一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法及其应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法及其应用，具有显著抗菌作用。


背景技术：

2.感染性疾病属于常见的疾病，一般是由细菌、真菌感染或微生物感染导致,发病率相对较高，严重危及人体健康，甚至导致人死亡。例如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌可以引起胃肠道、皮肤、软组织感染，也可引起肺炎、骨髓炎、脑膜炎、败血症或心内膜炎等；白色念珠菌引起的侵染性真菌感染，是人体最难治疗的真菌感染性疾病，它能够在肾脏中持续存活和富集。目前，最有效的治疗药为两性霉素b，但其对肝肾的毒副作用非常大，而且容易引发病原菌的耐药性。
3.刺梨（rosa roxburghii tratt）是一种药食两用的蔷薇科植物，主要分布于我国西南部地区，传统医学主要以刺梨根、叶以及果实等入药，用于消食健脾、止泻、解暑等功效，对于治疗积食腹胀、高血脂、肠炎、高血压、夜盲症、维生素c缺乏症等疾病都有一定的效果，其中《本草纲目拾遗》、《黔书》等对其药理作用均有详实的记载，它同时也被《贵州省中药材、民族药材质量标准》收录。刺梨果富含vc、超氧化物歧化酶（sod）、黄酮、多糖、多种人体必需的氨基酸及微量元素，具有多种生理功能，被誉为“贵州山珍”。刺梨中的黄酮类成分尤其是芦丁，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有显著的抑制作用。
4.余甘子（phyllanthus emblica linn.）是大戟科、叶下珠属木本植物。又名余甘树、油甘子、庵摩勒、橄榄、久如拉（藏语）、麻项邦（傣语）等名。因其丰富的营养价值及药用价值，成为联合国卫生组织指定在全球范围内推广种植的三种保健植物之一。余甘子果实粗提物抑菌活性研究证实，提取物对黑根霉、黑曲霉和青霉菌没有抑菌活性，但对细菌中的嗜热脂肪芽孢杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌活性较强，并能明显促进伤口愈合。
5.柠檬（学名：citrus limon (l.) burm. f.），为双子叶植物纲芸香科柑橘属植物，柠檬又称柠果、洋柠檬、益母果等。柠檬富含维生素c，能化痰止咳，生津健胃。用于支气管炎，百日咳，食欲不振，维生素缺乏，中暑烦渴等症状，它是"坏血病"的克星，并且对于人体发挥的作用如同天然抗生素，具有抗菌消炎、增强人体免疫力等多种功效。
6.目前市场上针对上述症状的药酒类较多，但多通过中药泡制而成，然而泡制的方式，若使用低度数酒基对原料中的成分提取率有限，浪费较严重；而使用高度数酒基不利于病人或亚健康人群服用，局限性较大。


