一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是一种包含了多种血管再生属性的干细胞的注射液及其制备方法。

背景技术：

血管病变所致的缺血性疾病如：冠心病、脑梗塞、肢体缺血性坏死，乃至眼缺血性失明…等，迄今为止，一直是世界死亡、致残原因之首。现代医学以药物、介入、手术、器官移植均未能根本改善其预后。21世纪干细胞再生医学虽带来了新机，但种子细胞再生血管的特异性、功能性、安全性大大制约了干细胞再生血管理念的实现。

目前，具有全分化潜能的胚胎干细胞(esc)、诱导型多能干细胞(ips)，虽可再生血管，但esc涉及伦理及致畸胎瘤，ips涉及致肿瘤风险，均不能用于临床。成体干细胞包括不同来源的间充质干细胞仅可通过旁/自分泌潜能有限地刺激血管再生。因为目前的研究发现，任何一种成体细胞如cd133、cd34，间充质干细胞等均无法再生形成具有血液灌注功能的血管。

相关研究发现，动脉外膜是一个储存血管前体细胞巢(niche)。动脉外膜周细胞(pericytes)是血管发生、发育、再生、稳定血管结构、调控血流、及调节局部免疫功能的关键细胞；动脉外膜flk-1+细胞(血管内皮生长因子受体阳性细胞)是血管及心肌前体细胞，其直接参与及调控血管发生、再生；华通胶源间充质干细胞(wjmscs)具有促血管再生的旁/自分泌功能，其分泌多种细胞因子如血管内皮生长因子、成纤维生长因子、肝细胞生长因子…等，并直接参与构建血管再生基质成分。

2018年，西班牙dr.alvino首次应用冠心病搭桥患者余下的大隐静脉分离培养出血管外膜周细胞，并移植到猪心梗模型上，增加了血管及心肌灌注。但到目前为止，国际上仅提出了利用病人血管作为提取周细胞的来源。但很显然，从病人血管外膜取材非常困难、有创，难以推广。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法，三种血管再生属性干细胞分别为人脐带动脉外膜周细胞(apc)、人脐带动脉外膜flk-1+细胞和华通胶间充质干细胞(wjmscs)，其中apc,flk-1+细胞两种细胞由新生儿遗弃的脐动脉外膜中提取而来，为血管再生直接提供特有的两种前体细胞；wjmscs来自脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织，用于补充、更新及构成新生血管的细胞外基质成分，进一步提供血管再生信号系统调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境。

本发明的注射液可促进具有传送血液功能的小动脉/微血管，不仅实现了胚胎干细胞、诱导型多能干细胞等才能达到的再生血管功能，而且避开了esc，ips难以应用于临床的缺陷。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一方面，本发明提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，其包含：华通胶间充质干细胞wjmscs、人脐带动脉外膜周细胞apc和人脐带动脉外膜flk-1+细胞。

根据本发明较佳实施例，所述注射液还含有生理盐水，生理盐水为注射液的溶剂。

根据本发明较佳实施例，所述注射液中，人脐带动脉外膜周细胞apc、人脐带动脉外膜flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞wjmscs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配。

优选地，人脐带动脉外膜周细胞apc、人脐带动脉外膜flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞wjmscs三者按细胞数量比为1:50:100进行混配。

根据本发明较佳实施例，所述注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2％～0.25％。

根据本发明较佳实施例，所述注射液的规格为2ml/管，每管中细胞总数量为(1.5～2.5)×10⁷。

另一方面，本发明提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液的制备方法，其包含如下步骤：

s1:人脐带动脉外膜flk-1+细胞的制备；

s2:人脐带动脉外膜周细胞apc的制备；

s3:华通胶源间充质干细胞wjmscs的提取与培养；

s4:将人脐带动脉外膜周细胞apc、人脐带动脉外膜flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞wjmscs按比例混合，用注射用水或生理盐水配制成注射液。

需要说明的是，步骤s1-s3的顺序并不限制，只要完成人脐带动脉外膜flk-1+细胞、周细胞apc、华通胶间充质干细胞wjmscs的制备即可。

根据本发明较佳实施例，其中：步骤s4中，人脐带动脉外膜周细胞apc、人脐带动脉外膜flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞wjmscs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配，优选是按1:50:100混配。

根据本发明较佳实施例，其中：步骤s4中，取经低氧培养的第二代或第三代人脐带动脉外膜周细胞apc、人脐带动脉外膜flk-1+细胞、wjmscs分别加入生理盐水，在(100-200)g离心力离心洗涤细胞，弃上清，将细胞洗涤2-4遍，把三种细胞分别用生理盐水配成每毫升(1.5-2.5)×10⁷浓度的细胞悬液，再按预定三种细胞数量比混合三种细胞悬液，用生理盐水补充至预定注射液规格；密封，即时使用，或4-8℃下保存，12小时内使用。

