一种可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法及其应用与流程

本发明属于脐带血处理技术领域，特别涉及一种可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法及其应用。

背景技术：

长久以来，脐带血被认为是生物废物直接丢弃，随着科学研究的不断进步，人们才渐渐意识到脐带血的重要性。1988年，法国开展了世界上首例同胞脐带血移植治疗范可尼贫血，由此人们开始认识到脐带血的医用价值，脐带血逐渐发展成为继骨髓和外周血后的第三大造血干细胞来源。脐带血富含各种干细胞和各种细胞因子，目前已被广泛开展应用于再生医疗、神经修复的临床试验中。

早产是导致婴儿死亡的第一位死因。在中国，早产儿数每年约为110万，占了全球早产儿数的10％。早产儿严重并发症，包括支气管支气管肺发育不良、坏死性小肠结肠炎、脑室旁白质软化、早产儿视网膜病变、败血症、呼吸机相关肺炎等尚无有效治疗方法，预防是早产儿并发症的最佳治疗。现有针对早产儿并发症的治疗方法为单器官对症治疗，未能解决多器官前体细胞缺乏、损伤后修复能力降低、器官功能发育障碍的根本问题。脐带血中含有大量的不同类型的白细胞和干细胞，这些有核细胞不仅具有自我更新多向分化潜能，而且能够分泌多种生物活性成分，包括生长因子、抗炎因子、修复因子及抗凋亡因子，具有抵抗微生物、促进组织修复、补充器官前体细胞及抗炎的能力。脐血具有免疫源性低、副作用少、安全性高的优点，具有广阔的应用前景。

虽然国内外不同脐血库先后报道多种脐带血制备、冻存、复苏的方法，但由于早产儿的特殊性，针对早产儿自体脐带血的一整套安全可靠的处理技术的制定，对于回输自体脐带血预防早产儿并发症尤为重要。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法。

本发明的再一目的在于提供上述可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法，包括如下步骤：

(1)自体脐带血采集后保存及运输至脐带血造血干细胞库，每份脐带血由两人复核信息，热合去除采血针及多余管路后，血袋称重并计算脐带血量，每份脐带血编码其唯一的编号，然后对血袋表面进行消毒；

(2)对脐带血的有核细胞进行计数，测算总有核细胞数；

(3)对脐带血进行病毒检测；

(4)在无菌操作室中，将血袋先进行倒置离心，去掉红细胞，然后将血袋正置离心，分离出血浆，获得自体脐带血有核细胞；同时对制备的有核细胞进行有核细胞活性和cd34+细胞含量分析。

步骤(1)中所述的保存是指在医院储存柜中进行保存。

步骤(1)中所述的自体脐带血采集后保存的条件为-2～8℃。

步骤(1)中将所述的自体脐带血运输至脐带血造血干细胞库的工具为血液运输箱，运输时血液运输箱内的温度为4～15℃。

步骤(2)中所述的脐带血优选为全血血样。

步骤(2)中所述的脐带血的取样量优选为1ml。

步骤(2)中所述的计数的方法为荧光染色计数法。

步骤(2)中所述的计数的工具优选为五分类血球计数仪。

步骤(2)中所述的总有核细胞数的计算公式为：其中，血液密度为1.05g/ml。

步骤(3)中所述的病毒检测方法为血清学抗原抗体反应法。

步骤(3)中所述的脐带血的取样量优选为5ml。

步骤(3)中所述的病毒检测优选包括对脐血乙肝表面抗原(hbsag)、丙肝病毒抗体(hcv-ab)、艾滋病毒抗体(hiv-ab)、巨细胞病毒抗体(tp-ab)和梅毒螺旋体抗体(cmv-igm)五项病毒指标进行检测。

步骤(4)中所述的无菌操作室为万级无菌操作室；所述的脐带血血袋经过传送窗进入万级无菌操作室。

步骤(4)中所述的血袋进行离心前需要将脐带血转移至三联塑料血袋中。

步骤(4)中所述的倒置离心的条件为4～15℃，离心力50g，时间为8min。

步骤(4)中所述的倒置离心通过低温离心机进行。

步骤(4)中所述的血袋进行正置离心前需要进行闭合血夹的操作。

步骤(4)中所述的正置离心的条件为4～15℃，离心力400g，时间为10min。

步骤(4)中所述的正置离心通过低温离心机进行。

步骤(4)中所述的有核细胞活性是根据7-aad可使死细胞染色的原理通过检测脐带血中活细胞占有核细胞的含量得到。

步骤(4)中所述的cd34+细胞含量的检测方法为：根据ishage标准，利用cd45、cd34+单克隆抗体(cd45是有核细胞的特异性标志物，cd34+是造血干祖细胞的特异性标志物)来对脐带血进行检测。利用流式细胞仪对制备的脐带血样品进行检测，根据造血干祖细胞的4个特征(cd34+阳性，cd45弱阳性，低ssc，fsc与淋巴细胞相似)圈选出造血干祖细胞占有核细胞的含量，即得到cd34+细胞含量。

