白茶提取物及其制备方法、给药方法和在抗抑郁中的应用与流程

本发明属于药用成分提取分离技术及食品、药品用途技术领域，涉及白茶有效成分的提取物及其制备方法，以及白茶水提取物在有效缓解抑郁症，对抑郁症伴随的嗅觉的损伤的修复中的应用。

背景技术：

白茶为茶中珍品，历史悠久，过去大部分白茶用于出口，近几年来才逐渐进入国内大众视野。随着科学技术的发展，国内外对白茶保健功效的研究更为深入，各领域知识交叉与渗透使得对白茶的研究取得突破性进展，并遵循严格的实验研究模式。

白茶的加工工艺较为简单，仅包括萎调和干燥两个阶段，由于热作用时间短且温度较低，因此鲜叶中的许多有效成分能在白茶中有较多的保留，从而也使白茶与其他茶类相比，在抗氧化、抗肿瘤、抗菌等方面的作用更为突出。

白茶作为中国六大茶之一，含有多种生物活性物质，如茶多酚、氨基酸、黄酮、咖啡碱、没食子酸、儿茶素、绿原酸等，与其余五大茶类相比，其氨基酸和咖啡碱含量较高。白茶具有较好的药理和保健作用，研究表明它在延缓衰老(抗氧化)、抗肿瘤、抑菌抗病毒、抗疲劳、降血糖、调节血脂、预防心脑血管疾病、调节免疫功能等方面效果显著。

茶多酚是由许多酚类衍生物组成的混合物的总称，是白茶中含量最高的可溶性物质。它影响了白茶的色香味的形成，是起到最主要保健作用的功能性成分。茶多酚的分子结构决定它提供质子的特性，从而使其具有很强的还原性，因此茶多酚是一种不可多得的天然抗氧化剂和最好的清除自由基的物质。其抗老防衰效应是维生素e的十倍，并有延缓心肌脂褐素生成的功效。酚类化合物按其化学结构可分为四类：儿茶素类(黄烷醇类)、花黄素类(黄酮醇类)、酚酸类、花青素类，其中儿茶素类是多酚类化合物的主体。

黄酮类化合物具有较强的抗氧化作用和清除自由基的能力，还具有降血脂、抗菌抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性，是白茶发挥保健作用的重要功能成分。

机体会在应激状态下产生大量的自由基，而氧自由基与衰老、肿瘤、炎症等病理过程相关，因此从天然材料中寻找有效的抗氧化物质用于防治疾病和保证机体健康运转已成为热点话题。其中，白茶作为一种具有抗氧化活性的天然资源，在预防和改善氧自由基引起的机体损伤，维持健康方面有着较好的应用价值，同时它具有资源丰富、功效多、活性强的特点，在医疗保健、食品卫生方面有着很好的市场开发利用前景。

另外，据美国癌症研究基金会的研究，白茶是一种新的抗癌物质，能不断抑制、缩小肝癌的肿块，提高人体的免疫功能；美国佩斯大学研究表明，白茶提取物可以预防导致葡萄球菌感染、链球菌感染、肺炎等的细菌生长。

白茶中的咖啡碱和黄烷醇类可促进肾上腺素垂体的活动，是强有力的中枢神经兴奋剂，能加强肌肉收缩，消除肌体疲劳，使人头脑清醒，同时可促进血液循环，扩张血管，降低血压，并有显著的利尿效应。相比于其他茶类，白茶含有较多的咖啡碱和黄烷醇类，所以白茶的兴奋、抗疲劳、利尿等作用比其他茶类显著。咖啡碱还是茶叶重要的滋味物质，其与茶黄素以氢键结合后形成的复合物具有鲜爽味，因此咖啡碱含量是影响茶叶质量的一个重要因素。

白茶的茶氨酸含量相比于其它茶叶较高，而茶氨酸在人体肝脏内分解为乙胺，乙胺能调动名为“γδt细胞”的人体血液免疫细胞抵御外界侵害，继而由t细胞促进干扰素的分泌，形成人体抵御感染的“化学防线”。美国哈佛大学医学院的布科夫斯基实验室得出结论，喝茶能使血液免疫细胞干扰素分泌量提高5倍，从而更大地提高了机体抵御外界侵害的能力。

由于白茶特殊的加工工艺，较好地保留了人体所必需而其它茶类含量较少的活性酶，长期饮用白茶可以显著提高人体内脂蛋白脂肪酶，促进脂肪分解代谢，有效控制胰岛素分泌量，延缓葡萄糖的吸收，分解体内多余糖分，促进血糖平衡。