技术实现要素：

7.本发明提供一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法及其应用，通过发酵使原料中的成分最大化转化为人体易吸收的可溶性物质，再通过绿色无污染的纯化方式富集纯化，得到总黄酮物质；并且发酵酒度数较低，利于更广泛的人群服用。在使用时，具有一定酒精
含量更利于组织的快速渗透和吸收，使有效成分直达病灶，更好地发挥抗菌作用。
8.鉴于此，本发明提出一种操作简单、提取纯度高、提取效果稳定且安全无污染的一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法：(1)发酵：刺梨5-30份、余甘子5-30份、柠檬5-30份、椰子肉1-10份、人参1-5份、天麻1-5份、灵芝1-10份、酵母菌1-15份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵300天以上；(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液50℃以下减压浓缩得到浓缩液；(3)富集：将浓缩液用大孔吸附树脂吸附，然后用水或质量浓度为1-15％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为50-100％的乙醇洗脱至洗脱液不含总黄酮成分；(4)精制：将步骤(3)得到的50-100％的乙醇洗脱液，经50℃以下减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总黄酮。
9.本发明公开一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，通过采用发酵，并设计其提取、富集和精制的工艺步骤和参数，获得彝族传统发酵药总黄酮的最佳制备工艺，有效得到具有显著药理活性的彝族传统发酵药总黄酮，从而实现有效利用和开发资源，将彝族传统发酵药总黄酮作为有效成份，运用于抗菌的治疗药物中，以期为临床提供一种副作用小、不良反应发生率低，且疗效确切，可长期服用的抗菌的现代黎药制剂。该治疗药物的剂型可以为胶囊 (软胶囊)、颗粒剂(干混悬剂)、片剂(分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片)、溶液剂(糖浆)、丸剂(浓缩丸、滴丸、微丸)或注射剂型。
具体实施方式
10.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
11.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
12.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
13.实施例1-一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，包括如下步骤：(1) 发酵：刺梨30份、余甘子25份、柠檬20份、椰子肉5份、人参1份、天麻2份、灵芝2份、酵母菌5份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵300天；(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液50℃减压浓缩得到浓缩液；(3)富集：将浓缩液用d101型大孔吸附树脂吸附，然后用质量浓度为15％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为50％的乙醇洗脱至洗脱液不含总黄酮成分；(4)精制：将步骤(3)得到的50％的乙醇洗脱液，经50℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总黄酮。
14.实施例2-一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，包括如下步骤：(1) 发酵：刺梨20份、余甘子30份、柠檬15份、椰子肉5份、人参2份、天麻1份、灵芝5份、酵母菌2份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵450天；(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液50℃减压浓缩得到浓缩液；
(3)富集：将浓缩液用hp2o型大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为95％的乙醇洗脱至洗脱液不含总黄酮成分；(4)精制：将步骤(3)得到的95％的乙醇洗脱液，经50℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总黄酮。
15.实施例3-一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，包括如下步骤：(1) 发酵：刺梨25份、余甘子15份、柠檬25份、椰子肉6份、人参3份、天麻3份、灵芝2份、酵母菌10份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵500天；(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液40℃减压浓缩得到浓缩液；(3)富集：将浓缩液用d201型大孔吸附树脂吸附，然后用质量浓度为10％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为75％的乙醇洗脱至洗脱液不含总黄酮成分；(4)精制：将步骤(3)得到的75％的乙醇洗脱液，经40℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总黄酮。
16.实施例4-一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，包括如下步骤：(1) 发酵：刺梨10份、余甘子30份、柠檬5份、椰子肉8份、人参5份、天麻5份、灵芝10份、酵母菌1份，清洗晾干后，破碎不去皮放入避光容器中，自然温度发酵600天；(2)提取：取上述发酵液静置，过滤，并将滤液35℃减压浓缩得到浓缩液；(3)富集：将浓缩液用大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为80％的乙醇洗脱至洗脱液不含总黄酮成分；(4)精制：将步骤(3)得到的80％的乙醇洗脱液，经35℃减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至聚酰胺色谱柱，用25～75％乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％乙醇溶液洗脱四个柱体积，合并洗脱液，浓缩至无醇味或浓缩至干，即得彝族传统发酵药总黄酮。
17.对比例1-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，仅改变步骤(1)中的自然温度发酵150天，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总黄酮。
18.对比例2-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，仅改变步骤(2)中的将滤液65℃减压浓缩得到浓缩液，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总黄酮。
19.对比例3-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，仅改变步骤(3)中的用质量浓度为20％的乙醇洗脱至洗脱液无色，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总黄酮。
20.对比例4-依据实施例4的一种彝族传统发酵药总黄酮的制备方法，仅改变步骤(3)中的再用质量浓度为40％的乙醇洗脱至洗脱液不含总黄酮成分，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得一种彝族传统发酵药总黄酮。
21.由上表可以看出，由实施例1～4制备获得的总黄酮含量均≥65％，由此看出由本发明的制备方法制得的一种彝族传统发酵药总黄酮的提取纯度高，且提取的效果稳定，且实施1～4的一种彝族传统发酵药总黄酮的提取纯度明显高于对比例1～4，对比例1中降低了发酵天数、对比例2中升高了减压浓缩温度、对比例3中提高了前期洗脱杂质用洗脱液乙醇的质量浓度和对比例4中降低了总黄酮洗脱液乙醇的质量浓度，均影响了彝族传统发酵药总黄酮的提取纯度。
22.彝族传统发酵药总黄酮体外抗菌试验(1)平板的制备：指示菌平板分上下两层。首先加入15ml琼脂培养基作为下层培养基，完全凝固后轻轻放置6只牛津杯，然后加入15ml相应培养基作为上层培养基。待上层培养基完全凝固后，取出牛津杯；挑取新鲜培养的指示菌株，将菌悬液浓度调至0 .5mcfarland并均匀涂布在平板上，放置20～30min至平板表面无明显菌液，备用；(2)抗菌实验和结果：将由实施例1-4和对比例1-4制备获得彝族传统发酵药总黄酮样品以无菌水或dmso稀释至10mg/ml后，离心取100μl加入指示菌平板的孔内，做为抗菌实验孔；向孔中加入100μl新鲜培养基做为阴性对照孔，阿莫西林溶液做为阳性对照。放入4℃冰箱扩散3 h后，置于37℃或28℃培养24或48h，观测有无抗菌圈，用游标卡尺测量抗菌圈直径，用抗菌圈外径d(cm)表示抗菌作用的强弱。
23.表2:彝族传统发酵药总黄酮的抗菌试验从以上抗菌试验结果表明：高浓度的彝族传统发酵药总黄酮对金黄色葡萄球、大肠杆菌和白色念珠球菌具有较强的抑制作用，其抑制效果甚至与阳性对照阿莫西林相当。彝族传统发酵药总黄酮纯度降低后，抗菌活性也随之降低。
24.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。