根据本发明较佳实施例，其中；每管中的细胞总数量为(1.5-2.5)×10⁷。通常在细胞使用时，按照人的体重计算，60公斤使用6×10⁷的细胞数量，每管2×10⁷细胞数量恰可取用三管，且根据体重的增减使用细胞的数量易于增减。为了使用细胞时注射器抽取顺畅，约2×10⁷左右的细胞数量在2ml体积里属于恰当浓度，细胞浓度过高或过低均给使用和操作带来不便。

根据本发明较佳实施例，其中：步骤s4中，制备注射液时，还加入了人血白蛋白，人血白蛋白的质量浓度为0.2％～0.25％，制备成每2ml、含(1.5-2.5)×10⁷细胞数量为一个包装单位的注射液。加入人血白蛋白，作用之一是保证细胞间电荷平衡，防止细胞的聚集，其二是给生理盐水中的细胞提供适当的营养，维持细胞活性。

根据本发明较佳实施例，其中：步骤s1包括按顺序进行的如下步骤：人脐带动脉外膜flk-1+细胞的提取、纯化、3d培养、3d传代培养和低氧培养；其中，人脐带动脉外膜flk-1+细胞是从新生儿新鲜脐带中提取，用于配制注射液的人脐带动脉外膜flk-1+细胞为完成低氧培养后的flk-1+细胞。

根据本发明较佳实施例，其中：步骤s2包括按顺序进行的如下步骤：人脐带动脉外膜周细胞apc的提取、纯化、3d培养、3d传代培养和低氧培养；其中，人脐带动脉外膜周细胞apc是从新生儿新鲜脐带中提取，用于配制注射液的人脐带动脉外膜周细胞apc为完成低氧培养后的cd140和cd146双阳性细胞。

根据本发明较佳实施例，其中：步骤s3包括按顺序进行的如下步骤：wjmscs提取、纯化、3d培养、3d传代培养和低氧培养，其中wjmscs是新生儿新鲜脐带中提取，用于配制注射液的wjmscs是完成低氧培养后第二或第三代的wjmscs。

根据本发明较佳实施例，其中：步骤s1-s3还包括细胞冻存，即将完成了低氧培养的细胞，洗涤后，加入含8-12％dmso的完全细胞培养基中充分混匀，使细胞浓度为(1.5-2.5)×10⁷/ml，使用程序降温仪以0.5～1.5℃/min的速度降温，当温度降至-80℃时，将细胞放入液氮冻存。

(三)有益效果

本发明的有益效果包含以下几点：

(1)本发明的注射液中，三种血管再生属性的细胞均取材于新生儿遗弃的脐带，具体是从新生儿脐带内两条动脉中提取了脐带动脉外膜flk-1+细胞和脐带动脉外膜周细胞(apc)，这两种细胞为血管再生提供了直接的、特有的二种前体细胞；此外，本发明的注射液还包含了从新生儿脐带中提取的华通胶间充质干细胞(wjmscs，取材于脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织)，通过wjmscs补充、更新及构成的新生血管的细胞外基质成分，进一步形成了血管再生信号系统调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境：形成了以内皮细胞为血管内膜，周细胞apc则插入内皮细胞周围与其整合，并与flk-1+细胞分化的外层基底膜，及周细胞apc分化来源的平滑肌细胞共同形成了具有传送血液功能的小动脉/微血管。

(2)本发明的包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，不仅实现了胚胎干细胞、诱导型多能干细胞等才能达到的再生血管功能，而且避开了esc，ips难以应用于临床的缺陷。

(3)本发明首次选用包含三种血管再生属性的干细胞共同组成了细胞混合液，代替了只有esc、ips等全能及亚全能干细胞才能成功达到再生血管效应；克服了esc、ips不能用于临床的缺点。

(4)本发明首次突破了现有成体干细胞不能成功分化形成具有血液灌注功能小血管的障碍，避免了脐带动脉外膜周细胞自体静脉取材困难及有创性的问题；首次为血管分化前体细胞创建了以具有显著旁/自分泌功能的wjmscs为基础的血管分化微环境。

(5)本发明的注射液中apc、人脐带动脉外膜flk-1+细胞、wjmscs的数量比为1:40-60:80-120，主要是依据周细胞、flk-1+细胞、wjmscs在人体解剖学存在的位置特点及特殊的生理功能设计的配比。解剖学上周细胞apc是存在于内皮细胞周围，依据内皮屏障要求的严格程度，周细胞apc在不同的器官中其密度、形态、生物学等方面均有所不同，它与内皮细胞的比例也严格不同。例如，在骨骼肌中周细胞与内皮细胞比值为1:100，而在神经系统为1:3，在视网膜则为1:1。依据这一特点，本发明在实验中确定，当周细胞与flk-1+细胞二者比例在1:50左右时最为适用于再生多数种器官的血管。而wjmscs主要作用是为周细胞apc、flk-1+细胞分化/再生血管提供微环境，其细胞数量占比相对更大一些。故本发明将三种细胞按其生物功能需要以1:40-60:80-120的数量比混合，而更优以1:50:100的数量比混合制备注射液。

