-55℃，使胆固醇类成分和磷脂材料均匀溶解；
s2水浴条件下，旋转抽真空，除去有机溶剂，使容器内壁上形成蜂窝状薄膜，置于真空干燥箱放置8-12h；
s3取步骤s2得到的薄膜，加入溶解有水溶性抗肿瘤药物的ph缓冲溶液，水浴40-60℃，旋转，使薄膜全部溶解；
s4超声或均质，制备中位径在60～200nm的载药脂质体；
s5利用载体内外ph梯度变化的制备技术，在步骤s4所得载药脂质体的基础上继续加载具有强酸弱碱盐特性或强碱弱酸盐特性的水溶性药物，制备多重载药脂质体；
s6培养间充质干细胞，收集培养过程中剩余的液体培养基，将其进行离心操作后得外泌体沉淀，配制外泌体储备液；
s7将步骤s6所得外泌体储备液与步骤s5所得载药脂质体混合，反复冻融若干次，即得杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统。
而且，所述步骤s5中载体内外ph梯度变化的制备技术为：针对强酸弱碱盐，需要调节脂质体内水相ph2.5-4.0，外水相ph至6.0-8.5；
针对强碱弱酸盐，需要调节脂质体内水相ph8.5-10.5，外水相ph至5.5-8.0。
而且，所述步骤s6具体为：
取间充质干细胞到细胞培养瓶中，加入含有质量浓度10-20％胎牛血清的dmem/f12培养基，于恒温培养箱内培养；弃去未贴壁细胞；原代培养5-15天，进行首次传代，观察贴壁间充质干细胞生长达到70-90％时，进行再次传代培养；取第3-6代的骨髓间充质干细胞，收集细胞上清，分装于离心管中，200-500×g离心1-30min，取上清液，1000-3000×g离心1-30min，取上清液，8000-12000×g离心20-40min，取上清液，8000-12000×g离心60-80min，得外泌体沉淀，用10～50倍体积的pbs溶液清洗重悬，得外泌体储备液。
而且，所述步骤s7具体为：
将外泌体储备液与1-10倍体积的多重载药脂质体于室温混合，30-40℃搅拌孵育10-30min，置于液氮冷冻5-10min，室温解冻，于30-40℃搅拌孵育15-30min，再置于液氮冷冻5-10min，进行多个冻融循环，使外泌体膜与脂质体膜充分融合杂化，制得多重载药的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统。
如上所述的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统在药物制备方面中的应用。
而且，所述应用为：所述药物递送系统能够包载并递送抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞内酶活性的药物、抑制微管蛋白形成的药物、抑制dna形成或rna形成的药物、导致肿瘤组织缺氧的药物、导致肿瘤组织中产生氧自由基的药物中的两种或多种。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明系统兼具肿瘤被动靶向性和主动靶向性，肿瘤靶向效率显著提高，全身毒副作用降低，能够应用在药物制备方面中，特别是抗癌药物中。
2、本发明系统同时包载和递送多种不同靶点或机制的抗肿瘤药物，很好地抑制肿瘤耐药性，提高患者预后。
3、本发明系统是一种新型纳米载体，与脂质体相比，肿瘤靶向性大大提高；与外泌体相比，载药能力显著提升，利用了现有两种纳米载体的优势而克服了它们的缺陷。
4、针对肿瘤化疗中药物靶向效率不高，全身毒副作用强的问题，本发明首次将脂质体与间充质干细胞外泌体杂化融合，构建杂化外泌体。其一方面具备脂质体载药能力强，肿瘤被动靶向的作用，另一方面具有间充质干细胞外泌体特有的肿瘤趋向性，在双重靶向作用下，将化疗药物递送至肿瘤部位。耐药性的产生是肿瘤预后差的主要原因，本发明制备的杂化外泌体可同时包载二种及以上的抗肿瘤药物，协同增效，同时递送至肿瘤部位发挥作用。本发明从载体角度提高肿瘤靶向抑制作用，降低全身毒性；从联合用药角度，降低肿瘤耐药性，提高患者预后；同时，解决了外泌体载药能力低、脂质体靶向效率不够高、多种药物同时包载等技术瓶颈问题，为肿瘤靶向纳米药物递送系统的研究提供新的思路和途径。
5、本发明首次利用间充质干细胞外泌体与脂质体杂化融合，并可同时包载多种药物，协同增效，降低肿瘤耐药性，提高患者预后。本发明主要贡献在于间充质干细胞外泌体在肿瘤靶向药物递送中的应用，结合脂质体的优势，融合杂化构建全新纳米载体，并结合联合用药，为肿瘤靶向纳米药物递送系统的研发提供新的思路，目前尚无研究报道。
6、肿瘤治疗中药物靶向性低、全身毒副作用强、肿瘤因耐药性而预后差的问题，以及脂质体只具有epr效应肿瘤被动靶向作用的现状，还有外泌体包载细胞毒性药物的技术瓶颈，本发明的目的在于将多重载药脂质体与间充质干细胞外泌体融合杂化，制备杂化载体，提高对多种药物同时包载的能力同时，从被动靶向和主动靶向两个角度提高药物递送系统的肿瘤靶向效率，减毒增效。