抑郁症是一种以持久的情绪低落、兴趣与快感缺失为特征的情感障碍性精神疾病，随着现代生活节奏的加快与社会压力的增大，其发病率呈现出逐年上升的趋势，对人类的身心健康造成严重的危害,给社会和家庭带来沉重的负担。抑郁症的发病涉及到多种复杂的机制，至今尚未完全阐明，临床诊断仍以症状学为主要依据。针对不同的机制与靶点，可将目前临床上常用的抗抑郁药物分为以下几类：

一、单胺类假说药物

目前临床上使用最多的是基于“单胺学说”抑郁症发病机制的抗抑郁药物。

传统抗抑郁药物：

①单胺氧化酶抑制剂：抑酶作用快，停药后酶活恢复快，毒副作用较大。

②三环类抗抑郁药：不良反应有抗胆碱能副作用、中枢神经系统副作用、心血管副作用、性方面的副作用、体重增加、过敏反应及中毒。

③四环类抗抑郁药物：主要不良反应有头晕、乏力、罕见粒细胞减少。

新型抗抑郁药物：

①五羟色胺再摄取抑制剂：目前应用最广泛的抗抑郁药物，如氟西汀(百忧解)、帕罗西汀等，与其它抗抑郁药物联合使用时有禁忌。

②五羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂：如文拉法辛，常见的不良反应为有胃肠不适、中枢神经系统异常、视觉异常、打哈欠、出汗和性功能异常。

③去甲肾上腺素和特异性五羟色胺再摄取抑制剂：常见的副作用有食欲增加、体重增加、嗜睡、镇静。

二、谷氨酸假说药物

ampa受体激动剂和nmda受体拮抗剂。

三、应激假说药物

①促肾上腺皮质素释放激素(crh)受体拮抗剂。

②地昔帕明、阿米替林：直接作用于gr(糖皮质激素受体)，增加其对糖皮质激素的结合能力，恢复其受体活性。

目前临床上常用的抗抑郁药物都存在着一定的局限性，如副作用或不良反应，与其它抗抑郁药物联合使用时有禁忌等。除此之外，目前常见的抗抑郁药物多为口服，有效成分需跨越血脑屏障才能发挥作用，在一定程度上限制了药物的治疗效果。

而脑影像学研究发现，抑郁症患者的受累脑区与参与嗅觉信息处理的脑区多有重叠的现象。抑郁症患者存在着嗅球体积减小的现象，且与抑郁症状的严重程度呈负相关。而嗅球切除的抑郁症动物模型也表明，嗅球摘除的大鼠会产生抑郁症样行为改变，并可以通过抗抑郁药物治疗而得以改善。这表明嗅觉通路可能是直通抑郁症治疗的一个潜在靶点。

已有研究表明，鼻腔给药作为脑靶向性给药的途径之一，可以有效地使药物绕过血脑屏障，通过嗅觉通路靶向递送到相应的脑部。而抑郁症与嗅觉通路的脑区存在着紧密的联系与重叠，因此可以在此基础上通过鼻腔给药来治疗抑郁症。

而目前还未见有关于白茶提取物具有改善抑郁症行为症状及对其伴随着的嗅觉损伤具有修复作用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种白茶提取物(白茶水提物)及其提取方法，给药方式和应用。

本发明以福建白茶为原料，采取水提法后过滤得到所述白茶提取物。制得的白茶提取物采用鼻内给药的方式，可应用于缓解抑郁症样的症状并且对其所伴随的嗅觉损伤具有部分修复作用。

本发明提供的一种白茶提取物，按如下方法制备得到：

(1)将原料白茶碾碎，按料液质量比1：30～1：70与水混合。

(2)对步骤(1)得到混合物进行加热蒸煮，过滤，取上清液。

(3)快速冷却，即制得白茶提取物，稀释后使用。可长期保存在冰箱。

步骤(1)中，所述白茶是指白茶干茶叶，包括白茶的叶和茎部分。所述干茶叶使用研钵和研棒进行研磨后，再与水混合；所述水可以是蒸馏水、矿泉水等。

步骤(1)中，按料液质量比1：50与蒸馏水混合。

步骤(2)中，所述的加热蒸煮的温度为80～90℃；优选地，为85℃。

步骤(2)中，所述的加热蒸煮的时间为8～12min；优选地，为10min。

步骤(2)中，所述的加热蒸发可采用旋转蒸发仪完成。

步骤(3)中，所述过滤是指采用布氏漏斗，真空抽滤方法进行过滤；所述过滤可以为多次过滤，次数为2～3次。

步骤(3)中，所述的快速冷却使用水浴锅实现，将温度快速冷却至30℃。在步骤(2)加热蒸煮，过滤过程结束之后，不需要在室温冷却，直接转移至水浴锅，或者步骤(2)过滤时可以将整套装置置于水浴锅中。