(6)本发明在脐带动脉外膜成功分离了高纯度周细胞、flk1+细胞，其细胞活力和分化潜能(0.81±0.07，mtt法od值)、增殖力(0.76±0.08，24h增殖力，mtt法od值)远远强于自体大隐静脉来源周细胞及骨髓来源flk-1+细胞。

据实验验证，本发明提供的血管再生混合干细胞注射液，在体外培养13天后成功形成了血管网；成功形成了以内皮细胞、周细胞、基底膜、平滑肌细胞共同组成的小血管。

(7)脐动脉外膜来源的apc、flk-1+细胞，及脐带华通胶来源的wjmscs，均仅表达hla-abc，不表达hla-ii类抗源hla-dr，且因协同刺激抗源cd80和cd86而表达hla-g，故为低免疫源性，排异反应小，可异体应用，可规模制备，可制成生物“注射剂药品”加以推广应用。

附图说明

图1为本发明提取纯化的脐带动脉外膜flk-1+细胞形态图片。

图2a-图2b为本发明提取纯化的脐带动脉外膜flk-1+细胞的特异标志表达。

图3为本发明提取纯化的脐带动脉外膜周细胞apc形态图片。

图4a-图4b为本发明提取纯化的脐带动脉外膜周细胞apc的特异标志表达。

图5为实施例1中apc、flk-1+、wjmscs三种细胞按1:50:100的细胞数量混合培养形成的血管网的倒置显微镜下图片。

图6为图5中血管内皮细胞标志cd31+细胞的特异表达。

图7为实施例1中apc、flk-1+、wjmscs三种细胞按1:50:100的细胞数量混合培养形成的血管网的倒置显微镜下图片。

图8为图7中血管内皮细胞标志cd31+细胞的特异表达。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明的整体技术方案构思为：

以新生儿遗弃的脐带为材料来源，提取从脐动脉外膜中提取flk-1+细胞和脐带动脉外膜周细胞apc，从脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织中提取华通胶来源的wjmscs，将这三种干细胞按比例混合，制成用于血管再生的注射剂，用于治疗缺血性心脏病、缺血性脑卒中、缺血性周围血管病等疾病。

为了制备上述包含三种血管再生属性的混合干细胞注射剂，需要预先制备三种干细胞，最后将三种干细胞分别分散于生理盐水中，配制得到注射液。三种干细胞的制备过程如下：

(一)脐带动脉外膜flk-1+细胞制备方法，其过程为：

①人脐带动脉外膜flk-1+细胞的提取：取新鲜脐带，pbs漂洗，洗去脐带残留的血液，沿脐动脉的走向剪开华通胶，沿脐带动脉腔将脐动脉纵向剪开，其断面处由外到内仅两层，分别为外膜和内膜，用带齿镊子在剪开的脐动脉断面处撕除内膜后，再撕取脐动脉的外膜，将撕取的脐动脉外膜放于无菌皿中剪成尽可能细小的碎沫状。

将剥离下来的脐动脉外膜碎片放入无菌细胞培养瓶中，在培养瓶中加入无血清细胞培养基，将培养瓶放入36-37℃、体积浓度为5％二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁后将细胞培养瓶中培养基更换为改良的内皮细胞(ec)生长培养基，以后每2-5天更换细胞培养基，显微镜下观察细胞生长情况，至细胞铺满瓶底的80％以上。

②flk-1+细胞纯化：

制成单细胞悬液：弃细胞培养瓶中的培养基，加入pbs冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.08％-0.15％的胰蛋白酶，并均匀地铺满瓶底，此为此为消化细胞步骤；1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩，加入细胞培养基中止消化，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。

洗涤细胞：将单细胞悬液移到离心管中，加入pbs混匀，(100-200)g离心10-20min，弃上清液，此为洗涤细胞，再重复前述步骤把细胞洗涤一遍。

分选：弃上清后，加入细胞分选缓冲液，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，加入一抗flk1、cd34抗体，每1×10⁶细胞加入0.25μg，4℃孵育30min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心4-10分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，调整细胞浓度为2×10⁷/ml；加入二抗包被的磁珠，每1×10⁶细胞加入5μl二抗包被的磁珠，8-15℃孵育10-15min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀得到细胞悬液，加入分选缓冲液的量为500μl/10⁸个细胞；预先用缓冲液冲洗分离柱，把柱子安装到磁场中，把细胞悬液加入到柱子中，用缓冲液冲洗柱子三遍，将柱子移开磁场到一新的离心管中，用少量缓冲液用力冲洗，把细胞冲洗到离心管中，收取到的细胞，即为flk-1+脐动脉外膜细胞。