附图说明
图1为本发明中第3-6代的骨髓间充质干细胞形态图；
图2为本发明中替拉扎明和肼屈嗪的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统粒径分布图(a)和透射电子显微镜(tem)形态图(b)；
图3为本发明中小鼠肿瘤体积抑制曲线图；
图4为本发明中小鼠体重变化曲线图；
图5为本发明中注射试验制剂0.5h后小鼠组织分布研究结果图(a)和注射试验制剂8h后小鼠组织分布研究结果图(b)。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统，所述药物递送系统由间充质干细胞外泌体和脂质体通过杂化融合构建而成。
较优地，所述间充质干细胞外泌体来源于动物的骨髓间充质干细胞、骨骼肌间充质干细胞、骨外膜间充质干细胞、骨小梁间充质干细胞、脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。
较优地，所述脂质体为由胆固醇类成分、磷脂材料组成的磷脂双分子层闭合囊泡；
其中，所述胆固醇类成分选自胆固醇或其衍生物；
所述磷脂材料选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、1-硬脂酰-溶血磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、培化磷脂酰乙醇胺、二芥酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺中的一种或两种以上混合物。
较优地，所述杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统呈囊泡状，其粒径分布中，中位径在60～200nm；
或者，所述多重载药杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统能够包含几种脂溶性药物，或脂溶性药物组合水溶性药物，或几种水溶性药物。
一种如上所述的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统的制备方法，步骤如下：
s1将胆固醇类成分和磷脂材料按照重量比5-20：80-95溶解于有机溶剂中，再加入脂溶性抗肿瘤药物，水浴35-55℃，使胆固醇类成分和磷脂材料均匀溶解；
s2水浴条件下，旋转抽真空，除去有机溶剂，使容器内壁上形成蜂窝状薄膜，置于真空干燥箱放置8-12h；
s3取步骤s2得到的薄膜，加入溶解有水溶性抗肿瘤药物的ph缓冲溶液，水浴40-60℃，旋转，使薄膜全部溶解；
s4超声或均质，制备中位径在60～200nm的载药脂质体；
s5利用载体内外ph梯度变化的制备技术，在步骤s4所得载药脂质体的基础上继续加载具有强酸弱碱盐特性或强碱弱酸盐特性的水溶性药物，制备多重载药脂质体；
s6培养间充质干细胞，收集培养过程中剩余的液体培养基，将其进行离心操作后得外泌体沉淀，配制外泌体储备液；
s7将步骤s6所得外泌体储备液与步骤s5所得载药脂质体混合，反复冻融若干次，即得杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统。
较优地，所述步骤s5中载体内外ph梯度变化的制备技术为：针对强酸弱碱盐，需要调节脂质体内水相ph2.5-4.0，外水相ph至6.0-8.5；
针对强碱弱酸盐，需要调节脂质体内水相ph8.5-10.5，外水相ph至5.5-8.0。
较优地，所述步骤s6具体为：
取间充质干细胞到细胞培养瓶中，加入含有质量浓度10-20％胎牛血清的dmem/f12培养基，于恒温培养箱内培养；弃去未贴壁细胞；原代培养5-15天，进行首次传代，观察贴壁间充质干细胞生长达到70-90％时，进行再次传代培养；取第3-6代的骨髓间充质干细胞，收集细胞上清，分装于离心管中，200-500×g离心1-30min，取上清液，1000-3000×g离心1-30min，取上清液，8000-12000×g离心20-40min，取上清液，8000-12000×g离心60-80min，得外泌体沉淀，用10～50倍体积的pbs溶液清洗重悬，得外泌体储备液。
较优地，所述步骤s7具体为：
将外泌体储备液与1-10倍体积的多重载药脂质体于室温混合，30-40℃搅拌孵育10-30min，置于液氮冷冻5-10min，室温解冻，于30-40℃搅拌孵育15-30min，再置于液氮冷冻5-10min，进行多个冻融循环，使外泌体膜与脂质体膜充分融合杂化，制得多重载药的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统。
如上所述的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统在药物制备方面中的应用。