步骤(3)中，所述的保存的温度为-20℃。

步骤(3)中，所述的稀释是指将白茶提取物优选稀释至浓度为0.021g/ml。所述稀释的目的是将所述白茶提取物稀释至适合于给药的剂量，需要考虑到单次鼻饲剂量，如每次为0.1-0.3ml，根据给药量以及受试个体的体重调整合适的浓度。

本发明还提供了由上述方法得到的白茶提取物。

本发明还提供了一种使用鼻饲的方式将所述白茶提取物给予被试个体的方法。

本发明还提供了所述白茶提取物在制备抗抑郁、治疗或缓解抑郁症的食品、保健品或药物中的应用。

本发明还提供了所述白茶提取物在制备治疗或缓解抑郁症所导致的快感缺失行为的食品、保健品或药物中的应用。

本发明还提供了所述白茶提取物在制备治疗或缓解抑郁症所导致的易于绝望行为的食品、保健品或药物中的应用。

本发明还提供了所述白茶提取物在制备治疗或缓解cums所导致的小鼠抑郁样行为(糖水消耗量减少，强迫游泳时间减少，悬尾不动时间增加)的食品、保健品或药物中的应用。

本发明提供了所述白茶提取物在制备治疗或改善或修复嗅觉损伤或缺失，或提供嗅觉保护的食品、保健品或药物中的应用。

本发明提供了所述白茶提取物在制备治疗或改善或修复抑郁症伴随的嗅觉损伤或缺失，或提供抑郁症嗅觉保护的食品、保健品或药物中的应用。

本发明提供了所述白茶提取物在制备用于缓解cums所导致的小鼠抑郁伴随的嗅觉能力的损伤，如食物包埋潜伏期增加，嗅觉灵敏性降低，嗅觉偏好性降低等。

本发明白茶提取物采用鼻内给药的方式，可以提高cums(慢性不可预测性应激)方法建模的抑郁症样小鼠的蔗糖偏好，减少了其在强迫游泳测试和悬尾测试中的不动时间，并且改善了海马细胞内线粒体和突触的损伤，增加了突触数量。并且增加了小鼠海马中五羟色胺(5-ht)和脑源性神经营养因子(bdnf)的含量。本方法制备的白茶提取物对cums方法建模小鼠的嗅觉损伤有部分修复的效果，可以起到保护嗅觉的作用，而且较高的浓度的作用越明显。

本发明中，所述的白茶提取物作为食品、保健品或药物的唯一活性成分或者活性成分之一。

本发明中，所述食品、保健品或药物为单一成分的白茶提取物，或为所述白茶提取物与填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、溶剂、表面活性剂、香味剂、防腐剂、润滑剂、甜味剂和色素中的一种或多种组成的片剂，或为所述白茶提取物与缓冲剂、抗氧增效剂、矫味剂、甜味剂、溶剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种组成的口服液制剂。

其中，所述食品、保健品或药物还包括有使白茶提取物稳定性提高的成分。

其中，所述食品、保健品或药物为液体制剂、固体制剂、喷剂或者气雾剂。

其中，所述食品、保健品或药物为注射剂、混悬剂、乳剂或溶液剂。

其中，所述食品、保健品或药物为糖浆剂。

其中，所述固体制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或冲剂。

本发明的有益效果在于，本发明制备白茶提取物的方法操作简单，得到的白茶提取物可以有效缓解抑郁样症状，包括快感缺失行为和易于绝望行为的好转；所述白茶提取物还可用于修复抑郁所伴随的嗅觉损伤或缺失。本发明所述白茶提取物可以采用鼻饲这种直接高效的脑内给药的方式，为治疗抑郁症及其伴随的嗅觉缺失的药物/保健品/食品开发提供了新思路。

附图说明

图1为实施例1-14整体流程图。

图2为实施例4，5，6，7白茶提取物对cums建模小鼠抑郁症样行为的影响；a为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠糖水消耗测试的影响(实施例4)；b为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠强迫游泳测试的影响(实施例5)；c为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠悬尾测试的影响(实施例6)；d为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠旷场测试的影响(实施例7)。

图3为实施例8，9，10白茶提取物对cums建模小鼠的嗅觉能力的影响；a为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠食物包埋测试的影响(实施例8)；b为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅觉敏感性测试的影响(实施例9)；c为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅觉躲避测试的影响(实施例10)。

图4为实施例11白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马微观结构的影响；a为白茶提取物对各组小鼠海马微观结构影响的电镜照片；b为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马的突触个数的影响。

图5为实施例11白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅球微观结构的影响；a为白茶提取物对各组小鼠嗅球微观结构影响的电镜照片；b为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅球中的突触个数的影响。