③3d培养：将flk-1+细胞加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为(0.8-1)×10⁵细胞/ml，此为水凝胶细胞悬液，在新的培养瓶中加入水凝胶细胞悬液，使每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。

④3d传代培养：3d培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入36-37℃pbs10ml并放置于36-37℃水浴中，待水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，(100-200)g离心力离心10-20min，弃上清，再加入水凝胶混匀，加入培养瓶中，使每个培养瓶中细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入无血清培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二、三代flk-1+细胞进入下一工序。

⑤低氧培养：取第二代flk-1+细胞洗涤后，加入完全细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×10⁵/ml,取10ml加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)x10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养至60％融合时，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后进入下一工序。通过低氧培养，提高细胞耐性、活性和生存能力。

此时的flk-1+细胞即可用于配制注射液，如果暂不使用就将其冻存备用。

⑥细胞冻存：取第二代或第三代细胞，洗涤后，加入含8-12％dmso的完全细胞培养基中充分混匀，使细胞浓度为(1.5-2.5)×10⁷/ml，使用程序降温仪以0.5-1.5℃/min的速度降温，当温度降至-80℃时，将细胞放入液氮冻存，以备需要时进行复苏培养和使用。

(二)人脐带动脉外膜周细胞apc的制备方法，其过程为：

①人脐带动脉外膜周细胞apc的提取：取剖腹产新鲜脐带，pbs漂洗2-4遍，洗去脐带残留的血液，洗去残留的血液，将其剪成小段，沿脐带动脉的走向剪开脐带，用有齿镊夹取脐动脉一端，撕取脐带两根动脉外膜层，撕取脐带动脉外膜层后，放入无菌平皿中，用pbs漂洗2-4遍从脐带动脉撕下来的脐动脉外膜。

把撕取下来的脐带动脉外膜移到离心管中，加入比脐动脉内膜体积量多5倍的浓度为0.2％～0.25％的ii型胶原酶，把离心管密封，放置于水浴中，调整水浴的温度为36-37℃，此步骤为消化；消化60-90分钟后，加入与离心管中消化液同体积的无血清培养基，用移液管充分混匀，(100-200)g离心8-20min，弃上清液，此为洗涤细胞；重复上述洗涤步骤，把细胞再洗涤2-4遍，弃上清，加入无血清培养基充分混匀，形成细胞悬液，取一新的离心管，管口放置70μm过滤器，将细胞悬液通过过滤器将细胞过滤至新的离心管中。

计数过滤后的细胞悬液中的细胞，用无血清培养基把细胞悬液配成(0.8-1)×10⁵/ml的浓度，取10ml细胞悬液加入到细胞培养瓶中，再加入无血清培养基，使细胞培养瓶中的总液体量为15ml，细胞总数为(0.8-1)×10⁶，把细胞培养瓶放置于36-37℃，5％co2饱和湿度的细胞培养箱中，每天观察细胞，每三天半量更换细胞培养瓶中的培养基，待细胞融合度达90％以上，进入下一工序。

②周细胞apc纯化：

制成单细胞悬液：弃细胞培养瓶中的培养基，加入pbs冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.08％-0.15％的胰蛋白酶，并均匀地铺满瓶底，此为消化细胞的步骤；放置1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩成圆形时加入无血清培养基中止消化反应，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。

洗涤细胞：将单细胞悬液移到离心管中，加入pbs混匀，(100-200)g离心10-20min，弃上清液，此为洗涤细胞，再重复前述步骤把细胞洗涤一遍。

分选：弃上清后加入细胞分选缓冲液，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，加入一抗cd140、cd146抗体，每1×10⁶细胞加入0.25μg；4℃孵育30min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心5-10分钟洗涤；弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，加入二抗包被的磁珠，每1×10⁶细胞加入5μl二抗包被的磁珠，8-15℃孵育10-15min；加入20倍体积分选缓冲液，300g离心7分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，加入分选缓冲液的量为500μl/10⁸个细胞，预先用缓冲液冲洗分离柱，把柱子安装到磁场中，把细胞悬液加入到柱子中，用缓冲液冲洗柱子三遍，将柱子移开磁场到一新离心管中，用少量缓冲液用力冲洗，把细胞冲洗到离心管中，收取到的细胞，即为cd140+、cd146+脐动脉外膜周细胞(apc)。

③cd140+、cd146+细胞3d培养：将cd140+、cd146+细胞悬液(100-200)g离心10-20min，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的细胞培养瓶中加入10ml水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。

④cd140+、cd146+细胞3d传代培养：3d培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入36-37℃pbs10ml并放置于36-37℃水浴中，40-60min后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入离心管中，(100-200)g离心力离心10-20min，弃上清，再加入水凝胶混匀，加入到细胞培养瓶中，使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml无血清培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二、三代cd140和cd146双阳性细胞(认定是周细胞apc)进入下一工序。