较优地，所述应用为：所述药物递送系统能够包载并递送抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞内酶活性的药物、抑制微管蛋白形成的药物、抑制dna形成或rna形成的药物、导致肿瘤组织缺氧的药物、导致肿瘤组织中产生氧自由基的药物中的两种或多种。
更具体地，相关制备及检测如下：
实施例1替拉扎明-肼屈嗪双载药杂化间充质干细胞外泌体的制备
(1)制备外泌体储备液
取新鲜动物间充质干细胞样本1ml到细胞培养瓶中，加入含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基，于37℃、5％co2恒温培养箱内培养；分别在24、48和72小时将培养瓶全量换液，弃去红细胞、脂肪细胞等未贴壁细胞；每三天换液一次，原代培养10-15天，进行首次传代，观察4-7天后贴壁间充质干细胞生长达到80-90％时，进行再次传代培养；取第3-6代的骨髓间充质干细胞(图1)，收集细胞上清100ml，分装于离心管中，300×g离心10min，取上清液，2000×g离心10min，取上清液，10000×g离心30min，取上清液，10000×g离心70min，得外泌体沉淀，用pbs溶液清洗重悬，得外泌体储备液。
(2)制备替拉扎明-肼屈嗪双载药脂质体
首先，将胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱和蛋黄卵磷脂按照重量比10:60:30溶解于有机溶剂中，再加入脂溶性肿瘤乏氧药物替拉扎明，水浴35-55℃，使均匀溶解；
接着，水浴条件下，旋转抽真空，除去有机溶剂，使容器内壁上形成蜂窝状薄膜，置于真空干燥箱放置8-12h；
然后，取上述薄膜，加入ph3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，水浴40-60℃，旋转，使薄膜全部溶解；
接着，超声，制备中位径在90-100nm的替拉扎明脂质体；
最后，利用载体内外ph梯度变化的制备技术，缓慢调节外水相ph至7.0，在替拉扎明脂质体的基础上继续加载具有强酸弱碱盐特性的水溶性药物，盐酸肼屈嗪，其具有降低肿瘤血液灌注，增加其缺氧程度的作用，制得替拉扎明-肼屈嗪双载药脂质体。
(3)外泌体-脂质体杂化融合
将1倍体积外泌体储备液与5倍体积替拉扎明-肼屈嗪双载药脂质体于室温混合，35℃搅拌孵育20min，置于液氮冷冻5-10min，室温解冻，于35℃搅拌孵育20min，再置于液氮冷冻5-10min，进行多个冻融循环，使外泌体膜与脂质体膜充分融合杂化，制得同时包载替拉扎明和肼屈嗪的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统(粒径分布与形态见图2)。
对比例1替拉扎明杂化间充质干细胞外泌体的制备
(1)制备外泌体储备液
同实施例1。
(2)制备替拉扎明脂质体
首先，将胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱和蛋黄卵磷脂按照重量比10:60:30溶解于有机溶剂中，再加入脂溶性肿瘤乏氧药物替拉扎明，水浴35-55℃，使均匀溶解；
接着，水浴条件下，旋转抽真空，除去有机溶剂，使容器内壁上形成蜂窝状薄膜，置于真空干燥箱放置8-12h；
然后，取上述薄膜，加入ph3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，水浴40-60℃，旋转，使薄膜全部溶解；
最后，超声，制备中位径在90-100nm的替拉扎明脂质体。
(3)外泌体-脂质体杂化融合
将1倍体积外泌体储备液与5倍体积替拉扎明脂质体于室温混合，35℃搅拌孵育20min，置于液氮冷冻5-10min，室温解冻，于35℃搅拌孵育20min，再置于液氮冷冻5-10min，进行多个冻融循环，使外泌体膜与脂质体膜充分融合杂化，制得包载替拉扎明的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统。
对比例2盐酸肼屈嗪杂化间充质干细胞外泌体的制备
(1)制备外泌体储备液
同实施例1。
(2)制备替盐酸肼屈嗪双载药脂质体
首先，将胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱和蛋黄卵磷脂按照重量比10:60:30溶解于有机溶剂中，水浴35-55℃，使均匀溶解；
接着，水浴条件下，旋转抽真空，除去有机溶剂，使容器内壁上形成蜂窝状薄膜，置于真空干燥箱放置8-12h；
然后，取上述薄膜，加入ph3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，水浴40-60℃，旋转，使薄膜全部溶解；
接着，超声，制备中位径在90-100nm的空白脂质体；