图6为实施例12白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马脑神经营养因子(bdnf)基因表达水平的影响；a为琼脂糖凝胶电泳评估bdnf在海马中的mrna表达条带；b为各组间bdnf在海马中的mrna水平。

图7为实施例13白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅球的脑神经营养因子(bdnf)和嗅觉标记蛋白(omp)基因表达水平的影响；a为琼脂糖凝胶电泳评估omp和bdnf在嗅球中的mrna表达条带；b为各组间omp在嗅球中的mrna水平；c为各组间bdnf在嗅球中的mrna水平。

图8为实施例14白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马中神经递质分泌量的影响中的第一步(第一步是指获得小鼠脑内各类神经递质的标准色谱图)，测定小鼠脑中ne、da、5-ht和5-iaa的代表性色谱图。

图9为实施例14海马中神经递质分泌量的影响中的第二步(第二步是指对本发明中的各组小鼠脑部样品进行各类神经递质水平的检测)，为白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马内各类单胺类神经递质水平的影响。

图1-9中，wt为不进行cums建模处理的小鼠；cu为仅进行慢性应激处理而不给药的对照组小鼠；lt为在进行慢性应激后给予低浓度白茶提取物(20mg/kg)鼻饲的小鼠；ht为在进行慢性应激处理后给予高浓度白茶提取物(40mg/kg)鼻饲的小鼠；cf为在进行慢性应激处理后给予腹腔注射药物弗西汀的阳性对照组小鼠。

*表示与对照组相比p<0.05；**表示与对照组相比p<0.01；#表示与慢性应激组相比p<0.05；##表示与慢性应激组相比p<0.01。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门体积的内容之外，均为本领域的普遍知识和公识常识，本发明没有特别限制内容。

在鼻饲小鼠时，保持每只小鼠的有效药量相同。

实施例1白茶提取物的制备

将原料白茶(生产商：福建清铧茶叶股份公司；品名：传成老树白茶；质量等级：特级；净含量：210g)10g，使用研钵研磨粉碎，按照1:50(w/w)的叶/提取介质比，与500g蒸馏水混合，使用旋转蒸发仪，85℃真空下蒸煮10min，快速过滤取上清液，之后转移到恒温水浴锅中降温到30℃，得到白茶提取物，可放置在-20℃冰箱进行保存。

实施例2慢性不可预测应激(cums)小鼠的模型构建

取50只6周大的雄性c57bl/6j小鼠，体重均为20-40g，动物随机分为五组，每组10只：对照组(wt)、慢性应激组(cu)、氟西汀组(cf)、高浓度白茶组(ht)和低浓度白茶组(lt)。除对照组，其他组都接受了cums的处理。慢性不可预测轻度应激方案(cums)由多种轻度应激源组成：(1)24小时的断粮处理；(2)24小时的断水处理；(3)24小时45°笼子倾斜处理；(4)光/暗循环倒置处理；(5)24小时脏鼠笼处理；(6)4℃下强制游泳5分钟处理；(7)夹尾1分钟处理。为了让压力源和类型不可预测，应激源以随机方式排列，在三周建模过程中的任何时候都有可能发生。对照组小鼠被安置在一个单独的房间里，与被施以应激的小鼠没有接触。

实施例3对cums建模小鼠进行给药处理

在进行完为期三周的cums小鼠建模后，对其中的高浓度白茶组和低浓度白茶组通过鼻饲的方式分别给予剂量为40mg/kg和20mg/kg的白茶提取物一周，而氟西汀组腹腔注射20mg/kg的氟西汀药物一周，慢性应激组不进行给药处理。进行鼻饲时，小鼠被控制在手上，至于仰卧的位置进行给药。取滴管将药液滴至小鼠鼻孔前方，由其自由呼吸吸入药液，如果有未吸入的部分，则再滴加相同的量，保持每一只小鼠的给药量相同。

然后进行以下实施例4-14的测试。

实施例4白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠糖水消耗测试的影响

为了评估对照组及各个实验组的小鼠的抑郁行为的程度，使用糖水消耗量实验进行判定。各组小鼠均接受了适应蔗糖溶液的训练：给予两瓶蔗糖溶液24小时，再给予一瓶蔗糖溶液和一瓶水24小时。随后小鼠被剥夺食物和水12小时，再进行24小时蔗糖偏好测试，在此测试期间，小鼠可以自由获得两个瓶子，一个是100ml水，另一个是100ml浓度为1％(w/v)的蔗糖溶液。两个瓶子的位置是随机变化的。蔗糖偏好程度采用以下公式计算：蔗糖偏好(％)＝(蔗糖消耗体积)/(蔗糖消耗体积+水消耗体积)×100％。本实施例中，所述一瓶蔗糖溶液是指100ml1％(w/v)的蔗糖溶液；所述一瓶水是指100ml水。