所述的可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法在预防早产儿并发症中的应用，是将通过所述的可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法得到的自体脐带血有核细胞回输给早产儿来预防早产儿并发症。

所述的自体脐带血有核细胞需在脐带血采集后24小时内，由医院医护人员对早产儿执行回输治疗操作。

所述的自体脐带血有核细胞回输给早产儿前需保存在4～15℃的血液运输箱中。

所述的早产儿并发症包括血管内溶血、支气管肺发育不良、坏死性肠炎、早产儿视网膜病、白血病、呼吸机相关性肺炎、缺血缺氧性脑病、贫血症和呼吸窘迫综合征程度中的至少一种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明从早产儿中取得新鲜自体脐带血后，在固定的保存和运输条件下，送到脐带血库进行处理，处理方法仅为对自体脐带血进行血袋表面消毒、测算总有核细胞数、检测病毒五项、物理离心方法制备有核细胞。未对脐带血添加冷冻保护剂dmso，减少了冷冻保护剂对人体肝脏的毒性；未对脐带血添加羟乙基淀粉，不会因添加物对早产儿产生不良的副作用。本处理技术从采集到运输到制备到最后脐带血回输，经历的时间必须控制在24h内，保证脐带血中干细胞的活性。制备后的脐带血有核细胞保证质量安全可靠，同时脐带血干细胞的活性能满足新生儿科用于预防早产儿并发症的临床需求。经临床数据验证，使用本技术制备的脐带血回输用于预防早产儿并发症，可明显减少早产儿并发症的发生数量，并大大缩短了对早产儿行机械通气和氧补充的时间。

(2)本发明所述的方法安全、省时、可重复性高、符合临床需求，为临床提供了一种安全可靠的，可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理技术。

(3)本发明所述的脐带血的保存、运输和制备为一个整体，仅在本发明所述的操作方法下，制备所得的脐带血是合法合规且脐带血安全、质量达标，适合用于早产儿自体回输预防并发症的脐带血。

附图说明

图1为血液运输箱实物图。

图2为自体脐带血有核细胞计数结果图。

图3为自体脐血中病毒五项指标结果图。

图4为自体脐带血有核细胞活率的结果图。

图5为常规对照组获得的常规自体脐带血有核细胞活率的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

脐带血采血袋(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司，含28ml血液保存液)，6％羟乙基淀粉(购自b.braun公司)，甲基纤维素培养基(购自stemcell公司)，rpmi-1640培养基(购自gibco公司)，单抗cd45-fitc、单抗cd34-pe、igg1-pe、7-aad和1％溶血素均购自bd公司，计数相关试剂均购自sysmex公司。低温离心机(refurbishedthermo/sorvallrc3bp+centrifuge，购自thermofisherscientific公司)，自动血液分析仪(xe-5000，购自希森美康生物科技(无锡)有限公司)，热合机(se250型，购自韩国森通公司)，超净工作台(sw-cj-2fd，购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，co2培养箱(购自forma公司)，倒置显微镜(ck40和ckx41，购自olympus公司)，流式细胞仪(facscalibur，购自bd公司)。

实施例1：一种可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法

一种可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理方法，包括如下步骤：

(1)自体脐带血采集后保存及运输至脐带血造血干细胞库

自体脐带血(来源于广东省)在手术室采集后摇匀，并立即保存在0～4℃冰箱中，待工作人员收集并装入4-15℃的血液运输箱中运输至脐带血造血干细胞库。每份脐带血由两人复核信息，热合去除采血针及多余管路后，血袋称重并计算脐带血量。每份脐带血编码其唯一的编号，然后对血袋表面进行消毒。

(2)自体脐带血总有核细胞数测算

脐带血取1ml全血血样，利用荧光染色方法用五分类血球计数仪对有核细胞进行计数，测算总有核细胞数。总有核细胞数计算的公式：其中，血液密度为1.05g/ml。

(3)自体脐带血有核细胞制备

自体脐带血采血袋经过传送窗进入万级无菌操作室，将脐血转移至三联塑料血袋，血袋倒置并通过低温离心机进行倒置离心，倒置离心的条件为4～15℃，离心力50g，时间为8min，去掉离心出来的红细胞；闭合血夹，血袋正置，通过低温离心机进行正置离心，正置离心的条件为4～15℃，离心力400g，时间为10min，分离出有核细胞与血浆后，用分浆夹排去多余血浆，获得有核细胞，结果如图2所示。取约0.5ml有核细胞血样用于有核细胞活性及cd34+细胞含量分析。