⑤低氧培养：取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×10⁵，取10ml加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)×10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后进入下一工序。通过低氧培养，提高细胞耐性、活性和生存能力。

此时的cd140和cd146双阳性细胞(就是周细胞apc)即可用于配制注射液，如果暂不使用就将其冻存备用。

⑥细胞冻存：取第二代或第三代生长良好的细胞，洗涤后，加入含8-12％dmso的无血清细胞培养基中充分混匀，使细胞浓度为(1.5-2.5)×10⁷/ml,使用程序降温仪以0.5-1.5℃/min的速度降温，当温度降至-80℃时，将细胞放入液氮冻存，以备需要时进行复苏培养和使用。

(三)人脐带华通胶源间充质干细胞(wjmscs)提取与培养，其过程为：

①人脐带华通胶源间充质干细胞(wjmscs)提取：取人新鲜脐带,使用等渗的平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成小段，将每一段脐带沿脐静脉腔剪开，再使用等渗的平衡盐溶液洗去静脉腔中残留的血液，将脐带平铺于无菌皿中，剔除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织，剪切成1立方毫米及以下块状，再以等渗的平衡盐溶液清洗剪成块状的华通胶组织。

华通胶间充质干细胞提取培养：在培养瓶中加入10ml无血清培养基，将剪成块状的华通胶组织均匀放置于培养瓶中，将已放入华通胶组织的培养瓶放置于36-37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中进行培养，3天半量换液，5-6天可观察到有间充质干细胞贴壁生长，10-12天贴壁生长的华通胶间充质干细胞融合至80％以上，进入下一工序。

②纯化

制成单细胞悬液：弃细胞培养瓶中的培养基，加入pbs冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.08％-0.15％的胰蛋白酶，并均匀的铺满瓶底进行消化，1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩，加入3ml细胞培养基中止消化，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。

洗涤：将细胞悬液经过100μm筛网移到50ml离心管中，加入20mlpbs混匀，(100-200)g离心10min，弃上清液，此为洗涤细胞，可重复前述步骤把细胞洗涤一遍。

传代：加入无血清培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×10⁵/ml，将细胞悬液加入到细胞培养瓶中，使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，此步骤为传代，将传代细胞放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中扩增培养，每三天换液，待细胞融合至80-90％时再传代培养，以便进入下一工序(或即时用于配制注射液)。

③wjmscs的3d培养：将第二代wjmscs细胞悬液以(100-200)g离心10-20min，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为(0.8-1)×10⁵细胞/ml，此为水凝胶细胞悬液，在新的培养瓶中加入10ml水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。

④wjmscs的3d传代培养：3d培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入36-37℃pbs10ml并放置于36-37℃水浴中，40-70min后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入50ml离心管中，(100-200)g离心力离心10m-20in；弃上清，再加入水凝胶混匀，加入细胞培养瓶中，使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml无血清培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二、三代wjmscs进入下一工序。

⑤低氧培养：取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为(0.8-1)×10⁵，取10ml加入细胞培养瓶中，细胞的总数量为(0.8-1)×10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后进入下一工序。通过低氧培养，提高细胞耐性、活性和生存能力。

此时的细胞即可用于配制注射液，如果暂不使用就将其冻存备用。

⑥细胞冻存：取第二代或第三代细胞，洗涤后，加入含8-12％dmso的无血清细胞培养基中充分混匀，细胞浓度为(1.5-2.5)×10⁷/ml,使用程序降温仪以0.5-1.5℃/min的速度降温，当温度降至-80℃时，将细胞放入液氮冻存，以备需要时进行复苏培养和使用。

需要说明的是，上述(一)、(二)、(三)中，步骤⑥不是必须的步骤，用于制备注射液的细胞可来源于完成了步骤⑤低氧培养的细胞，也可以是经步骤⑥冻存后经复苏培养、低氧培养的细胞。细胞经过步骤⑤低氧培养后用于配制注射液，如果暂不使用就将其冻存备用。

(四)配制混合干细胞注射液，用于血管再生，具体步骤为：

取经缺(低)氧培养的3代apc、flk-1+细胞、wjmscs分别加入用生理盐水，在(100-200)g离心力离心5min-10min洗涤细胞，弃上清，将细胞洗涤2-4遍，把三种细胞分别用生理盐水配成每毫升(1.5-2.5)×10⁷浓度，把三种细胞按细胞数量配成如下的配比，apc：flk-1+细胞：wjmscs＝1:40-60:80-120，三种细胞配比悬液为血管再生干细胞混合注射液，注入无菌注射液药管中，每管中的细胞总数量为(1.5-2.5)×10⁷，用生理盐水补充至2ml。

由apc、flk-1+细胞、wjmscs三种细胞混合成的血管再生干细胞混合注射液经过安全性检测后，加入人血白蛋白，人血白蛋白的质量浓度为0.2％-0.25％，制备成每2ml人血白蛋白/生理盐水中含有(1.5-2.5)×10⁷细胞数量为一个包装单位的注射液；密封，即时使用，或4-8度保存，12小时内使用。