白茶提取物对对照组以及实验组小鼠的糖水偏好结果的影响如图2a所示，与对照组相比，慢性应激组小鼠的相对蔗糖摄入量显著降低(p<0.01)。低浓度白茶组和高浓度白茶组与对照组相比逆转相对蔗糖摄入量，尤其是高浓度白茶组显著逆转该情况(p<0.05；p<0.01)。

实施例5白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠强迫游泳测试的影响

为了评估对照组及各个实验组的小鼠的抑郁行为的程度，使用强迫游泳实验进行判定。单只小鼠被迫在装有17cm水的圆柱形透明玻璃容器中游泳，水温为室温，玻璃容器直径18cm，高度40cm。入水后，小鼠适应前1分钟，之后5分钟的不动时间被监视器记录下来。不动时间是指小鼠在水中漂浮而不挣扎的时间。

白茶提取物对对照组以及实验组小鼠的强迫游泳实验结果的影响如图2b所示，与对照组相比，慢性应激组小鼠的不动时间明显延长(p<0.05)。然而，鼻饲低浓度白茶和高浓度白茶显著缩短了不动时间(p<0.05；p<0.05)，表明白茶提取物具有抗抑郁作用。

实施例6白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠悬尾测试的影响

为了评估对照组及各个实验组的小鼠的抑郁行为的程度，使用悬尾实验进行判定。用医用胶带将小鼠牢牢固定在尾部的尖端1.0-1.5cm处，并将其倒挂在盒子中，距离盒子底部约30cm，盒子三面不透明，隔离了小鼠的视觉干扰。小鼠适应前1分钟，最后5分钟的不动时间被监视器记录下来。只有当小鼠完全没有任何动作时，才可以认为它是不动的。

白茶提取物对对照组以及实验组小鼠悬尾实验结果的影响如图2c所示，与对照组小鼠相比，慢性应激组小鼠的不动时间显著延长(p<0.01)，鼻饲高浓度白茶对逆转该情况有显著作用(p<0.01)，该作用效果甚至超过了氟西汀(p<0.05)，说明鼻饲白茶提取物具有显著的抗抑郁作用。

实施例7白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠旷场测试的影响

考虑到鼻饲白茶提取物可能对实验小鼠自发的运动活力产生影响，从而会减少强迫游泳试验和悬尾试验中的不动时间。为确定该情况是否存在，并为了评估对照组及各个实验组的小鼠的自主活动能力和情绪的焦虑程度，使用旷场实验进行判定。将小鼠单独放置在长40cm、宽60cm、高50cm的铁盒中间，铁盒底部被分成25个相等的正方形。小鼠适应前1分钟，之后5分钟用监视器记录每只小鼠所有爪子都跨过的方块数。每只小鼠测试之前，都用75％的乙醇清洗铁盒底部。

白茶提取物对对照组以及实验组小鼠的旷场实验结果的影响如图2d所示，鼻饲白茶提取物对慢性应激小鼠运动活力的影响没有显著性差异(p>0.05；p>0.05)，而氟西汀能明显提高慢性应激小鼠的运动活力(p<0.01)，这表明白茶提取物对抑郁的治疗效果可能不是通过改善其运动功能的减退来实现的。

实施例8白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠食物包埋测试的影响

为了评估对照组及各个实验组的小鼠嗅觉能力，使用食物包埋实验进行判定。连续2天进行食物包埋实验，所有的小鼠在实验前都进行24小时饥饿处理，每天只对小鼠进行一次试验。在每次试验中，将一只小鼠置于试验箱底部(42×35×40cm³)的中央，使其寻找1g的食物小球，该颗粒埋在3厘米厚的垫层材料表面下约0.5厘米处。每只小鼠找到食物小球的潜伏期被定义为从把小鼠放进笼子到小鼠发现食物小球并用前爪和/或牙齿抓住它咬食之间的时间。如果小鼠能在5分钟内找到食物小球，它就可以用这个小球作为奖励回到自己的笼子里。反之，就没有奖励。每次试验之间清理试验笼内的垫层，每天随机改变食物小球的位置。在完成当天的测试后，每只小鼠都得到了1g的食物，以确保它们的基本生存。第二天重复第一天的步骤再次进行实验。

白茶提取物对对照组以及实验组小鼠的旷场实验结果的影响如图3a所示，不同处理的小鼠均在第二天更快地发现食物(图3a；wt:p<0.001；cu:p<0.05；lt:p<0.01；ht:p<0.01)，而仅仅接受cums建模处理的小鼠在两天内发现食物小球的速度明显慢于对照组小鼠(第1天，p<0.01；第2天，p<0.01)。为期2天的实验结果表明，对小鼠进行了低浓度、高浓度白茶提取物处理后，小鼠的潜伏期明显缩短，接近于使用阳性对照组的结果。(第1天：lt:p<0.05；ht:p<0.01；第2天：lt:p<0.05；ht:p<0.01)。