最后，利用载体内外ph梯度变化的制备技术，缓慢调节外水相ph至7.0，在空白脂质体的基础上继续加载具有强酸弱碱盐特性的水溶性药物，盐酸肼屈嗪，其具有降低肿瘤血液灌注，增加其缺氧程度的作用，制得盐酸肼屈嗪脂质体。
(3)外泌体-脂质体杂化融合
将1倍体积外泌体储备液与5倍体积替拉扎明-肼屈嗪双载药脂质体于室温混合，35℃搅拌孵育20min，置于液氮冷冻5-10min，室温解冻，于35℃搅拌孵育20min，再置于液氮冷冻5-10min，进行多个冻融循环，使外泌体膜与脂质体膜充分融合杂化，制得包载盐酸肼屈嗪的杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统。
对比例3替拉扎明-肼屈嗪双载药脂质体的制备
首先，将胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱和蛋黄卵磷脂按照重量比10:60:30溶解于有机溶剂中，再加入脂溶性肿瘤乏氧药物替拉扎明，水浴35-55℃，使均匀溶解；
接着，水浴条件下，旋转抽真空，除去有机溶剂，使容器内壁上形成蜂窝状薄膜，置于真空干燥箱放置8-12h；
然后，取上述薄膜，加入ph3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，水浴40-60℃，旋转，使薄膜全部溶解；
接着，超声，制备中位径在90-100nm的替拉扎明脂质体；
最后，利用载体内外ph梯度变化的制备技术，缓慢调节外水相ph至7.0，在替拉扎明脂质体的基础上继续加载具有强酸弱碱盐特性的水溶性药物，盐酸肼屈嗪，其具有降低肿瘤血液灌注，增加其缺氧程度的作用，制得替拉扎明-肼屈嗪双载药脂质体。
对比例4替拉扎明-肼屈嗪双载药外泌体的制备
(1)制备外泌体储备液
同实施例1。
(2)载药
将替拉扎明和盐酸肼屈嗪与外泌体储备液于4℃电穿孔缓冲液中混合，在350v和150mf条件下利用genepulserii电穿孔器穿孔载药，再于37℃孵育30min，使外泌体膜恢复，制备得替拉扎明-肼屈嗪双载药外泌体。
对比例5替拉扎明-肼屈嗪水溶液的制备
将替拉扎明与肼屈嗪加入水中溶解制备，需加入少许rh40表面活性剂助溶替拉扎明。
为了更好的说明本发明的有益效果，本发明对实施例1和对比例1-5进行验证试验：
一、肿瘤抑制效果和全身毒性降低效果实验
以hepg-2构建裸鼠异种移植肿瘤模型，18-22g(♀)，随机分为4组，每组小鼠3只。通过各实验组分别给予生理盐水(对照)，对比例1，对比例2和实施例1，表征替拉扎明和肼屈嗪联合使用效果。3天给药一次，共给药6次，绘制肿瘤抑制曲线和体重变化曲线。
由肿瘤抑制曲线(图3)可知，肼屈嗪单用肿瘤抑制作用甚微，替拉扎明和肼屈嗪联合应用，肿瘤抑制能力显著增高，且优于替拉扎明单用组。说明肼屈嗪降低实体瘤的氧气含量，提高了替拉扎明在缺氧环境中的细胞毒性，两药物具有协同效应。
由体重变化曲线(图4)可知，对比例1全身毒性最强，对比例2基本无明显全身毒性，体重上升主要由肿瘤增长引起，实施例组小鼠体重稍有下降，但显著优于对比例1组，说明全身毒性作用降低。
二、组织分布实验
以hepg-2构建裸鼠异种移植肿瘤模型，18-22g(♀)，随机分为4组，每组6只小鼠。各组分别尾静脉注射对比例3，对比例4、对比例5和实施例1，于0.5和8小时脱颈椎处死小鼠(每个时间点，每组处死3只小鼠)，取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，利用hplc-ms/ms进行组织分布研究，考察肿瘤部位的药物蓄积情况，与其他器官(血液、心、肝、脾、肺、肾)进行比较，说明各制剂组的肿瘤靶向能力和药物体内释放情况。
色谱条件为：色谱柱：agelavenusilxbpc18(2.1mm×30mm，3.0μm)；流动相：a相为甲醇和水相(5mmol·l-1乙酸铵+1％乙腈，ph9.8)＝90:10，b相为甲醇-水相＝30:70；流速:0.4ml·min-1；进样量10μl；柱温30℃。流动相采用梯度洗脱：[0～0.2mina和b比例为60:40，0.2～1.48mina和b比例从60:40上升至100:0，1.48～1.5mina和b降至60:40，1.5～5min维持a和b比例60:40不变]，整个分析时间为5min。
选用气动辅助电喷雾离子化(esi)，在正离子电离模式下，采用多反应监测(mrm)的质谱扫描方式；氮气做干燥气，流速9l·min-1，温度350℃，雾化室压力25psi。
由组织分布研究结果(图5)可知，实施例1的药物肿瘤靶向蓄积能力最好，与对比例4无显著性差异，对比例5肿瘤靶向性最差，对比例3介于二者之间。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
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