以下为本发明的具体实施例。

实施例1

本实施例的一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，其制备步骤如下：

s1按如下方法制备人脐带动脉外膜flk-1+细胞：

(s11)人脐带动脉外膜flk-1+细胞提取：

取剖腹产新鲜脐带，pbs漂洗三遍，洗去脐带残留的血液，沿脐动脉的走向剪开华通胶，用眼科剪沿脐动脉腔将脐动脉纵向剪开，其断面处由外到内仅两层是外膜、内膜，用有齿眼科镊在剪开的脐动脉断面处撕除内膜后，再撕取脐动脉的外膜，将撕取的脐动脉外膜放于无菌皿中剪成尽可能小的碎沫状。将剥离下来的脐动脉外膜碎片放入底面积是75平方厘米无菌细胞培养瓶中，在培养瓶中加入15ml无血清细胞培养基，将培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁后将细胞培养瓶中培养基更换为改良的内皮细胞(ec)生长培养基，以后每3天更换细胞培养基，显微镜下观察细胞生长情况，至细胞铺满瓶底80％后，继续以下处理：

(s12)flk-1+细胞纯化：弃细胞培养瓶中的培养基，加入3mlpbs冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.125％的胰蛋白酶3ml，并均匀的铺满瓶底以进行细胞细化，1分钟后显微镜下可见细胞收缩，加入3ml细胞培养基中止消化，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。将细胞悬液移到50ml离心管中，加入20mlpbs混匀，(100-200)g离心10min，弃上清液，此为洗涤细胞，再重复上述步骤把细胞洗涤一遍，弃上清后，加入细胞分选缓冲液，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，加入一抗flk-1、cd34抗体，每1×10⁶细胞加入0.25μg抗体，4℃孵育30min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心7分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，加入二抗包被的磁珠，每1×10⁶细胞加入5μl二抗包被的磁珠，8-15℃孵育10-15min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心7分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，加入缓冲液的量为500μl/10⁸细胞，预先用500μl缓冲液冲洗分离柱，把柱子安装到磁场中，把细胞悬液加入到柱子中，用500μl缓冲液冲洗柱子3遍，将柱子移开磁场到一新50ml离心管中，用1ml的缓冲液用力冲洗，把细胞冲洗到离心管中，收取到的细胞，即为flk-1+细胞。

在电子显微镜下观察flk-1+细胞，其形态如图1所示。

采用流式细胞分析仪对人脐带动脉外膜flk-1+细胞进行检测，如图2a-2b所示为制得的人脐带动脉外膜flk-1+细胞特异标志表达。其中，图2a横坐标fsc-a表示向前角散射光波状曲线的面积(向前角散射光脉冲信号强度)，反映了细胞大小；纵坐标ssc-a为侧向角散射光波状曲线的面积(侧向角散射光脉冲信号强度)，反映了细胞粒度及细胞内相对复杂性。其图2b的横坐标为采用荧光素apc(allophycocyanin)荧光标记所采集的荧光信号强度，纵坐标为细胞计数。由图1及图2a-图2b的特异标志表达确定已分离纯化得flk-1+细胞。

(s13)flk-1+细胞3d培养：将flk-1+细胞加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升1×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的底面积是75cm²培养瓶中加入10ml水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。

(s14)flk-1+细胞3d传代培养：待细胞3d培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入37℃pbs10ml并放置于37℃水浴中，1小时后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入50ml离心管中，150g离心力离心10min，弃上清，再加入水凝胶混匀，加入底面积是75cm²培养瓶中，使每瓶中细胞数量为1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml无血清培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二代flk-1+细胞进入下一工序。

(s15)低氧培养：取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为1×10⁵，取10ml加入75cm²细胞培养瓶中，细胞的总数量为1×10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后备用。

s2：按如下方法制备人脐带动脉外膜周细胞apc：

(s21)人脐带动脉外膜周细胞的提取：取剖腹产新鲜脐带，pbs漂洗三遍，洗去脐带残留的血液，洗去残留的血液，将其剪成3-4cm的小段,沿脐带动脉的走向剪开脐带采用蚊式钳夹取脐动脉一端，撕取脐带两根动脉外膜层，撕取脐带动脉外膜层后，放入无菌平皿中，用pbs漂洗2-3遍从脐带动脉撕下来的脐动脉外膜。

把撕取下来的脐带动脉外膜移到50ml离心管中，加入比脐动脉内膜体积量多5倍的浓度为0.2％的ii型胶原酶，把离心管密封，放置于水浴中，调整水浴的温度为37℃，此步骤为消化，消化90分钟后，加入与离心管中消化液同体积的无血清培养基，用移液管充分混匀，150g离心10min，弃上清液，此为洗涤细胞，重复上述洗涤步骤，把细胞再洗涤2遍，弃上清，加入无血清培养基充分混匀，形成细胞悬液，取一新的离心管，管口放置70μm过滤器，将细胞悬液通过过滤器将细胞过滤至新的离心管中。