实施例9白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅觉敏感性测试的影响

本实施例采用花生酱作为香味的来源，玉米油作为溶剂。分别用0g/ml(即纯油)、0.1g/ml、0.05g/ml、0.01g/ml几个浓度梯度的花生酱进行实验。此外，本发明准备了9厘米×9厘米的滤纸用于承载气味样本。首先，把五组小鼠放进干净的笼子来适应环境，持续15分钟。然后，将小鼠转移到一个相同尺寸的笼子(确保环境相同)里，使用一张滤纸渗透一个浓度的花生酱稀释样本，使用摄像机记录3分钟。使用ethovisionxt14软件包(美国弗吉尼亚州noldus公司)对实验结果进行分析，分析统计指标为每一只小鼠在3分钟内用鼻嗅闻滤纸片的总时间。

实验结果如图3b所示，以花生酱(pb)浓度和处理(“处理”是指接受高/低浓度白茶提取物、弗西汀药物的处理，或是完全不接受药物处理等)为因子进行双方差分析。在对纯油气味进行测试时，各组间无显著性差异。而仅仅进行cums建模处理小鼠即慢性应激组对各个梯度花生酱的兴趣明显低于对照组小鼠(图3b；pb0.01g/ml，p<0.001；pb0.05g/ml，p<0.001；0.1g/mlpb，p<0.001)。对0.1g/mlpb进行分析时，发现低浓度白茶组和高浓度白茶组小鼠均显著增加了嗅闻时间(p<0.001)。而高浓度白茶组的小鼠对0.05和0.1g/mlpb的调查时间也发生了明显的延长(0.05g/mlpb,p<0.05；0.1g/mlpb,p<0.01)。

实施例10白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅觉躲避测试的影响

取鼠笼在笼底画一条线，将鼠笼分为两部分(1:3)。小鼠在实验笼子里自由活动。带有试验气味的滤纸被固定在较小的区域的底部。使用2-甲基丁酸(1.7×10^-6mol)作为小鼠厌恶气味的来源，使用蒸馏水稀释。每个浓度梯度的避嗅时间的定义是：用小鼠嗅闻使用蒸馏水浸透的滤纸片的时间减去小鼠在每种有厌恶气味滤纸片的区域中停留的时间。使用ethovisionxt14软件包(美国弗吉尼亚州noldus公司)对实验结果进行分析。

实验结果如图3c所示，2-甲基丁酸气味对仅仅接受cums造模处理的小鼠即慢性应激组无明显影响，并不能使其产生明显的躲避行为(p<0.001)。与其相比，低浓度和高浓度白茶组小鼠均显著延长了回避时间(lt:p<0.01；ht:p<0.01)，说明cums造模处理会使得小鼠的嗅觉喜恶的判断能力降低，而低浓度和高浓度白茶的鼻饲均可以修复这方面的损伤。

实施例11白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马和嗅球微观结构的影响

将小鼠的大脑从头骨中取出，置于2.5％的戊二醛中浸泡过夜。将含有海马和嗅球的半球组织块分别切成400μm厚的冠状切片。将切片在0.1mpb中清洗，并在2.5％戊二醛中直到加工。加工时，切片用0.1mpb洗涤，用1％四氧化二锇在0.1mpb中固定2h，再用0.1mpb洗涤。用光学显微镜leica-mmaf(中国北京日立高新技术公司)对海马体进行鉴定，并从冠状切片中切下海马体，在分级乙醇和丙酮中脱水，然后将海马体嵌入到树脂中。切片用超显微切片机修剪至70-75nm厚，在200目铜网格上提取切片，用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，用h7700透射电子显微镜(日立高新技术公司，北京，中国)观察切片。

在观察每一组的样本时，对于每一个切片随机选择十个视野进行计数统计，最终取平均数作为结果，比较组间差异。

如图4a所示，与对照组小鼠的细胞相比，在慢性应激小鼠海马细胞中，观察到锥体神经元的几种超微结构发生明显变化，线粒体损伤(大树突和突触末端中最常见的异常)，嵴破坏，空泡变性甚至线粒体膜中断，一些突触间隙不密集，这意味着神经信号受到应激的影响。低浓度白茶组和高浓度白茶组的线粒体与慢性应激组相比，空泡变性较少，嵴更加完整。