常规对照组：常规自体脐带血有核细胞的制备

脐血先取1ml全血血样用于计算制备前的有核细胞总数(全血tncs)。按照比例添加羟乙基淀粉后，置于摇床上孵育5～10min，在4～15℃，离心力为50g的条件下倒置离心8min；去红细胞后的脐血，在4～15℃，离心力为400g的条件下正置离心10min，去除多余血浆。浓缩后的脐血用注射器测量体积(浓缩血量)并转移至冷冻袋中，留取0.5ml血样用于计算冻前有核细胞总数(冻前tncs)，另留取0.5ml血样用于cfu-gm集落细胞培养及有核细胞活性、cd34+细胞含量分析。冷冻袋接上含有保护剂的注射器并夹在冰袋内，通过微量泵在15min内将保护剂添加到浓缩后脐带血并混匀。冷冻袋热合后，通过程序降温至-80℃后放置于液氮中保存。

(4)自体脐带血五项病毒指标检测

脐血制备过程中，留取脐带血约5ml，分离出血浆，采用酶联免疫吸附试验，根据乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)诊断试剂盒(购自北京万泰生物药业股份有限公司)、人丙肝抗体(hcv-ab)elisa试剂盒(购自北京万泰生物药业股份有限公司)、人类免疫缺陷病毒抗原抗体hiv-abelisa试剂盒(购自北京万泰生物药业股份有限公司)、梅毒螺旋体抗体(tp-ab)elisa检测试剂盒(购自北京万泰生物药业股份有限公司)和人巨细胞毒抗体igm(cmv-igm)elisa检测试剂盒(购自北京贝尔生物工程股份有限公司)说明书的操作步骤对hbsag、hcv-ab、hiv-ab、tp-ab、cmv-igm进行检测，结果如图3所示。

(5)制备后的自体脐带血有核细胞活率及cd34+细胞含量检测

采用流式细胞术对步骤(3)中获得的有核细胞进行细胞活率测定。每份标本准备2支试管，1管为对照管，1管为测试管。往对照管中依次加入单抗cd45-fitc5μl(购自bdbiosciences)、igg1-pe(cd34-pe阴性对照)5μl(购自bdbiosciences)，测试管依次加入单抗cd45-fitc5μl、单抗cd34-pe5μl(购自bdbiosciences)，加完后放入2℃～8℃冰箱内避光暂存。取出已加入cd45-fitc、cd34-pe和igg1-pe的试管架，往测试管中依次加入7-aad10μl。去红去浆的浓缩血样(即有核细胞血样)依次往对照管和测试管各加入100μl血量。涡旋振荡器上充分混匀，室温避光孵育16分钟。孵育完成后，分别往2个试管加入2.5ml1％溶血素并轻轻混匀，室温避光反应10～15分钟后500g离心力下室温离心3分钟，弃上清液并用纸巾控干管口。再分别用1.5mlpbs缓冲液(ph7.2±0.1，购自吉诺生物医药技术有限公司；下同)洗涤细胞、离心、去上清，最后各加0.5mlpbs缓冲液轻轻混匀，检查是否有凝块，则待上机样本制备完成。

流式细胞仪检测已标记好的样本，根据ishage标准，利用cd45、cd34+单克隆抗体(cd45是有核细胞的特异性标志物，cd34+是造血干祖细胞的特异性标志物)来对脐带血进行检测。根据造血干祖细胞的4个特征(cd34+阳性，cd45弱阳性，低ssc，fsc与淋巴细胞相似)圈选出造血干祖细胞占有核细胞的含量，即得到cd34+细胞含量。根据7-aad可使死细胞染色的原理来检测脐带血中活细胞占有核细胞的含量，即有核细胞活性。

按照上述同样方法，测定常规对照组的常规自体脐带血有核细胞活性。

(6)有核细胞的活率比较

结果显示，步骤(5)分离获得的有核细胞活率为96.74％，其代表性结果如图4显示，常规对照组获得的常规自体脐带血有核细胞活率为95.39％，其代表性结果如图5显示。结果表明，本发明可用于预防早产儿并发症的自体脐带血处理技术制得的脐带血有核细胞与常规制备后获得的自体脐带血有核细胞的活率接近，适合推广使用。

(7)自体脐带血有核细胞运输到医院并回输给早产儿

制备后的有核细胞保存在4～15℃的血液运输箱中运输至医院，自体脐带血有核细胞在脐带血采集后24小时内，由医院医护人员对早产儿执行回输治疗操作。早产儿并发症的监护与检测由医院进行，自体脐带血有核细胞回输预防早产儿并发症的数据见表1。

表1

从表1可以看出，使用本技术制备的脐带血回输用于预防早产儿并发症，可明显减少早产儿并发症的发生数量，并大大缩短了对早产儿行机械通气和氧补充的时间。

以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。