过滤后的细胞悬液计数细胞，用无血清培养基把细胞悬液配成1×10⁵/ml的浓度，取10ml细胞悬液加入到底面积是75cm²细胞培养瓶中，再加入5ml无血清培养基，使细胞培养瓶中的总液体量为15ml，细胞总数为1×10⁶，把细胞培养瓶放置于37℃，5％co2饱和湿度的细胞培养箱中，每天观察细胞，每三天半量更换细胞培养瓶中的培养基，待细胞融合度达90％时，继续以下处理。

(s22)脐带动脉外膜周细胞纯化：弃培养瓶中的液体，加入pbs3ml铺满瓶底清洗，弃清洗液，在培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶3ml，并铺满瓶底以进行细胞消化，消化放置1-2分钟，观察细胞收缩成圆形时加入无血清培养基中止消化反应，移液管吹打细胞悬液和瓶底混匀细胞，将细胞悬液移入50ml离心管中制成单细胞悬浮液。用150g离心5min，弃上清液，此为洗涤细胞，再加入pbs20ml，混匀细胞，重复上述洗涤步骤再洗涤一遍。弃上清后加入细胞分选缓冲液，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，加入一抗cd140、cd146抗体，每1×10⁶细胞加入0.25μg，4℃孵育30min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心7分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，加入二抗包被的磁珠，每1×10⁶细胞加入5μl二抗包被的磁珠，8-15℃孵育10-15min，加入20倍体积分选缓冲液，300g离心7分钟洗涤，弃上清，加入分选缓冲液混匀细胞，加入缓冲液的量为500μl/10⁸，预先用500μl缓冲液冲洗分离柱，把柱子安装到磁场中，把细胞悬液加入到柱子中，用500μl缓冲液冲洗柱子三遍，将柱子移开磁场到一新50ml离心管中，用1ml的缓冲液用力冲洗，把细胞冲洗到离心管中，收取到的细胞，即为cd140+、cd146+脐动脉外膜周细胞(apc)。

(s23)cd140+、cd146+细胞3d培养：将cd140+、cd146+细胞悬液150g离心10min，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升1×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的底面积是75cm²培养瓶中加入10ml水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。

(s24)cd140+、cd146+细胞3d传代培养：待细胞3d培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入37℃pbs10ml并放置于37℃水浴中，1小时后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入50ml离心管中，150g离心力离心10min，弃上清，再加入水凝胶混匀，加入底面积是75cm²培养瓶中，使每瓶中细胞数量为1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml无血清培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况，取第二代生长良好的cd140+、cd146+(cd140和cd146双阳性)细胞进入下一工序。

在倒置显微镜下观察人脐动脉外膜周细胞apc，形态如图3所示。

采用流式细胞分析仪对周细胞表面标志物cd140、cd146进行检测，如图4a-4b所示为制得的人脐动脉外膜周细胞特异标志物cd140和cd146表达。cd146采用绿色荧光fitc标记，cd140采用pe红色标记。其中图4a的横坐标fitc-a为采用荧光素fitc荧光标记所采集的荧光信号强度，即cd146阳性的人脐动脉外膜周细胞的荧光信号强度；纵坐标pe-a为采用荧光素pe荧光标记所采集的荧光信号强度，即cd140阳性的人脐动脉外膜周细胞的荧光信号强度。图4b的横坐标为采用荧光素pe荧光标记所采集的荧光信号强度，纵坐标为细胞计数。由图3及图4a-图4b的特异标志表达可确定已分离纯化得人脐动脉外膜周细胞cd140+、cd146+(cd140和cd146双阳性细胞)。

(s25)：低氧培养：取第二代细胞洗涤后加入完全细胞培养基，调整细胞浓度为1×10⁵，取10ml加入75cm²细胞培养瓶中，细胞的总数量为1×10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后备用。

s3:按如下方法制备脐带华通胶源间充质干细胞(wjmscs)

(s31)人脐带华通胶源间充质干细胞(wjmscs)的提取：取人新鲜脐带,使用等渗的平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成3厘米的小段，将每一段脐带沿脐静脉腔剪开，再使用等渗的平衡盐溶液洗去静脉腔中残留的血液，将脐带平铺于无菌皿中，剔除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织，并用眼科剪剪切成1立方毫米及以下块状，再以等渗的平衡盐溶液清洗剪成块状的华通胶组织。