为了研究对照组及四个实验组海马内突触密度，本发明在每组随机选取了至少3个区域计算其突触数量，并取平均值，每个区域的面积为62μm²。在计算突触密度时，不考虑突触的大小和形状，对二维透射电子显微镜切片中的所有突触进行计数。图4b显示，与对照组相比，慢性应激小鼠海马内的突触显著减少(p<0.01)，高浓度白茶和氟西汀都较为显著的增加了其突触密度(p<0.05；p<0.05)，而且两者之间的效果没有明显的差异。

与海马中发生的情况较为类似，线粒体形态和突触损伤是嗅球细胞神经可塑性的特征。对照组及四个实验组的嗅球均用透射电镜观察(图5a)。在cu组小鼠嗅球中检测到嵴破坏、空泡变性甚至线粒体膜中断。与仅仅进行cums造模处理的小鼠即慢性应激组相比，低浓度和高浓度白茶组小鼠嗅球中的线粒体空泡变性相对较少，嵴较完整，且白茶处理组的突触间隙更密集，囊泡也更多。

对五组嗅球脊髓突触数进行单因素方差分析(图5b)，结果显示，相对于对照组，仅进行cums造模处理小鼠即慢性应激组的脊柱突触明显减少(p<0.01)，而无论是低浓度白茶还是高浓度白茶处理的小鼠的脊柱突触均显著升高(lt:p<0.05；ht:p<0.01)。

实施例12白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马脑神经营养因子(bdnf)基因表达水平的影响

一些研究表明抑郁症患者大脑区域的bdnf水平降低，而抗抑郁药治疗可提高大脑的bdnf水平。bdnf信号传导有利于活跃区域的突触小泡对接。bdnf在突触可塑性中起着重要作用。慢性应激损害海马bdnf表达，抗抑郁药物的作用与海马中bdnf合成和活性增加相关。bdnf水平升高可调节慢性应激小鼠海马内突触末梢的突触小泡分布，增加对接囊泡的数量。

本发明使用trizol试剂盒(invitrogen，carlsbad，california，usa)提取总rna来评估bdnf基因水平。用寡核苷酸引物(大连塔卡拉生物技术有限公司)合成了cdna，并用特异性引物进行了扩增。bdnf的实时引物为正向：5’-tcatactcggttgcatgaagg-3’(seqidno.1)；反向：3’-agacctcgacctgccc-5’(seqidno.2)。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色并在紫外光下拍摄。利用image-j软件对所有荧光条带的亮度进行分析比较。目的基因的表达情况均通过标准基因β-actin校准。

对结果进行分析显示，图6a显示琼脂糖凝胶电泳评估bdnf在海马中的mrna表达条带。图6b显示各组间bdnf在海马中的mrna水平。与对照组相比，慢性应激组小鼠的bdnf水平显著降低(p<0.01)，但给予低浓度白茶和高浓度白茶(p<0.05；p<0.01)和氟西汀(p<0.01)的小鼠bdnf水平显著增加。高浓度白茶增加bdnf水平甚至高于氟西汀。

实施例13白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠嗅球的脑神经营养因子(bdnf)和嗅觉标记蛋白(omp)基因表达水平的影响

半定量rt-pcr检测嗅球中bdnf和ompmrna的表达，以进一步研究cums小鼠鼻饲白茶提取物后嗅球损伤及相关分子的变化。本发明使用trizol试剂盒(invitrogen，carlsbad，california，usa)提取总rna来评估bdnf基因水平。用寡核苷酸引物(大连塔卡拉生物技术有限公司)合成了cdna，并用特异性引物进行了扩增。bdnf的实时引物为正向：5’-tcatactcggttgcatgaagg-3’(seqidno.3)；反向：3’-agacctcgacctgccc-5’(seqidno.4)；以及omp的实时引物正向：5′-cagcaggaaggttctcctcc-3′(seqidno.5)；反向：5′-gaacagccaggatatgccca-3′(seqidno.6)。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色并在紫外光下拍摄。利用image-j软件对所有荧光条带的亮度进行分析比较。目的基因的表达情况均通过标准基因β-actin校准。

图7a显示琼脂糖凝胶电泳评估bdnf在嗅球中的mrna表达条带。图7b的结果显示仅接受cums造模处理小鼠即慢性应激组的ompmrna表达明显低于对照组，而低浓度白茶和高浓度白茶处理组的小鼠的表达均显著升高(lt:p<0.05；ht:p<0.001)。bdnf与omp表达变化相似(图7c；p<0.05)。虽然低浓度白茶组与仅cums造模处理组即慢性应激组之间无显著性差异，但高浓度白茶组表现出了显著性差异(p<0.001)。

实施例14白茶提取物鼻饲对cums建模小鼠海马中神经递质分泌量的影响

使用高效液相色谱对去甲肾上腺素(ne)、多巴胺(da)、五-羟色胺(5-ht)、五-羟基吲哚乙酸(5-hiaa)这四种神经递质在海马中的分泌量进行检测。

用冰冷的生理盐水清洗海马并称重。检测当天，用0.4mol/l高氯酸(高氯酸体积：组织重量＝10:1)制备样品。匀浆在4℃下以10000rpm/min离心15min。取上清液，以相同条件离心10min。取上清液，用0.4mol/l高氯酸溶液定容至1ml。用荧光检测器高效液相色谱法测定ne、da、5-ht和5-hiaa。采用安捷伦1100系列高效液相色谱(安捷伦公司)进行了高效液相色谱分析。分析物在zorbaxsb-c18柱上分离，柱温为室温。流动相为0.1mol/l的naac(含0.1mol/l的edta-2na，用hac调节ph5.1)和甲醇以9:1混合后的混合物。流速为1.0ml/min，注入量为20ul/次，发射波长为330nm，激发波长为290nm，灵敏度为2。用标准品制成标准曲线量化每个样本中检测指标的量，ne、da、5-ht和5-hiaa标准品从sigma公司(st.louis,mo,usa)购买。称取ne3mg、da2mg、5-ht2mg、5-hiaa2.1mg，用0.1mol/l的盐酸溶解并定容到10ml，稀释500、1500、2000、2500倍，在4℃下以10000rpm/min离心10min，取上清液用于测定。

通过高效液相色谱仪和荧光检测仪评估海马内单胺类神经递质ne、da、5-ht和5-iaa的水平，以研究慢性不可预测轻度应激诱发的抑郁中鼻饲白茶的作用。图8是测定小鼠(标准品的小鼠脑组织，用于制备分离标准)脑中ne、da、5-ht和5-iaa的色谱图。该图显示ne、da、5-ht和5-iaa分离良好，没有检测到内源性物质的干扰。ne、da、5-ht和5-iaa的保留时间分别为2.195分钟，3.091分钟，7.642分钟和8.507分钟。

抑郁症的单胺缺乏假说认为抑郁症是由大脑中缺乏单胺类递，如ne，da和5-ht而引起的，抗抑郁药的治疗作用是通过增加单胺的水平来调节的。特别是5-ht，在抑郁症的病理生理学中起着至关重要的作用，大脑中的5-ht含量与快乐情绪密切相关，抑郁症患者脑中5-ht浓度降低。

图9显示了各组海马内单胺类神经递质水平。数据显示，与对照组相比，慢性应激能显著降低5-ht和ne水平(p<0.01；p<0.01)(慢性应激组)。高浓度白茶和氟西汀均能显著提高5-ht水平(p<0.05；p<0.01)。此外，低浓度白茶和高浓度白茶显著降低了5-hiaa与5-ht的比值(p<0.05；p<0.01)，5-hiaa是5-ht的代谢产物，该比值增高表明白茶通过降低5-ht的代谢增加了海马中5-ht的含量。低浓度白茶、高浓度白茶和氟西汀均没有提高ne水平。令人惊讶的是，慢性应激组的da水平明显高于对照组。本发明推测由于代偿机制，da代谢紊乱，因此，经过白茶和氟西汀治疗后，da水平恢复正常。

实施例15不同提取条件对白茶提取物的效果影响

分别选用75℃，80℃，85℃，90℃，95℃的温度梯度，以及乙醇、蒸馏水两种提取介质进行条件筛选，蒸煮时间为10min进行白茶提取，得到各组白茶提取物。

之后对按照实施例2完成cums处理的小鼠，分组进行鼻饲处理，均使用高浓度即40mg/kg的给药剂量。鼻饲一周后，按照实施例7的方法进行旷场测试，按照实施例4的方法进行糖水消耗测试，按照实施例10的方法进行嗅觉躲避测试，比较不同提取条件所得的白茶提取物的实验效果。如表1-3所示，结果可知85℃，蒸煮10min，选用水作为提取介质所得到的白茶提取物具有最优的技术效果。

表1为旷场测试结果

表2为糖水消耗量测试结果

表3为嗅觉躲避性测试结果

综上，本发明制备白茶提取物的方法操作简单，得到的白茶提取物采用鼻内给药的方式，可以提高cums(慢性不可预测性应激)方法建模的抑郁症样小鼠的蔗糖偏好，减少了其在强迫游泳测试和悬尾测试中的不动时间，并且改善了海马细胞内线粒体和突触的损伤，增加了突触数量。并且增加了小鼠海马中五羟色胺(5-ht)和脑源性神经营养因子(bdnf)的含量。本方法制备的白茶提取物对cums方法建模小鼠的嗅觉损伤有部分修复的效果，可以起到保护嗅觉的作用，而且较高的浓度的作用越明显。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

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<110>华东师范大学

<120>白茶提取物及其制备方法、给药方法和在抗抑郁中的应用

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