(s32)纯化：在底面积为75平方厘米的培养瓶中加入10ml无血清培养基，将剪成块状的华通胶组织均匀放置于培养瓶中，将已放入华通胶组织的培养瓶放置于37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中进行培养，3天半量换液，5-6天可观察到有间充质干细胞贴壁生长，10-12天贴壁生长的华通胶间充质干细胞融合至80％。弃细胞培养瓶中的培养基，加入3mlpbs冲洗瓶底，弃冲洗液，加入浓度为0.125％的胰蛋白酶3ml，并均匀的铺满瓶底以进行细胞消化，1分钟后显微镜下可见细胞收缩，加入3ml细胞培养基中止消化，用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀，把细胞制成单细胞悬液。将细胞悬液经过100μm筛网移到50ml离心管中，加入20mlpbs混匀，150g离心10min，弃上清液，此为洗涤细胞，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，将细胞悬液加入底面积是75cm²培养瓶中，使每瓶中细胞数量为1×10⁶细胞，此步骤为传代，将传代细胞放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中扩增培养，每三天换液，待细胞融合至80-90％时再传代培养进入下一工序。

(s33)wjmscs3d培养：将第二代wjmscs细胞悬液以150g离心10min，弃上清液，加入水凝胶培养基混匀，使细胞浓度为每毫升1×10⁵细胞，此为水凝胶细胞悬液，在新的底面积是75cm²培养瓶中加入10ml水凝胶细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养，每天观察细胞生长情况。

(s34)wjmscs的3d传代培养：待细胞3d培养6-7天后，细胞融合(70-80)％时加入37℃pbs10ml并放置于37℃水浴中，1小时后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入50ml离心管中，150g离心力离心10min，弃上清，再加入水凝胶混匀，加入底面积是75cm²培养瓶中，使每瓶中细胞数量为1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml无血清培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况。取第二代wjmscs进入下一工序。

(s35)低氧培养，取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基，调整细胞浓度为1×10⁵，取10ml加入75cm²细胞培养瓶中，细胞的总数量为1×10⁶，先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁培养60％融合，把细胞培养瓶放入氧气浓度为5％、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时，洗涤后备用。

s4注射液制备：将脐带动脉外膜来源的flk-1+细胞、apc及wjmscs混合制备成血管再生注射液；

取经低氧培养的第三代apc、flk-1+细胞、wjmscs分别加入生理盐水，150g离心力离心5min洗涤细胞，弃上清，将细胞洗涤3遍，把三种细胞分别用生理盐水配成2×10⁷浓度，把三种细胞按细胞数量配成如下的配比，apc：flk-1+细胞：wjmscs＝1:50:100，三种细胞配比悬液为血管再生干细胞混合注射液，放入2ml无菌瓶中，每瓶中的细胞总数量为2×10⁷，注射液总体积用生理盐水补充至2ml。

由apc、flk-1+细胞、wjmscs三种细胞混合成的血管再生干细胞混合注射液经过安全性检测后，加入人血白蛋白，人血白蛋白的浓度为0.2％，制备成每2ml人血白蛋白/生理盐水中含有2×10⁷细胞数量为一个包装单位的注射液。

混合细胞体外培养血管成型实验

将上述实验提取分离及低氧培养的apc、flk-1+细胞、wjmscs三种细胞按照1:50:100的数量比混合制成的注射液，用150g离心力离心5min，弃上清，加入水凝胶培养基混匀，使按比例配成的混合细胞浓度为每毫升1×10⁵细胞，制备成水凝胶混合细胞悬液，在底面积是75cm²培养瓶中加入10ml水凝胶混合细胞悬液，每个培养瓶中接种细胞数量为1×10⁶细胞，在培养瓶中加入交联剂0.1ml，促进水凝胶形成胶胨状，在培养瓶中水凝胶液面上加入5ml完全细胞培养基，将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养。培养13天后，采用倒置显微镜观察，如图5、图7所示，可在培养瓶中观察到血管网的形成。

细胞融合(70-80)％时加入37℃pbs10ml并放置于37℃水浴中，1小时后水凝胶分解形成细胞悬液，用移液器抽吸并混匀细胞悬液，将悬液移入50ml离心管中，150g离心力离心10min，弃上清，再加入pbs混匀，150g离心力离心10min，洗涤2遍，用pbs调整细胞浓度为2×10⁷细胞/ml，分别取0.5ml放置于2个离心管中，其中一管加入cd31-pe抗体20μl，孵育20min，pbs洗涤2遍，此为检测管，另一管加入20μl生理盐水与检测管一致处理，为空白对照管，经流式细胞仪进行流式检测，记录标记cd31-pe细胞百分比，如图6、图8所示流式检测分析结果显示代表血管内皮标志的cd31细胞高表达。

由此可见，本发明的包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，确实具有再生血管功能，突破了现有成体干细胞不能成功分化形成具有血液灌注功能小血管的障碍，将为当今世界范围发病率、死亡率最高的包括缺血性心脏病、缺血性脑卒中、缺血性周围血管病等在内的缺血性疾病的治疗带来一个重大进展。